烟草β—1,3—葡聚糖酶cDNA克隆,大肠杆菌表达及植物表达载体的 …

用０．１５％乙烯利诱导烟草幼苗后,提取叶片总ＲＮＡ,并通过反转录及多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出β－１,３－葡聚糖酶基因的ｃＤＮＡ。将其克隆至载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ后,完成了此基因的全序列分析。测序结果表明：所克隆的ｃＤＮＡ除第１００８位碱基与所报道的不同外,其它序列完全一致。为制备抗血清,构建了此基因的大肠杆菌表达载体,并在表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙＳ中得到表达,进行了Ｗ     

人血小板生成素（hTPO）的cDNA克隆,序列测定及其在COS—7细胞中的表达

本文利用反转录ＰＣＲ技术从人胎肝ｍＲＮＡ中分别扩增出ｈＴＰＯ　Ｎ－端和Ｃ－端两个ｃＤＮＡ片段,然后经酶切分别连接重组到质粒ｐＵＣ１９中进行序列分析,在确证其序列与国外文献报道完全一致的基础上,酶切、回收、连接其Ｎ－端、Ｃ端ｃＤＮＡ,并以此为模板,用ＰＣＲ法扩增出全长ＴＰＯｃＤＮＡ片段,并将其重组到穿梭质粒ｐＳＶＫ３中,在ＣＯＳ－７中进行了瞬时表达并检测出表达产物的活性     

人IL-18 cDNA克隆及其真核表达质粒的构建

用ＲＴ－ＰＣＲ技术从健康人外周血单核细胞的总ＲＮＡ中扩增出编码白细胞介素１８的全长ｃＤＮＡ,并将此基因定向克隆入真核表达质粒载体ｐｃＤＮＡ３中,通过对转化子的筛选得到了带有ＩＬ－１８插入片段的阳性克隆,经酶切分析及核苷酸测序表明,克隆到的基因与文献报道的完全一致。把重组质粒ｐｃＤＮＡ３／ＩＬ－１８分别转染人肝癌细胞ＨｅｐＧ２和鼠肉瘤细胞Ｓ１８０,在ｍＲＮＡ水平检测到ＩＬ－１８的表达,但ＩＬ－１８ 的表达未诱导肿瘤细胞产生ＩＦＮ－γ。     

大鼠4.5S RNAs的cDNA克隆与序列分析

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法,首次从大鼠肝脏细胞总ＲＮＡ中扩增出４．５Ｓ ＲＮＡｓ的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ被克隆到ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）质粒上,经酶切电泳鉴定,然后测序。与报道的小鼠和仓鼠４．５Ｓ ＲＮＡｓ序列进行了比较研究,并对该分子的结构特点进行了初步分析。     

小鼠cAMP应答元件结合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

采用ＰＣＲ技术,删除了小鼠ＣＲＥＢｃＤＮＡ５‘端和３’端非编码序列,并引入便于基因操作的酶切位点。经３０次循环的扩增,得到改造后的ＣＲＥＢｃＤＮＡ,全和工０７１ｂｐ。亚克隆后,对此扩增片段进行了限制性内切酶物理图谱分析,测定了ＤＮＡ序列,并以其为插入物,构建了ｐＢＶ２２０－ＰｃＲ ＣＲＥＢ重组表达载体Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法分析证明,在大肠杆菌中的表达获得成功。     

小麦丛矮病毒NS蛋白基因的克隆及序列分析

利用与Ｎ蛋白ｍＲＮＡ３＇末端顺序相同的２０寡聚核苷酸引物,通过点杂交、限制性内切酶分析从小麦丛矮病毒（ＷＲＳＶ）ｃＤＮＡ文库中筛选到编码Ｎ蛋白基因下游顺序的ｃＤＮＡ克隆。序列分析表明,该ｃＤＮＡ片段含有一编码的４０ｋＤ蛋白的开放读框。将该读框的全长ｃＤＮＡ经ＰＣＲ扩增后,克隆到ｐＧＥＸ－３Ｘ上,在大肠杆菌ＤＥ３中用ＩＰＴＧ诱导表达,经蛋白质印迹鉴定,该基因为小麦丛矮病毒ＮＳ蛋白基因。     

烟草渗调蛋白基因的分离克隆及序列分析

参照国外报道的渗调蛋白基因序列,自行设计并合成了一对寡核苷酸引物,通过ＰＣＲ技术从云南地方栽培的烤烟品种“红花大金元”基因组ＤＮＡ中直接扩增出了其全编码序列。ＰＣＲ产物纯化后直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统中,转化大肠杆菌ＤＨ５α,在Ｘｇａｌ平板上筛选白色菌落,经ＳｐｈＩ和ＳａｃＩ双酶切,鉴定所得的重组质粒中含有７５３ｂｐ左右的ＰＣＲ扩增片段。采用双链双脱氧法定序分析表明所克隆的渗调蛋白基因编码区序列与国外迄今所报道的两个株系的序列完全一致,提示了该基因在进化上的保守性     

大鼠OB基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用ＲＴＰＣＲ技术扩增大鼠ＯＢｃＤＮＡ编码区序列。ＰＣＲ产物酶切后定向克隆至ｐＵＣ１９质粒。经核苷酸序列测定表明与文献报道的大鼠ＯＢｃＤＮＡ编码区序列一致。继之构建了ｐＢＶ２２０ｒＯＢ表达质粒并获得了ＯＢ基因在大肠杆菌中的特异表达。大鼠ＯＢ基因产物的获得为研究肥胖与某些非传染性疾病（如糖尿病、高血压病）间的关系提供了条件     

中国人肥胖基因真核表达载体的构建

为研究肥胖（ｏｂｅｓｉｔｙ）的病因及肥胖基因（ｏｂ）的表达与调控,根据文献报道的ｈｏｂ序列设计引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增中国人的ｏｂ基因（包括信号肽在内的ｃＤＮＡ全长５４０ｂｐ）,ＰＣＲ产物采用Ｔ－Ａ克隆法首先连接到克隆载体ｐＵＣ１１９,然后定向转移到经改造的真核表达载体ｐＳＶ－β－ｌａｃＺ,酶谱分析表达克隆基因为的人肥胖基因。     

牛β-酪蛋白5'端上游调控序列的克隆和序列分析

该文用ＰＣＲ扩增了牛β－酪蛋白基因５‘－端上游调控序列,并对其进行了克隆和序列分析。采集成年母牛肝,提取ＤＮＡ。在牛β－酪蛋白基因外显子１和上游调控区内设计引物,扩增其上游调控序列。两条引物长均为１９个核苷酶,引物间跨度为６３５ｂｐ。以牛肝ＤＮＡ为模板,进行ＰＣＲ扩增,扩增产物在２％琼脂糖凝胶上电泳,可见特异的目的条带。     

在DH5α中拼接构建ADAM10全长真核表达载体的基因突变

目的:构建ADAMI0真核表达载体,为进一步研究其生物学功能打基础.方法:将人ADAM10的上下两部分基因片段(分别为全长基因的1 ～910bp和911 ～2 247bp片段),依次与真核表达载体pcDNA3.1相连,以大肠杆菌DH5α或BL21(DB)作为感受态宿主菌用于转化连接产物,拼接成全长的阳性克隆通过PCR、酶切和测序鉴定.结果:ADAM10下段基因与已正确连入上段的pcDNA3.1重组质粒拼接时,若用DH5α为感受态菌,则下半段出现碱基插入增加512bp,测序结果显示为ADAM10基因第1 531 bp～2 042 bp间的序列有紧邻的双份;若用BL21(DE3)为感受态,则无突变.结论:将ADAM10基因与pcDNA3.1真核表达载体依次拼接构建重组质粒时,以DH5α为宿主菌可出现基因序列增加的罕见突变,而以BL21(DE3)为宿主则无突变,由此成功构建ADAM10全长基因与pcDNA3.1的重组质粒.     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

中国春小麦puroindoline a基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:puroindoline(pin)基因在控制麦类作物的籽粒硬度中起着重要作用。构建真核表达载体pcDNA3.1( )-pina-gfp,为pina基因在哺乳细胞中的表达提供基础。方法:利用PCR方法从中国春小麦基因组中克隆到了pina基因,将其插入真核表达载体pcDNA3.1( )-gfp,用PCR和酶切鉴定重组子。结果:PCR和酶切鉴定表明,所构建的真核表达重组质粒为pcDNA3.1( )-pina-gfp;将该片段克隆到pCF-T载体中,经测序验证,表明其为目的基因。结论:构建的pina基因真核表达载体pcDNA3.1( )-pina-gfp为pina基因在哺乳动物细胞中的表达提供了基础。     

APC11基因真核表达质粒构建及鉴定

目的克隆扩增APC11开放阅读框基因片段,构建其真核表达重组质粒,为后续研究其功能做准备。方法按照GenBank中人APC11序列设计引物,以HeLa细胞cDNA为模板,扩增出基因片段。该片段与真核表达载体pEGFP-C1连接,得到的重组质粒经双酶切和测序鉴定后用Western印迹检验表达。结果扩增片段长度为285bp,重组真核表达质粒经双酶切鉴定后测序鉴定正确。Western印迹证实pEGFP—C1-APC11在真核细胞内表达。结论成功克隆了APC11基因并构建了pEGFP—C1-APC11真核表达重组质粒,Western印迹证实其表达良好,对该基因功能的深入研究打下了坚实基础。     

博尔纳病病毒pEGFP-p24基因重组质粒的构建及鉴定

构建博尔纳病病毒pEGFP-p24基因重组表达质粒。通过PCR方法扩增获得博尔纳病痛毒p24基因的完整序列,将此片段定向克隆到pEGFP-N1载体多克隆位点区,筛选重组阳性菌株,提取重组质粒,利用PCR方法和核酸序列测定验证重组质粒构建的正确性。PCR及核酸序列测定证明博尔纳病病毒pEGFP-p24基因重组表达质粒构建成功。构建的重组质粒将为研究博尔纳病病毒p24基因在真核细胞中的功能和作用提供实验依据。     

稳定表达p120ctn的人肺腺癌A549细胞株的构建

目的:构建稳定表达p120ctn的A549细胞株,以研究p120ctn蛋白在肺癌发生和转移过程中的作用。方法:通过分子克隆,将pc DNA3.1多克隆位点插入Flag标签的编码序列,得到pc DNA.Flag表达载体。然后PCR扩增p120ctn的编码序列,插入Flag标签下游,构建pc DNA.Flag-p120ctn质粒,筛选阳性克隆并进行酶切及测序鉴定。利用脂质体Lipofectamine 2000将pc DNA.Flag-p120ctn质粒转染到肺癌细胞A549中,通过G418筛选得到稳定转染细胞株,免疫印迹法检测p120ctn的表达。结果:本文构建了融合有Flag标签的p120ctn真核表达载体并转染到A549中,免疫印迹结果表明p120ctn蛋白在A549细胞中高效的表达。结论:本文成功构建了稳定高表达p120ctn的A549细胞模型,为深入研究p120ctn在肺癌的发生和转移过程中的作用奠定了基础。     

人IL-6受体胞外区真核表达载体的构建及体外表达

目的构建人IL-6受体（IL-6R）胞外区真核表达载体,检测其在体外培养细胞中的表达。方法利用PCR扩增IL-6R胞外区,克隆到pcDNA3．1（＋）中,用双酶切、测序鉴定。重组质粒通过脂质体转染HL-60细胞,用G418进行筛选,利用Western印迹检测IL-6R蛋白表达。结果PCR扩增出1218bp的目的片段,双酶切和测序结果显示重组质粒正确。Western印迹结果显示转染细胞能够表达目的蛋白。结论成功构建了人IL-6R胞外区真核表达载体,并且能够在真核细胞中表达。     

尘螨变应原Derf1真核表达载体的构建及转染CHO细胞

目的：构建尘螨变应原Der f1真核表达载体,转染真核细胞并进行蛋白表达。方法：根据Genebank中Der f1基因的核酸序列（AB034946）,设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-his A上,以脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选,进行稳定表达细胞株的筛选和鉴定。结果：将目的基因Der f1成功连接到pcDNA3.1/myc-hisA-Derf1并转染CHO细胞,获得稳定表达的CHO细胞株。结论：成功构建了尘螨变应原Der f1真核表达载体,并转染CHO细胞表达蛋白质。     

靶向性甲基化酶真核表达载体pcDNA3.1-myc-3a的构建

目的:在pcDNA3.1真核表达载体中构建表达融合myc-6his标签的靶向性甲基化酶pcDNA3.1-myc-3a并进行鉴定。方法:以含有myc全长基因的pcDNA3.1-myc-Luc质粒为模板,通过PCR方法扩增获得myc(DBD),再以含有靶向性甲基化酶的pcDNA4.0-GBD-3a-myc-6his质粒为模板,通过PCR的方法扩增获得融合有myc-6his标签序列的目的区段3a,然后将两者克隆入表达载体pcDNA3.1;以双酶切和PCR方法对构建的载体进行鉴定。结果:通过PCR方法获得了靶向性甲基化载体pcDNA3.1-myc-3a,并通过免疫印记方法验证了抗myc标签抗体可以特异性识别目的蛋白。结论:正确构建了靶向性甲基化酶pcDNA3.1-myc-3a的真核表达载体。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因的克隆和在大肠杆菌中高效表达

利用PCR方法从金黄色葡萄球菌TSTw基因组DNA中扩增出约700bp的DNA片段,将之克隆到pGEM7Zf(+)载体上并转化大肠杆菌 DH5α菌株。重组质粒的测序结果表明克隆到了seb基因,它含有717bp（不包括N端81bp的信号肽编码区）,其核苷酸序列与文献报道完全一致。将其连接于表达载体7ZTS上,转化到大肠杆菌JM109（DE3）内。表达的SEB占总蛋白33.5%。 