荧光定量PCR法定量白酒固态发酵过程中产土味素的链霉菌

【目的】荧光定量PCR法具有特异性高、灵敏度高等优点,在定量复杂环境中微生物数量方面得到广泛应用。本文采用荧光定量PCR方法对固态白酒发酵过程产土味素链霉菌进行定量分析并验证其准确性。【方法】通过优化大曲和酒醅中微生物基因组提取方法,并建立相应的大曲和酒醅两种基质条件下的荧光定量PCR标准曲线,并对方法的精度和准确度进行验证分析。采用荧光定量PCR方法对大曲和酒醅中产土味素链霉菌进行定量分析。【结果】结果表明大曲中产土味素链霉菌数量在105数量级,并且清茬曲中此类链霉菌数量最高。酒醅发酵起始阶段产土味素链霉菌数量在104数量级,而后随着发酵的不断进行,酒醅中此类链霉菌数量有所减少。【结论】荧光定量PCR方法能够对白酒固态发酵过程中产土味素链霉菌准确进行定量分析,对采用此方法定量其他微生物具有借鉴意义。     

乙醇与酸度协同作用推动芝麻香型白酒固态发酵过程的微生物群落演替

【背景】揭示白酒固态发酵过程中微生物组装规律及其环境驱动因素,对于解析白酒酿造微生物特征具有重要作用。【目的】揭示芝麻香型白酒固态发酵过程中微生物群落的演变规律及其演替的环境推动力。【方法】通过高通量测序揭示固态发酵过程中的优势微生物及群落结构演变过程;通过PICRUSt预测固态发酵过程中原核微生物群落代谢途径分布变化;通过关联分析揭示酒醅理化因子对微生物群落结构演变的解释率;通过实验室模拟发酵验证理化因子对群落组成的影响。【结果】芝麻香型白酒固态发酵过程包括2个阶段:阶段I (0-5 d),乙醇合成速率和还原糖消耗速率最高,Bacillus和Pichia是丰度最高的微生物属,酸度是群落演替最关键推动力;阶段II(5-30d),Lactobacilus和Saccharomyces是丰度最高的微生物属,乙醇是群落演替最关键推动力。在固态发酵过程中酒醅理化因子对群落演替的解释率为68.27%,其中乙醇(最高解释变量)和酸度的解释率分别为13.76%和4.43%,二者的共同解释率为23.17%,对推动微生物群落演替具有协同作用。【结论】揭示了芝麻香型白酒固态发酵过程的微生物群落演变规律及其演替的环境推动力,为提高白酒固态发酵过程可控性提供依据。     

基于26S rDNA D1/D2序列分析酱香型白酒酒醅中酵母菌的群落结构

【目的】比较分析不同发酵阶段的酱香型白酒北大仓酒醅中酵母菌的群落结构。【方法】酒醅样本采集自黑龙江省北大仓白酒不同阶段的发酵窖池,采用平板分离技术获得大量酵母菌纯培养物;基于26S rDNA D1/D2区域的碱基序列,准确鉴定酒醅中的酵母菌;根据酵母菌的数量变化、种类组成、相对频率、多样性指数及其相似性系数,研究酱香型北大仓白酒酒醅中酵母菌的群落结构特征。【结果】北大仓白酒酒醅中酵母菌数量在酿造过程中的变化,遵循着"升高-降低-升高-降低"的规律;第1轮"升高-降低"的过程表现出急剧的"速升速降"特点,而第2轮"升高-降低"的过程则具有相对来说比较温和的"缓升缓降"特征。酒醅内的酵母菌鉴定为8属13种,总体多样性指数处于较高的水平,发酵初期酵母菌多样性指数逐渐增加,最高的多样性指数(1.89)出现在发酵第5 d的酒醅内;然后又逐渐下降,发酵至第11 d时降至最低(0.66);酒醅发酵至13 d时开始直至发酵末期,多样性指数呈现出波动性变化。北大仓白酒酒醅中酵母菌的种类组成总体来说比较接近,大多数情况下相似性系数都高于0.5,说明在白酒酿造过程中酵母菌的组成和分布处于一个相对稳定的状态。对于北大仓白酒酒醅内存在的常见酵母菌来说,Issatchenkia orientalis、Pichia kudriavzevii和Saccharomyces cerevisiae可能在酿造过程中发挥更重要的作用。【结论】北大仓等酱香型白酒的酒醅内存在着丰富的酵母菌资源,阐明酒醅内酵母菌的群落结构可以为解析酱香型白酒的发酵机理提供基础数据和理论基础。     

泸型酒酒醅中梭菌群落的发酵演替规律和功能预测

【目的】研究泸型酒酒醅中梭菌(Clostridia)群落的演替规律,探讨梭菌群落在酒醅发酵过程中的潜在功能。【方法】利用实时荧光定量PCR技术结合高通量测序技术研究不同发酵时间泸型酒酒醅中梭菌丰度变化;通过梭菌16S r RNA基因序列高通量测序数据分析揭示梭菌群落演替规律,并运用LEf Se分析找出标志性OTU;通过PICRUSt分析对梭菌功能组成进行预测。【结果】泸型酒发酵过程酒醅中梭菌的生物量在发酵14 d上升至最高(3.46×10~7 copies/g),梭菌占总细菌的相对丰度在发酵20 d达到最高(6.67%);对梭菌群落结构的聚类分析结果表明,发酵7 d的酒醅梭菌群落结构显著区别于其他发酵时间,主要体现为存在17个标志性OTU,其中大部分分类学地位尚不明确;PICRUSt分析显示梭菌主要参与氨糖与核糖代谢、磷酸戊糖途径,其次是果糖和甘露糖代谢、TCA循环、糖酵解途径、丙酸及丁酸代谢。【结论】泸型酒酒醅中梭菌的生物量和占细菌的相对丰度在发酵开始后的2-3周内逐渐达到最高,而梭菌群落的结构则在发酵1周内便发生了显著改变,并在发酵2-3周内趋于稳定。在发酵2-3周时有较多与丙酸、丁酸等风味物质代谢相关的基因在酒醅梭菌中被预测到。     

清香型白酒固态酿造过程中酵母种群结构和多样性分析

【目的】探索清香型白酒固态酿造过程中酵母的种群结构和生态多样性变化规律,为科学认识白酒酿造的过程与机制提供理论依据。【方法】运用WL鉴别培养基和26S rRNA D1/D2序列分析方法对清香型白酒3种典型大曲和酒醅发酵过程的酵母进行分类学研究。【结果】从清香型白酒固态酿造过程中共鉴定出10种酵母,分别为Saccharomyces cerevisiae、Issatchenkia orientalis、Pichia anomala、Saccharomycopsis fibuligera、Pichia fermentans、Trichosporon asahii、Hanseniaspora osmophila、Pichia farinosa、Pichia membranifaciens和Clavispora lusitaniae。其中T.asahii、C.lusitaniae、H.osmophila、P.membranifaciens、P.farinose和P.fermentans为首次从清香型白酒酿造过程中分离获得的酵母种类。考察3种典型大曲(清茬、红心、后火曲)和大茬、二茬酒醅发酵过程的酵母种群结构变化规律显示,3种大曲具有相同的优势菌种S.fibuligera,但三者酵母结构组成差异较大,且清茬曲含有最多的酵母数量和种类。酒醅发酵过程中的酵母种群结构与3种大曲均明显不同,大茬和二茬酒醅酵母结构也不同,两种酒醅发酵后期的优势酵母均为S.cerevisiae,而发酵前期优势酵母则分别是H.osmophila和P.membranifaciens。【结论】深入研究了清香型白酒酿造过程中微生物的分布特征和规律,对认识清香型白酒酿造过程和群体微生物的发酵机制,以及丰富我国传统酿造食品微生物的研究,具有重要的理论和实践价值。     

镇江香醋固态发酵醋醅中微生物总DNA提取方法比较

【目的】为了更加全面地分析我国传统固态发酵过程中微生物群落的多样性和演替情况,本文以镇江香醋固态发酵为例,对比研究了11种不同的总DNA提取法对醋醅中总DNA提取的影响。【方法】使用紫外分光光度计法和荧光定量PCR(Realtime Quantitative PCR)测定了不同提取方法得到的醋醅样品总DNA的产量与纯度,采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)法对固态发酵中细菌和真菌的多样性进行了分析。【结果】醋醅总DNA得率最高可达93.2±1.5μg/g干醅,细菌总数最高达到1.73×1013 copies.(g干醅)-1,真菌总数最高达到6.49×1012 copies.(g干醅)-1。不同的提取方法对DGGE结果有明显的影响,6种基于SDS裂解的方法所获得的条带较多。【结论】结果表明,液氮研磨+溶菌酶+SDS高盐抽提法(方法3)为最优的醋醅总DNA提取方法。     

用氨基葡萄糖含量的测定值间接表示红曲菌固态发酵过程中生物量的研究

【目的】为准确快速地了解紫色红曲菌固态发酵中生物量的变化,【方法】采用理化方法测定菌体量和氨基葡萄糖含量,研究了不同培养时间、培养基组成、培养方式下菌体量与氨基葡萄糖含量的关系,建立生物量和氨基葡萄糖含量的换算关系式;构建关联该菌固态培养物近红外光谱数据与实测氨基葡萄糖含量的PLS模型。【结果】建立了可通过近红外光谱法测定氨基葡萄糖来快速预测固态发酵生物量的方法,其中最优近红外模型的校正集内部交叉验证均方根误差(RMSECV)为0.209 4,预测集相关系数(Rp)和均方根误差(RMSEP)分别为0.993 4和0.217 3;同时利用所建的换算关系式也大大提高了生物量计算的准确性。【结论】基于所建立的生物量和氨基葡萄糖的换算关系式,利用近红外光谱法可以快速并且较准确地测定紫色红曲菌固态发酵过程中生物量的变化。     

酱香型与清香型白酒发酵过程中乳酸菌菌群的差异性分析

【目的】为认识乳酸菌在中国白酒酿造过程中的作用与影响, 分析、比较了酱香型与清香型白酒发酵过程中乳酸菌的菌群结构及其差异。【方法】运用PCR-DGGE技术分析酱香型与清香型白酒发酵过程中乳酸菌群的演变规律。并利用传统微生物分离筛选方法进一步确定酱香型白酒发酵中的主要乳酸菌种。【结果】DGGE图谱表明, 白酒发酵过程中的主要乳酸菌种是乳杆菌。但两种香型白酒发酵过程中乳酸菌群组成及动态变化均呈现出明显的差异。清香型白酒酒醅中Lactobacillus fuchuensis是优势菌种, 而酱香型白酒发酵中检测到多种含量较高的乳酸菌种。利用MRS培养基从酱香型白酒酒醅中共筛选获得5种乳酸菌种。通过两种方法, 确定Lactobacillus homohiochii是酱香型白酒发酵过程中含量最高的乳酸菌。【结论】深入研究白酒发酵过程中乳酸菌的组成及分布规律, 对于更好地认识中国白酒酿造中主要的细菌类群——乳酸菌的作用, 具有重要的理论意义和实践价值。     

酒醅中精氨酸利用菌株的分离筛选及其对浓香型白酒中瓜氨酸积累的影响

【目的】分析浓香型白酒酒醅发酵过程中氨基甲酸乙酯前体物质瓜氨酸含量显著增加的原因,确定酒醅中能够利用精氨酸并积累瓜氨酸的微生物,为解析白酒中氨基甲酸乙酯的形成机制提供研究基础和理论依据。【方法】采用高通量筛选技术,从浓香型白酒酒醅中分离具有高精氨酸利用能力和高瓜氨酸积累特性的菌株,并通过基因型和表现型验证以及模拟窖内发酵验证它们对瓜氨酸积累的贡献。【结果】共筛选获得20株具有高精氨酸利用能力的菌株,其中Lactococcus garvieae LD3,Bacillus amyloliquefaciens BG5,Pediococcus acidilactici PH7和Staphylococcus pasteuri SH11具有较高的瓜氨酸生成能力,并可使酒醅中瓜氨酸含量显著增加。【结论】筛选获得的4类微生物均能够通过ADI途径代谢积累瓜氨酸,是导致酒醅瓜氨酸含量增加的原因。     

酱香型白酒发酵中酵母群落结构及其对风味组分的影响

【目的】研究酱香型白酒发酵过程中酵母群落结构,及其对酱香型白酒生产的影响。【方法】通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)和实时荧光定量PCR(RT-q PCR)技术分别对产量、酒质较高的第五轮次和较低的第七轮次发酵过程中的酵母群落结构进行解析,同时利用顶空固相微萃取气质联用(HS-SPME-GC-MS)以及高效液相色谱(HPLC)技术分析酒醅中的代谢组分,初步分析了酵母群落对酱香型白酒产量及品质的影响。【结果】用DGGE方法从酒醅中的检测到Issatchenkia orientalis、Torulaspora delbrueckii、Pichia galeiformis、Schizosaccharomyces pombe、Galactomyces geotrichum、Trichosporon asahii、Zygosaccharomyces bailii、Saccharomyces cerevisiae和Pichia fabianii等9种含量丰富的酵母,其中G.geotrichum和S.cerevisiae是第五轮的优势酵母,而第七轮的优势酵母增加了I.orientalis和Z.bailii两种酵母,且Sc.pombe未检测到。第七轮发酵过程中5种酵母在发酵后期衰亡明显,第五轮酵母群落结构相对更稳定;发酵前期第五轮酵母总量是第七轮的2–5倍,而发酵结束时第五轮乙醇含量达到第七轮次的2.45倍。酒醅中挥发性风味组分种类丰富,第五轮中酯类等白酒中重要的风味物质含量明显高于第七轮,有机酸和杂醇油含量低于第七轮。【结论】酱香型白酒酿造过程中酵母菌群多样性较丰富,酵母菌群结构变化对白酒产量及品质影响明显,这为酱香型白酒酿造机制研究奠定了基础。     

浓香型白酒发酵过程微生物合成正丙醇途径解析

【目的】揭示浓香型白酒窖内发酵过程与正丙醇合成相关的微生物和代谢途径。【方法】通过对浓香型白酒窖内发酵过程酒醅中微生物的宏转录组进行分析,解析与正丙醇合成相关的微生物和代谢途径,并验证相关微生物合成正丙醇的能力。【结果】浓香型白酒窖内发酵过程中有3条可能的酒醅微生物合成正丙醇的途径。真菌主要通过2-甲基苹果酸代谢途径和苏氨酸代谢途径合成正丙醇,细菌则主要通过丙酸代谢途径合成并参与苏氨酸代谢途径。宏转录组测序分析表明,这3条途径对白酒窖内发酵过程正丙醇的合成与积累均有贡献,并且微生物通过这3条途径合成正丙醇的时期和能力存在较大差异。此外,对分离自酒醅的酵母和乳酸菌合成正丙醇能力分析发现,它们均与浓香型白酒窖内发酵过程正丙醇的合成有关。【结论】本研究揭示了浓香型白酒窖内发酵过程中正丙醇合成相关的微生物和代谢途径,为阐明白酒发酵过程中正丙醇的形成机制奠定了理论基础。     

芝麻香型白酒发酵过程中乳酸菌多样性及其演替规律

【背景】乳酸菌是白酒发酵过程中一类非常重要的微生物,其种类及动态变化对于白酒品质具有重要影响。然而,目前对于芝麻香型白酒发酵过程中乳酸菌群落结构及其演替规律的认识并不全面。【目的】揭示芝麻香型白酒发酵过程中乳酸菌的多样性及菌群的演替规律,为更好地探索白酒酿造机理和控制白酒品质提供生物学依据。【方法】利用高通量测序技术对芝麻香型白酒发酵过程中乳酸菌菌群演替进行跟踪分析,同时采用实时荧光定量PCR对发酵过程中乳酸菌的生物量进行定量分析。【结果】高通量测序结果显示,芝麻香型白酒发酵过程涉及5个属的乳酸菌:魏斯氏菌属(Weissella)、片球菌属(Pediococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)和乳球菌属(Lactococcus),共计43种乳酸菌。其中,在发酵过程中平均相对丰度大于0.5%的乳酸菌有10种,分别是类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)、食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)、融合魏斯氏菌(Weissella confusa)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)和Lactobacillus sp.。在堆积发酵过程中,Weissella属占细菌总量的50%以上,其次是Pediococcus属和Lactobacillus属,而Leuconostoc属和Lactococcus属相对较少。在窖池发酵过程中Lactobacillus属的乳酸菌逐渐成为优势细菌,尤其是Lactobacillus sp.在窖池发酵中后期相对丰度达到80%以上。实时荧光定量PCR结果显示,在堆积发酵和窖池发酵前期乳酸菌总量变化不大;从窖池发酵5 d开始,乳酸菌总量迅速上升,30 d时达到最大值。【结论】对白酒发酵过程中乳酸菌种类及动态变化的研究有助于探究白酒酿造过程中乳酸菌功能,进而解析白酒酿造机理,最终达到控制白酒品质的目的。     

河南浓香型酒醅的真菌微生物菌群多样性及共变性

通过高通量测序研究河南三个不同酒厂的浓香型酒醅的真菌微生物菌群,逐次在门、纲、目、科和属5个水平上分析入窖酒醅和出窖酒醅的菌群多样性,探究酒醅发酵后菌群的共性变化规律.结果表明:出窖酒醅的真菌微生物多样性高于入窖酒醅的真菌微生物多样性,出窖酒醅的真菌主要有镰刀菌属Fusarium(相对丰度17％ ～32％),Plect...     

基于三步荧光定量PCR技术揭示不同产区白酒酿造系统中Lactobacillus sp.的分布特征

[背景]Lactobacillus sp.是一株存在于白酒酿造系统中的功能微生物,但是针对Lactobacillus sp.的定量方法及其在中国白酒酿造系统中的分布尚未被研究。[目的]建立一种基于特异性引物的荧光定量PCR定量方法,并应用于实际生产检测,揭示Lactobacillus sp.在中国白酒酿造系统中的分布特征。[方法]基于16S rRNA基因序列设计特异性引物,并通过PCR验证引物特异性;优化荧光定量PCR反应程序,提高引物扩增效率;定量分析所采集样本中Lactobacillus sp.的含量,揭示Lactobacillus sp.在中国白酒酿造系统中的分布特征。[结果]设计了一对扩增产物大小为445 bp的特异性引物。通过优化扩增条件,构建含有变性、退火、延伸过程的三步荧光定量PCR方法,该方法扩增线性较强,R²>0.99;灵敏度高,定量限为17.9 copies/μL;重复性好,Ct值的变异系数小于1%。跟踪检测全国10个产区代表产地的白酒酿造系统,其中8个产区均检测到Lactobacillus sp.,在相同产地不同酿造工艺的酿造系统中均检...     

洋河浓香型白酒发酵过程酒醅微生物群落结构解析及其与有机酸合成的相关性

【目的】解析江苏洋河酒厂浓香型白酒窖内发酵过程酒醅微生物群落结构,建立酒醅微生物与主要有机酸合成的关联性。【方法】通过宏基因组测序获得白酒发酵过程中微生物群落结构变化规律,利用主成分分析和偏最小二乘回归分析寻找酒醅中影响主要有机酸合成的关键微生物。【结果】根据微生物组成结构变化和有机酸合成变化规律,可将白酒窖内发酵分为两个时期(0–14 d和15–60 d)。其中窖内发酵0–15 d与主要有机酸合成相关的微生物数量显著高于15–60 d的。窖内发酵过程与主要有机酸合成相关的微生物包括7个菌属,分别为乳杆菌属(Lactobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、酵母属(Saccharomyces)、Naumovozyma、伊萨酵母属(Issatchenkia)、嗜冷芽孢杆菌属(Psychrobacillus)和根霉属(Rhizopus)。【结论】本研究识别了白酒窖内发酵过程中与主要有机酸合成相关的核心和关键微生物,可为阐明白酒窖内发酵产酸机理和保障白酒品质的稳定性奠定研究基础和理论依据。     

Analysis and comparison of the bacterial community in fermented grains during the fermentation for two different styles of Chinese liquor

Bacterial populations in fermented grains during fermentation may play important roles in Chinese liquor flavor. PCR-based denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and 16S rRNA gene library analysis were performed to analyze the bacterial community structure of two styles of liquor. The results of DGGE profiles showed that bacterial diversity decreased with the fermentation process and Lactobacillus acetotolerans became the predominant species at the end of the fermentation. But the obvious differences of bacterial community appeared in the middle stage of two styles of liquor fermentation, in which the different upstream production techniques were used. Moreover, 16S rRNA gene libraries of two styles were constructed. A total of 125 and 107 clones, chosen from two libraries, were grouped into 46 and 49 operational taxonomic units (OTUs) by amplified ribosomal DNA restriction analysis. According to sequencing results of clones, the predominant bacteria in strong aroma style fermented grains were those from the class Bacilli, Bacteroidetes, and Clostridia, whereas the predominant bacteria in fermented grains of roasted sesame aroma style belonged to Bacilli, Flavobacteria, and Gammaproteobacteria. Molecular analysis of the bacterial diversity of the liquor fermentation will benefit the analysis of important microorganisms playing key roles in the formation of liquor flavor components.