人源中和性抗狂犬病毒基因工程抗体的研制

从具有高滴度狂犬病毒抗体的多位疫苗注射者采集外周血淋巴细胞,构建人源抗狂犬病毒Fab基因工程抗体文库。用纯化的狂犬aG和CTN株病毒颗粒富集筛选所得Fab噬菌体抗体文库,利用ELISA和间接免疫荧光法IFA鉴定所得人源单克隆抗体Fab段基因的功能特性,并通过序列测定确定所得抗体的轻链和重链的型别,成功获得11株抗狂犬病毒糖蛋白的人源单克隆Fab抗体。将其中5株人源单克隆Fab抗体的轻链和重链分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc后转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒系统实现全抗体的分泌型表达。5株全抗体在体外与狂犬病毒CVS-11株的中和反应中均显示具有狂犬病毒中和活性。人源中和性抗狂犬病毒基因工程全抗体的获得为我国自行生产抗狂犬病单克隆抗体鸡尾酒奠定了物质基础。     

人源抗狂犬病毒单克隆抗体Fab段基因的获得和表达

运用噬菌体表面呈现（phage display）技术获得了人源抗狂犬病毒糖蛋白基因工程单克隆抗体Fab段基因及其表达。从狂犬病毒PM株Vero细胞疫苗免疫的人抗凝血中分离获得外周淋巴细胞,提取细胞总RNA,通过RTPCR方法,用一组人IgG Fab基因4特异性引物,从合成的cDNA中扩增了一组轻链和重链Fab段基因,将轻链和重链Fab段基因,将轻链和重链先后克隆入噬菌体载体pComb3,成功地建立了抗狂犬病毒抗原的方法,对此抗体库进行富积筛选表达,成功地获得了抗狂犬病毒的人源单抗Fab段基因及其在大肠杆菌中的有效表达,对其中一株单抗G10进行了较为系统的分析,发现它与一株鼠源中和性狂犬病毒糖蛋白特异性单抗存在竞争,证实该单抗能识别狂犬病毒糖蛋白,其序列资料分析表明,该单抗为一株新的抗狂犬病毒人源基因工程抗体。     

高致病性禽流感病毒H5N1中和抗体的单链抗体构建与活性鉴定

在本实验室研制出的多株针对H5N1血凝素的鼠单抗中,10F7对34株H5N1病毒株都有血凝抑制和中和活性,具有特异性高、反应性强、识别谱广的特点。通过基因工程构建10F7单链抗体(scFv)表达重组质粒,在大肠杆菌中表达并纯化scFv,经血凝抑制实验及中和实验检测其活性。结果在针对3株病毒的血凝抑制实验中,10F7scFv蛋白对其中2株H5N1病毒均显示出结合活性,而对H9毒株没有反应。在针对7株H5N1病毒的中和实验中,10F7scFv对5株病毒具有较好的中和能力。H5N1广谱中和抗体10F7的单链抗体构建,为进一步研制针对H5N1禽流感病毒的治疗性抗体奠定了基础。     

特异性干扰PB-1基因对H5N1高致病性禽流感病毒复制的影响

针对H5N1高致病性禽流感病毒PB-1基因,通过RNA干扰技术,设计siRNA,研究其抑制病毒复制的效果.siRNA转染MDCK细胞并接毒后,病毒滴度测定、Real-time PCR和间接免疫荧光试验结果显示,所设计的siRNA(ps-PB1-777)具有明显的抑制病毒复制的效果,PB-1基因的拷贝数和病毒蛋白表达都下降.设计的siRNA可显著抑制高致病性禽流感病毒的复制.因此,本研究中PB-1基因的有效siRNA可为预防和治疗H5N1高致病性禽流感提供合理的技术支持和物质储备.     

人源抗严重急性呼吸综合征(SARS)病毒基因工程抗体的初步研究

严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)或称传染性非典型肺炎,已严重威胁人民健康和生命安全。快速研制一种可用于紧急预防SARS病毒感染的基因工程抗体预防制剂迫在眉睫。为此,运用噬菌体表面呈现技术,从多个SARS病人恢复期血中获得淋巴细胞,通过基因工程手段,构建了人源抗SARS病毒基因工程抗体文库,并筛选获得37株特异抗SARS病毒基因工程Fab抗体,其中ll株人源抗体结合基因工程重组的SARS病毒核(N)蛋白,其中的1株在Western blot分析中与SARS病毒结合,识别SARS病毒N蛋白线性位点。对所获抗体的功能鉴定及基因分析正在进行中。人源抗SARS病毒基因工程抗体的获得,将对SARS疾病的特异性预防,治疗和诊断提供新的途径。     

抗禽流感病毒H5N1亚型单克隆抗体制备初报

目的制备禽流感H5N1亚型病毒的单克隆抗体,为相关研究提供工具。方法以禽流感H5N1亚型病毒免疫BALBc小鼠,取其脾细胞和SP20细胞融合,用血凝抑制试验(HI)和酶联免疫反应(ELISA)检测培养上清,并将阳性融合细胞稀释克隆化3次直至100%孔均为阳性,筛选阳性克隆株,运用免疫荧光法评估单克隆抗体检测病毒感染的犬肾细胞(MDCK)。结果得到三株稳定分泌抗体的细胞并命名为F8、F9、G11,抗体亚型鉴定结果分别为IgG1、IgG2a和IgG2b;在免疫荧光法单克隆抗体能够检测出感染MDCK细胞的病毒。结论建立了3株抗禽流感H5N1亚型病毒的单克隆抗体细胞株,其产生的一株高特异性的McAbG11能够用于H5N1亚型禽流感病毒感染诊断,并可能应用于禽流感病毒H5N1亚型感染的防治。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单链抗体基因的克隆及表达

构建并表达H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单链抗体,为禽流感靶向治疗药物的研制制备靶向载体。从分泌血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA,采用RT-PCR法扩增出重链和轻链可变区基因,通过SOE-PCR法将重链和轻链通过Linker连接起来构建单链抗体基因,将获得的单链抗体基因装入原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒并表达,以Western blot鉴定单链抗体的特异性。结果成功构建了单链抗体基因,全长714bp,经原核表达,所构建的单链抗体可与H5亚型禽流感病毒HA蛋白特异结合,为禽流感的靶向治疗奠定了基础。     

特异结合人禽流感病毒H5N1的scFv分子性能鉴定

目的从人源化噬菌体抗体库（human single fold scFv libraries I＋J）中筛选到能高亲和性、特异结合人禽流感病毒H5N1的单链抗体,为建立H5N1快速筛查试剂和人源化治疗单抗奠定基础。方法以H5N1病毒的血凝素（hemagglutitin,HA）蛋白和核蛋白（nucleoprotein,NP）为目的蛋白,对上述单抗噬菌体文库以亲和性为原理进行筛选,经过3轮筛选富集后,随机挑选了96个噬菌体克隆扩增培养,ELISA法挑选能特异性、高亲和性结合目的蛋白的噬菌体克隆,并换用HB2151宿主菌对阳性单链抗体克隆进行可溶性表达,ELISA法鉴定可溶性单链抗体的结合活性,PCR扩增阳性克隆的轻、重链基因片段,并对阳性单链抗体分子测序和序列分析。结果经过3轮筛选,分别从96个噬菌体克隆中挑选到了两株能特异结合NP蛋白、3株能特异结合HA蛋白的单链抗体,PCR扩增都得到了长为300、302和935bp的轻链、重链和轻链-连接片段-重链的基因片段,测序结果分析发现上述5条单链抗体片段在轻链的47、49、50、51、53、54、56、96、97、98和99位的氨基酸组成不同,而特异结合NP蛋白的单链在重链区域氨基酸组成完全相同,而特异结合HA蛋白的单链在重链的44、47、85、86、87、88和89位氨基酸组成不同。结论从噬菌体抗体库中筛选到的特异结合HA和NP蛋白的单链抗体片段,可为进一步研发H5N1快速筛选试剂和人源性治疗抗体奠定基础,也可为鉴定HA和NP蛋白中的抗原决定簇提供结构信息。     

人源中和性抗甲型肝炎病毒抗体Fab段基因的序列分析及可溶性表达

在用噬菌体表面呈现系统获得人源抗甲型肝炎（甲肝）病毒中和发生基因工程Fab抗体的基础上,对所获得的4株中和性Fab抗体轻重链可变区进行了序列分析、可溶性表达及生物学特性鉴定。4株Fab抗体重链可变区拥有99％同源的核苷酸序列和相同的CDR区氨基酸序列,属于VHⅢ基因家族,而轻链可变区核苷酸序列同源性为95％和相似的CDR区氨基酸序列,属于VL5基因家族。这些重组抗体都能与人甲肝恢复期血清及具有中和活性的鼠抗甲肝克隆抗体产生竞争抑制反应,表明其针对甲肝癌病毒结构蛋白上的主要抗的决定簇。     

H5N8亚型高致病性禽流感病毒的全球流行概况

H5N8亚型高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)随候鸟的迁徙活动及商业贸易活动现已蔓延至亚洲、欧洲、非洲、美洲等国家和地区.2014-2015和2016-2019年H5N8亚型HPAIV已引发两波全球疫情,现正经历第三波疫情,导致家禽及野生鸟类...     

H5N1禽流感病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的：建立H5N1禽流感病毒环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法。方法：从GenBank中获得H5N1禽流感病毒血凝素（HA）基因序列,应用DNAStar软件MegAlign程序分析其序列,利用PrimerExplorerV3软件在序列保守区域设计LAMP引物,即外引物、内引物和环引物,同时以所克隆的阳性质粒为模板,对试验中的几个重要参数进行优化。结果：LAMP检测方法对H5N1禽流感病毒的灵敏度达到4～6个拷贝,其引物对于H1、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒无非特异性扩增,表现出良好的H5亚型特异性。结论：建立的H5N1禽流感病毒环介导等温扩增快速检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,为快速检测禽流感病毒提供了新方法和新思路。     

格尔德霉素抑制高致病性禽流感病毒增殖及其所介导炎性反应研究

对高致病性禽流感病毒感染最为有效的治疗应采用抗病毒和抗炎症的联合治疗．本试验用流感病毒H5N1感染不同细胞株(A549细胞和MDCK细胞),采用不同浓度格尔德霉素对病毒感染细胞培养物作用不同时长,检测流感病毒滴度;ELISA检测格尔德霉素作用于流感病毒H5N1感染A549细胞12 h、24 h促炎性细胞因子IFN-α、TNF-α和IL-6水平．结果显示,流感病毒H5N1感染A549细胞和MDCK细胞,格尔德霉素极显著地抑制了流感病毒H5N1在细胞培养物的增殖(P < 0.01),而在病毒感染36 h和48 h,格尔德霉素并没有显著抑制流感病毒在MDCK细胞上的增殖(P > 0.05)．促炎性细胞因子分析结果显示,格尔德霉素在流感病毒感染A549细胞12 h和24 h均显著降低了促炎性细胞因子IFN-α、TNF-α和IL-6的分泌(P < 0.05)．上述实验结果显示,格尔德霉素具有抑制流感病毒H5N1增殖及其所介导的炎性反应的双重效应,为格尔德霉素成为应对流感病毒流行的备选药物提供基础科学依据．     

共表达H5和H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因的重组禽痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效能同时抵抗高致病性H5亚型和低致病忡H9亚型禽流行性感冒(禽流感)病毒的基因工程疫苗,将H5和H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因,分别由鸡痘病毒早晚期启动子PS和PE／L调控其转求,定向插入鸡痘病毒转移载体p11s中,获得H5A和H9A基因分别处于PS及PE／L启动子转录调控下的重组转移载体p11SH5H9。以FuGene^TM6转染法将p11SH5H9转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5H9与wt—FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV11SH5H9。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-11SH5H9。以间接免疫荧光法试验证实,纯化的rFPV-11SH5H9感染的CEF能同时表达H5A和H9A。初步的动物试验表明,用10^5PFU的rFPV-11SH5H9免疫无特定病原体(SPF)鸡,免疫后血凝抑制(HI)抗体监测阳性率均为100％(8／8);该重组病毒能显著抑制H9亚型AIV滴鼻、点眼后7日龄SPF鸡从气管和泄殖腔排毒,同时也能抵抗H5亚型AIV肌肉注射后对7日龄SPF鸡致死性攻击,保护率均为100％,显示出一定的应用前景。     

2005～2006年湖南省人感染高致病性禽流感(H5N1)实验室诊断及病毒基因特性研究

为了对2005~2006年湖南省2例不明原因肺炎病例进行实验室诊断,确定病因以及对其进行病原学研究,采集病例呼吸道标本和血清标本,对呼吸道标本采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(Real-time RT-PCR)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测H5亚型禽流感病毒核酸,对血清标本采用血凝抑制试验检测特异性抗体,并对其中1例死亡病例(病例2)的肺穿刺物标本进行病毒分离,所获毒株予以测序及同源性分析。结果显示,2例病例H5亚型禽流感病毒核酸检测均为阳性,病例1恢复期血清H5N1特异性抗体阳性,并且较急性期血清呈4倍以上增长;病例2急性期血清特异性抗体阴性,2例均为人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)确诊病例。从病例2分离得到毒株A/Hunan/1/2006,测序及分子特性分析表明,其8个基因片段均为禽源,且与湖南本地禽类分离的病毒相似,并未与人流感病毒发生基因重组或产生显著变异。     

禽流感H5N1亚型病毒对五个不同品系小鼠致病性的比较(英文)

目的比较了不同遗传背景小鼠对禽流感H5N1亚型病毒的致病敏感性,为H5N1禽流感模型制作和机理研究提供依据。方法近交系BALB/c、C57BL/6和封闭群ICR、NIHSwiss和KMSwiss共五个不同品系小鼠。每个品系实验动物30只,分接毒组20只,空白对照组10只,每组雌雄各半。病毒株为A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1),经测定TCID50为10-4.875/mL。接毒组通过鼻腔接种0.1mL病毒液,对照组接种正常鸡胚尿囊液。小鼠接毒后连续观察14d,观察记录临床症状、体温、体重变化,对在实验期间死亡和实验14d结束后仍然存活的小鼠均进行组织器官病理取材,进行RT-PCR病毒分离检测、HE染色及H5N1抗原特异性免疫组化染色。结果①临床症状:H5N1禽流感病毒能感染五个品系的小鼠,引起呼吸急促等症状和一过性体重、体温下降。②死亡情况:小鼠在接毒后第1天即出现死亡,死亡的高峰期集中在接毒后第3～6天。五个品系小鼠死亡率存在差异,BALB/c为70%,ICR为50%,NIHSwiss为40%,C57BL/6为25%,KMSwiss为10%;③病毒分离:各组接毒小鼠在死亡后均进行了病毒分离,死亡小鼠的肺脏均分离到病毒,其他脏器未分离到病毒。④病理变化:实验期间五个品系死亡小鼠肺脏病理改变相近。大体观:死亡小鼠肺部淤血,呈暗红色,体积增大,局部肺组织实变。镜下观:死亡小鼠的共同病理改变为间质性肺炎,具体表现为肺泡腔及间质出血、炎性细胞浸润;间质增生,肺泡隔增宽;肺泡腔中见纤维素性渗出,透明膜形成。⑤免疫组化结果 :在死亡小鼠的气管上皮细胞和肺巨噬细胞可观察到H5N1禽流感病毒阳性表达。结论小鼠作为H5N1禽流感病毒模型具有普适性,不同品系小鼠感染鹅源H5N1禽流感病毒的临床症状、病程和病理变化与人禽流感病例相似。不同品系小鼠的死亡比例有明显差别,可以根据不同的实验目的 ,选择不同品系的小鼠制作H5N1禽流感动物模型。不同品系的遗传特性对禽流感易感性产生明显的影响,遗传背景可能与H5N1禽流感病毒感染应答机理存在联系:BALB/c和C57BL/6均为近交系,其中BALB/c小鼠的品系特征之一表现为干扰素产量低,接种H5N1病毒后表现为高死亡率(70%),而C57BL/6小鼠的干扰素产量高,接种H5N1病毒后表现为低死亡率(25%),提示不同遗传背景小鼠的干扰素水平与H5N1感染致死具相关性。为进一步研究H5N1禽流感病毒易感性相关基因以及其与宿主免疫反应的关系提供了一个研究基础。     

H5N1型禽流感病毒感染非人灵长类动物的观察

目的观察H5N1型禽流感病毒对中国非人灵长类动物的易感性并建立动物模型。方法将病毒通过滴鼻接种实验猴,观察感染后动物的临床症状,采血、咽拭子及各器官组织进行血清学、病原学及病理学检查,记录抗体变化、病毒分离情况及病理学改变。结果感染后动物表现轻度食欲下降、一过性体温升高及外周血白细胞减少,肺组织病毒分离及RT-PCR阳性,病理检查感染急性期动物肺组织表现为间质性肺炎,肺泡间隔增宽,充血出血明显,肺泡受压变形,间质及肺泡内有大量炎细胞浸润,符合病毒性肺炎的改变,感染后14 d动物血清IgG抗体水平较感染前升高4倍。结论H5N1病毒可感染非人灵长类动物,可以作为感染模型进行H5N1病毒的发病机制、疫苗评价、药物筛选等研究。     

新的猪源性甲型H1N1流感病毒

2009年3月在美国和墨西哥流感样患者的呼吸道标本中鉴定出新的猪源性甲型H1N1流感病毒。该病毒可人一人传播,已蔓延到172个国家和地区。现就猪源性甲型H1N1流感病毒的鉴定、基因组结构特征做一综述。     

H5N1型禽流感病毒广谱中和单克隆抗体的筛选及其中和机制初步研究

利用杆状病毒-昆虫细胞表达H5N1型禽流感病毒的血凝素蛋白(HA),纯化后的重组蛋白HA免疫小鼠并制备杂交瘤单克隆抗体,用H5N1型禽流感病毒的全病毒进行筛选,成功地获得了抗H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA的单抗.MDCK细胞微量中和试验表明,单抗8G10D7可对clade2和clade9的H5N1型禽流感病毒起中和作用.Western-blot及血凝抑制实验进一步证明了该单抗的结合位点位于HA蛋白的HA1亚基上.鸡胚感染病毒预防试验结果表明,8G10D7对禽来源的和人来源的H5N1型禽流感病毒均可达到100%的保护率;在治疗试验组中,8G10D7对禽来源的病毒感染具有较高的保护率,可达100%,对人来源的H5N1型禽流感病毒最高也可达87.5%的保护率.该抗体的获得不仅为H5N1型高致病性禽流感病毒的预防和治疗带来了希望,同时其中和位点的发现也为以后亚单位疫苗的研制提供新的思路.     

恒河猴二次接种H5N1亚型禽流感病毒

对恒河猴进行二次接种H5N1亚型禽流感病毒试验,并对二次接毒的结果进行观察,评估初次接毒对恒河猴二次接毒效果的影响.首次接种试验中,3、4、5号恒河猴用环甲膜穿刺注射方法接种含有H5N1亚型禽流感病毒的尿囊液,6号猴接种不含病毒的尿囊液.90d后,再次用环甲膜穿刺注射方法二次接种,4、5、6号猴接种7mlTCID50浓度为104.875病毒的尿囊液,3号猴接种7ml不含病毒的尿囊液.进行抗体等检测,并分别于72h无痛处死3、4、6号猴,第7d无痛处死5号猴,进行肺的病毒检测及病理观察.结果显示,3、4、5号猴至试验结束时体内依然有较高的抗H5N1亚型禽流感病毒抗体水平,6号猴没有抗体;通过RT-PCR以及免疫组化染色进行病毒检测,均只在6号猴肺部检出病毒,且6号猴肺部病理损伤最为严重.由此可以得出初步结论:在初次感染H5N1亚型禽流感病毒后90d,临床症状已基本恢复正常的恒河猴体内仍然有较高水平的抗体,此时,恒河猴抵抗H5N1亚型禽流感病毒二次感染的能力显著提高.