黄瓜花叶病毒的株系鉴定研究进展

黄瓜花叶病毒的株系鉴定研究进展李华平,胡晋生,范怀忠（华南农业大学植保系,广州５１０６４２）（夏威夷大学植病系,美国夏威夷９６８２２）关键词黄瓜花叶病毒,株系种类,株系鉴定ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｕｃｕｍｂｅｒＭｏｓａｉ...     

菜豆黄色花叶病毒(BYMV)—新疆苜蓿分离株的鉴定

从新疆苜蓿黄斑花叶病株上分离到病毒分离物M-4,该分离物能引起多种豆科值物系统花叶,并在藜科植物上产生局部褪绿斑,易经汁液摩擦接种和蚜虫传毒,不经菜豆种子传毒。病毒致死温度60—65℃,体外保毒期4—5天,稀释限点10~(-3)—10~(-4)。病毒粒体线状,长约660—740nm,宽15nm;在感病的寄主叶片细胞中,电镜观察到风轮状、带状和环状内含体。免疫电镜法测定,该分离物与菜豆黄色花叶病毒(BYMV)抗血清有血清反应。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和氨基酸自动分析仪分析分别测得该病毒的衣壳蛋白亚基分子量为16,200道尔顿,氨基酸残基数128个。鉴定结果认为,分离物M-4是BYMV的一个株系。     

樱草花叶病毒的分离与鉴定

樱草(Primula obconica),又称报春花,是早春季节人们喜爱的一种花卉。近年来,患病严重,病株的叶片呈现花叶、畸型、翻卷等症状,影响观赏。关于樱草花叶病毒在国内未见报道。本文简要报道樱草花叶病毒的分离与鉴定(以下简称PMV)。     

烟草花叶病毒RNA双链复制型的分离和鉴定

用”P标记感染了TMV‘的普通烟草,从叶组织中提取总RNA,井用纤维素柱层析分离,得到了TMV-RNA的复制型。它在高离子强度下抗Rnase,在低离子强度下对Rnase敏感,并具有能自我退火和能与TMV-RNA杂交等性质。用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得其分子量为3．8×106。根据以上性质可以确认它是对TMV-RNA有专一性的双链RNA。     

核酸酶保护试验在黄瓜花叶病毒株系鉴定中的初步应用

采用黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）亚组Ⅰ株系Ｆｎｙ－ＣＭＶＲＮＡ＿２的１２０９～１６２６核苷酸片段和亚组Ⅱ株系Ｌｓ－ＣＭＶＲＮＡ＿２的２００２～２４３３核苷酸片段的ｃＤＮＡ克隆,体外转录,同时掺入￣（３２）Ｐ获得负链ＲＮＡ探针,与纯化的番茄和甜椒上的ＣＭＶ中国分离物的ＲＮＡ杂交,结果表明：ＣＭＶ番茄和甜椒中国分离物与Ｆｎｙ－ＣＭＶ的核苷酸有高度同源性,隶属于Ｆｎｙ－ＣＭＶ为代表的亚组Ⅰ株系。并利用Ｋ－ＣＭＶ株系（亚组Ⅰ,源于中国）的ＲＮＡ＿２全长ｃＤＮＡ克隆的两个ＥｃｏＲＩ位点间的核苷酸序列（１６５７～２１２５ｎｔ）作探针,与上述两种ＣＭＶ中国分离物的ＲＮＡ杂交,进一步比较分析了这两个分离物和Ｋ－ＣＭＶ株系的关系。讨论了核酸酶保护法在ＣＭＶ株系鉴定中的作用。     

含卫星RNA的黄瓜花叶病毒弱株系的分离鉴定及在病毒病防治上的应用

从豌豆上分离获得黄瓜花叶病毒分离物ＣＭＶＰ１,摩擦接种９科２９种植物,ＣＭＶＰｌ在大多数植物上症状很轻或无任何症状,提纯的病毒颗粒为球形,直径约２８ｎｍ,病毒衣壳蛋白亚基分子量约２７．５ｋＤ,所含核酸有五个组份,即ＣＭＶＰ１含有卫星ＲＮＡ。ＣＭＶＰ１接种三生烟后８－１２天内呈轻花叶,此时组织中病毒含量最高,随后症状消失,去除卫星ＲＮＡ能加重ＣＭＶＰ１在番茄上的症状,因而是卫星ＲＮＡ减轻了ＣＭＶＰｌ的病状。当ＣＭＶＰ１保护接种番茄后攻强毒,番茄发病率低,病情轻,保护率达９０％以上,并有一定的刺激生长作用,还能提早开花４天,植株结果数增多,成熟果实的颜色、形态、品质和重量均正常。ＣＭＶＰ１对烟草亦具有很好的保护效果。保护接种的植株能明显减少强毒株侵染,可减少９０％以上。     

苜蓿花叶病毒沉降系数的分析

苜蓿花叶病毒是一种多组分病毒,提纯的病毒样品中有五种不同形态的颗粒。在白三叶草分离物中的苜猪花叶病毒的鉴别研究中,使用超速离心分析法进行了该病毒的理化特性分析。在分析测试中我们使用了Schlieren光路与紫外吸收光路对照,二次变速法,配合适当的样品浓度和离子强度。获得了较为理想的可供分析计算的五个样品组分的扫描记录图,并得到了该五种组分颗粒的沉降系数S值,分别为S_zow=98s S₂₀₀₂=82s S₂₀₀₁=72s S_20w<     

小苍兰褪绿条纹花叶病毒的分离鉴定

从表现褪绿条纹花叶症状的小苍兰(Freesia hybrida)上分离得到一种棒状病毒,能感染茄科、藜科、苋科、玄参科和葫芦科的部分植物。病毒粒子长500—575nm,直径13nm。外壳蛋白由一种分子量17500dalton的蛋白亚基组成。纯化的病毒制剂具有典型的核蛋白紫外吸收,A260/A280为1.39。稀释终点10~(-7),致死温度约为95℃,在4℃下体外保毒期大于6个月。排蚜不能传毒。病毒与PVX有血清学关系。实验表明,该病毒属于马铃薯X病毒群,不同于已报道的感染小苍兰的其它病毒。本文还讨论了小苍兰褪绿条纹花叶病毒的控制和检测问题。     

云南蚊虫中阿卡斑病毒的分离和鉴定

为掌握云南省德宏州芒市和瑞丽市蚊媒病毒分布状况,2010年8月用诱蚊灯采集蚊虫17种2 149只,用金黄地鼠肾细胞(Baby hamster kidney cell,BHK-21)培养法分离病毒,阳性分离物用阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)S和M片段特异性引物的RT-PCR法鉴定。从采集蚊虫中分离到能引起BHK-21细胞病变和致乳小白鼠发病死亡的2株病毒,其中DHL10M110株分离自瑞丽市迷糊按蚊(Anopheles vagas),DHL10M117株分离自芒市三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)。RT-PCR扩增获得S片段的702bp序列和M片段的456bp序列,系统进化树分析表明DHL10M110和DHL10M117株与肯尼亚和澳大利亚AKV分离株进化关系较远;与日本、韩国和中国台湾的AKV分离株亲缘关系较近,但云南株形成一个独立的小分支。2株新分离病毒的S片段与中国台湾CY-77株的核苷酸(96.6%和96.7%)和氨基酸(99.6%和100%)同源性最高;M片段与日本Iriki株的核苷酸同源性最高(93.2%和93.6%),与中国台湾CY-77株氨基酸同源性最高(99.6%和100%);与肯尼亚MP496株核苷酸(69.7%和70.0%)和氨基酸(91.0%)同源性最低。本研究证实云南省德宏州存在AKV的流行,与亚洲流行株具有较近的亲缘关系。三带喙库蚊和迷糊按蚊可传播该病毒。     

侵染香蕉的黄瓜花叶病毒株系的形态和生物学特征

对香蕉花叶病广东三个代表分离物的形态和生物学特征进行了较为全面的研究。在六种鉴别寄主上,斑驳类（ＭＭ）和断续条纹类（ＢＳ）分离物侵染较多的寄主种类诱导较为严重的症状,连续条纹类（ＣＳ）分离物侵染能力较弱。电镜观察表明：ＢＳ、ＣＳ和ＭＭ三个代表分离物的粒子呈球状、其粒子直径分别为２２．５、２４．３和２７ｎｍ,纯化的病毒粒子电泳相对迁移率分别为０．７２、０．５６和０．５１,在西葫芦上的增殖速度：不管在子叶或真叶,都是ＭＭ最快、ＢＳ次之、ＣＳ最慢。从西葫芦接种叶运转出接种叶的速度：ＭＭ和ＢＳ相似、ＣＳ明显较慢。在烟草上,三个分离物的运转速度和增殖速度以ＭＭ最快、ＢＳ次之、ＣＳ最慢;而且在烟草上随着接种后时间的延长,三个分离物除ＭＭ维持高浓度的时间较长外,ＢＳ和ＣＳ的都很短。在西葫芦和烟草上提纯产量,ＭＭ类最多、ＢＳ类次之、ＣＳ类最低。     

苜蓿花叶病毒(AMV)白三叶草分离物-Wc的研究

在西北农业大学校园内的白三叶草上分离到Wc分离物。该分离物经汁液摩擦接种莱豆和豇豆只产生局部坏死斑,在烟草上为系统侵染。致死温度为55℃,体外保毒期为12—24小时,稀释限点为10~(-2)—10~(-3)。琼脂双扩散试验表明Wc分离物与AMV抗血清有明显的沉淀反应。部分提纯制品在电镜下有5种形态:宽度一致(18—20nm),长度分别为58、52、41和31nm,第5种粒子近球形。病毒粒子经3％凝胶电泳,染色扫描后有4个峰。超速离心分析有4个主峰,其沉降系数分别为S_(20.w)=98s(B组份),82s(M组份),72s(T_b组份),和65s(T_a组份)。鉴定结果表明Wc是AMV的一个分离物。降解病毒所得总核酸(未变性)经聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了4种核酸的分子量如下:RNA_1=1.3×10~6,RNA_2=1.0×10~6,RNA_3=0.8x10~6,RNA_4=0.3×10~6。     

黄瓜花叶病毒香蕉株系的衣壳蛋白基因克隆和序列分析

对侵染香蕉的黄瓜花叶病毒广东３个株系的衣壳蛋白（ＣＰ）基因,进行了克隆和序列分析,以提纯病毒ＲＮＡ为模板,应用ＲＮＡ反转录酶（ＡＭＶ）合成ＣＰ基因ｃＤＮＡ再用ＴａｑＤＮＡ聚合酶进行ＰＣＲ扩增,通过常规基因克隆法扩增的ＣＰ基因克隆入载体,选取每一株系的ＣＰ基因与载体表面方向相同和相反的各一个克隆,进行插入片段的全序列分析,结果表明,每一重组克隆测序长约７５０个核苷酸,任一株系其插入方向相反的两个重组     

马铃薯杂种无性株系的SSR鉴定及花粉育性和染色体构型分析

为明确马铃薯‘MB09’ב陇薯7号’杂种F1无性株系在DNA和细胞遗传学水平上的差异,该试验以亲本材料为对照,利用SSR分子标记技术对其20个优良无性株系(F1无性系一代)的DNA指纹特征进行分析,并采用常规制片镜检方法对已选出的8个杂种优良株系(F1无性系二代)的花粉育性及花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ(PMCMⅠ)的染色体配对构型进行了研究,为马铃薯杂交新品系选育提供分子细胞遗传学依据。结果显示:(1)试验共筛选出2对SSR特异引物C57和S25,通过PCR扩增建立了能识别出这20个杂种株系及其双亲的SSR指纹图。(2)杂种优异株系F1-1、F1-2、F1-7、F1-11、F1-13、F1-14、F1-15和F1-20的花粉可育率变幅为36.73%~87.08%,并以株系F1-7最高(87.08%),而且显著超过高亲(83.33%),说明各优良株系花粉育性有一定差异。(3)对8个优异株系花粉母细胞的PMCMⅠ观察发现,各优良株系的染色体配对构型明显不同,均包括单价体、二价体、三价体和四价体4类,其中二价体构型的比例最高,其介于49.13%~82.91%之间,其中以株系F1-7的二价体比例最高(82.91%)。该研究明确了20个马铃薯杂种优良株系的SSR指纹特征和8个优异株系的花粉育性及染色体配对构型差异。     

马铃薯杂种F1无性株系的ISSR鉴定

为给马铃薯新品种选育提供可靠材料,采用ISSR分子标记对2个马铃薯杂交组合‘J07-4’ב陇薯6号’和‘J07-6’ב陇薯6号’杂交种F₁无性繁殖株系的真实性进行了鉴定。结果从152个ISSR引物中筛选出适于‘J07-4’ב陇薯6号’杂种F₁ 5个无性株系鉴定的3个ISSR引物AF18550、AW75511和AW20617及‘J07 6’ב陇薯6号’杂种F₁ 7个无性株系鉴定的2个ISSR引物AW20607和AF18549;以子代中含有父本特征带为主要依据,鉴定出杂种F₁共12个无性繁殖株系均为真实的杂交种,并建立了杂种F₁不同无性株系间的ISSR指纹图。表明ISSR分子标记技术用于马铃薯杂种F₁无性株系鉴定是可行的。     

侵染香蕉的黄瓜花叶病毒株系的血清学特征

香蕉花叶病三类不同症状,即断续条纹类（BS）、连续条纹类（CS）和斑驳类（MM）在田间广泛存在,经过血清学、生物学、核酸斑点杂交和反转录聚合酶链反应,已确定它们都由黄瓜花叶病毒（Cucumberm。。i。virus,CMV）所弓愧f’］。这三类症状分离物在鉴别寄主、粒子形态、粒子电泳相对迁移率以及在西葫芦（CI;curbitafor）和烟草（Nicotianatabacumcv．HV38）上增殖和运转动力学的特征也表现不同［’］。这些不同可能揭示了香蕉三类分离物分属不同的株系。血清学是鉴定和研究CMV株系间亲缘关系的重要依据。大量文献【’,‘1报道…     

我国大麦条纹花叶病毒的研究 Ⅱ.核酸组分的分离和鉴定

新疆小麦上分离到的大麦条纹花叶病毒(BSMV-XJ),经2.4%聚丙烯酰胺和0.5%琼脂糖凝胶电泳检出四个组分,与Argentina Mild 和North Dakota 161毒株的RNA 组分数相同。分离的BSMV-XJ 的单个RNA 组分没有侵染性,四个RNA 组分的混合物有侵染性,说明侵染性需要一个以上的RNA 组分。培养病毒的温度似对各组分的含量有影响。BSMV-XJRNA 经单分子展层后,在电镜下观察伸展的没有折迭卷曲的线状分子,其中有些分子长度约1,200～1,300毫微米,正好相当于其RNA 链的长度。     

大豆5个花叶病毒株系抗性基因的定位

以科丰 1号×南农 1138 2为亲本构建的RIL群体NJRIKY为材料 ,对群体进行了 5个SMV株系 (Sa、Sc 8、Sc 9、N1 、N3)的抗病性鉴定。结果表明 :大豆对 5个SMV株系的抗性均受一对显性基因控制。用Mapmaker 3 0进行连锁分析 ,发现Rsa与Rn1、Rn3和Rsc9均连锁 ,距离分别为 2 1 4cM、2 3 5cM和 35 3cM ;Rsc8只和Rn1连锁 ,距离为 35 8cM ;Rn1和Rn3之间的遗传距离最近 ,为 10 2cM。多点分析结果表明 :5个抗病基因的排列顺序和遗传距离为Rsc8 35 8cM Rn1 10 3cM Rn3 2 1 5cM Rsa 35 8cM Rsc9。根据RFLP、SSR标记分析结果构建了一套大豆遗传图谱 ,该图谱包含 2 2个连锁群、2 5 6个标记 ,总遗传距离为 30 5 0 9cM。将 5个抗病基因定位于N8 D1b W连锁群 ,有 3个RFLP标记和Rn1、Rn3都连锁 ,分别为A6 91T、K4 77I、LC5T。它们与Rn1、Rn3的距离分别为 15 0 4cM、17 82cM、15 37cM和 16 14cM、17 82cM、16 5 8cM。     

一株牛源阿卡斑病毒的分离鉴定

阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)是能引起牛、绵羊、山羊流产、早产、新生胎儿畸形的虫媒性RNA病毒。为了解家畜虫媒病毒在我国西南边境地区的分布和流行情况,本研究对中缅边境西盟县的52份牛抗凝血和140份血清(牛70份、羊70份)中的蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、鹿流行性出血热病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)、AKV等虫媒病毒进行检测与分离,通过ELISA及qRT-PCR方法检测病毒,通过核酸阳性抗凝血接种BHK细胞传代以分离病毒,通过设计特异性引物,扩增分离毒株S基因721bp片段及M基因816bp片段,通过克隆测序及中和试验以鉴定病毒,最终从38号牛的抗凝血中分离到一株AKV,TCID50为10-3.5/0.1mL,经比对,分离株S片段与日本KS-2/Mo/06毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为97.66%,M片段与中国DHL10M110毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为96.56%。本研究首次报告了从云南边境地区牛群中分离到AKV,证实了西南边境存在AKV的流行,为AKV在我国的流行病学和边境地区疫病风险防控提供了重要参考及有力依据。