木瓜蛋白酶的研究 Ⅱ.转酰基作用

本文提供以茚三酮法测受体α-氨基减少的方法以测定转肽反应。木瓜蛋白酶于50%甲醇,pH7.4左右条件下以CbZ-甘-NH_2,Cbz-白-NH_2及Cbz-丝-NH_2为供体,以甘-OEt为受体几乎只进行转肽作用而无供体本身的水解,但在30%丙酮溶液中却以水解反应为主。半胱氨酸、谷胱甘肽、氰化物、亚硫酸盐、[2,3]-二巯基丙醇及巯基乙酸皆可促进木瓜蛋白酶的转肽作用,但高浓度的[2,3]-二巯基丙醇及巯基乙酸与其他还原剂不同对转肽有抑制作用。转肽与水解的专一性不完全相同,如以Cbz-甘-NH_2,Cbz-丝-NH_2及Cbz-白-NH_2做供体时,几乎只进行转肽而无供体水解,但以Bz-精-NH_2及Cbz-谷NH_2-NH_2为供体时都无转肽作用。受体以氨基酸或肽的酯或酰胺为最好,酪氨酸乙酯不能做为转肽反应的受体。以Cbz-甘-NH_2,甘-OEt为供受体时底物浓度对反应速度的影响指出,受体与酶的结合远较供体紧密。甘-OEt的存在使木瓜蛋白酶于250mμ处光吸收有显著降低,并且对木瓜蛋白酶于甲醇溶液中的失活具有保护作用,说明受体与酶系专一性的结合。对本文实验结果的意义进行了讨论。     

木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶的研究——ⅥⅠ.无花果蛋白酶对不同底物的作用

观察无花果蛋白酶对一些合成底物作用的结果,说明酶的专一性和木瓜蛋白酶相似。它的特点是在pH7.4对白-NH_2的作用速度此对Bz-精-NH_2水解速度还快,并且在一定条件下只有白-NH_2的聚合反应而无供体的水解。酶作用于白-NH_2及Bz-精-NH_2共同存在时的反应速度也和木瓜蛋白酶相似,为在相同条件下分别作用于二者的速度之和。但从对氯汞苯甲酸和溴代乙酸的抑制看来,这两种活力是由同一酶所催化,可能酶对于二种反应的活性中心不完全相同。     

青鱼腸胃道中蛋白酶的初步研究

(1)从淡水魚青魚腸胃道中提取出魚蛋白酶,酶制剂活力以酪蛋白作底物約为結晶胰蛋白酶的1/3。酶的前身有酶原存在,激活最适pH为8。(2)酶作用的pH偏于碱,水解酪蛋白和B-精-NH_2的最适pH都为9,酶和酶原对酸都不稳定,当pH低于4吋,酶活性和酶原激活的能力迅速丧失。(3)此酶对热很稳定,反应温度55度时,反应速度仍符合Arrhenius定律。測得水解酪蛋白和B-精-NH_2的活化能分别为14.6千卡/克分子及8.0千卡/克分子,較之胰蛋白酶水解此同一底物所需的活化能为低,尤以后者更显著,約相当于1/2值。(4)对小底物的水解以B-精-NH_2活力最高,K_m=3.3×10~(-3)M(40度pH8.7),为胰蛋白酶水解此同一底物所得K_m值的二分之一,对胰凝乳蛋白酶的底物B-酪-NH_2不作用,而对Cbz-甘-苯丙及白-NH_2却有較明显的活力。(5)半胱氨酸(10~(-3)M)和PCMB(10~(-4)M)对酶活力无影响,但能被DFP和胰蛋白酶抑制剂所抑制。DFP的抑剂随其与酶保温时間的增长而增大。lO~(-4)MDFP与酶液保溫10小时后能抑制酶活力达60%。胰蛋白酶抑制剂对此酶抑制的作用与抑制胰凝乳蛋白酶相类似。(6)从青魚腸胃道中找到有类胰蛋白酶抑制剂的存在。对魚本身蛋白酶有显著的抑制作用,对胰蛋白酶亦能抑制,但抑制能力較弱。     

乙醇溶液对木瓜蛋白酶催化活性的影响

研究了乙醇溶液对木瓜蛋白酶水解酪蛋白的催化活性及构象的影响。结果表明,木瓜蛋白酶在一定浓度乙醇溶液中水解酪蛋白的活性有显著上升。动力学测定表明木瓜蛋白酶在乙醇溶液中米氏常数（Km）下降。差示光谱显示,在乙醇溶液中木瓜蛋白酶的二级结构发生了变化。荧光发射光谱表明,木瓜蛋白酶在乙醇溶液中发射峰位几乎没移动,但发射强度明显增高。     

猪腎脏羧肽酶的提取及其性质的研究

(一)从猪腎脏組織細胞內抽提出一新羧肽酶制剂,能水解牛胰羧肽酶A,B的底物Cbz-甘-苯丙及B-甘-精及其他各种带有Cbz的合成肽。此酶具有較广的专一性,能作用于一般蛋白水解酶和肽酶所不能水解的脯-賴(ε-Tos)或脯-賴间的肽鍵。(二)酶的最适pH在7.5—8.0之間,不被DFP和PCMB所抑制,但能被較高浓度的碘乙酰胺(0.01M)所抑制。对大多数底物酶的反应属于零級反应。(三)酶对10~(-3)MEDTA透析后,活力全部丧失。如加入Co~( ),Mn~( )或Ca~( )等离子能部分或全部恢复酶的活力,但加入Co~( )却能使酶活力提高二倍以上。(四)初步将猪腎脏羧肽酶应用于C端氨基酸組成的測定,并取得較滿意的結果。     

双酶法制备螺旋藻多肽的工艺研究

选用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶结合的双酶法对螺旋藻蛋白进行水解。其中,对木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白的工艺进行优化。以水解度为指标,研究了酶解时间、酶与底物比、pH和酶解温度4种因素对酶解反应的影响。在此基础上设计了3因素(加酶量、酶解温度和pH)3水平的响应面试验。结果表明碱性蛋白酶水解螺旋藻蛋白的最佳酶解条件为:加酶量4300 U/g,pH 7.0,酶解温度55℃,酶解时间160 min;木瓜蛋白酶的最佳酶解条件为:酶底比为4.5%,酶解温度60℃,pH 6.5,酶解时间210 min。利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶结合的双酶法制得的多肽水解度可达32.90%,与单酶法相比,水解度明显提高。     

几种蛋白酶对文蛤肉的酶解工艺条件研究

以文蛤为原料,水解度为指标,从胰蛋白酶,木瓜蛋白酶,胃蛋白酶和风味蛋白酶中选出水解效果较好的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶.并通过实验确定了胰蛋白酶,木瓜蛋白酶单酶水解及两者组合复合酶解文蛤肉的最佳工艺.结果表明:复合水解效果最佳.最佳工艺:先添加胰酶6000 u/g(原料),水解温度50℃,固液比1:3(V/W),pH 8.0,在此条件下水解6 h;然后改变条件,温度55℃,pH 5.5,底物浓度1:3(V/W),添加木瓜蛋白酶2000 u/g(原料),在此条件下水解2 h.通过实验验证,胰蛋白酶和木瓜蛋白酶组合在该条件下对文蛤肉蛋白具有较好的水解效果,其水解度为28.15%.     

一种不对称水解（R,S）-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的新酯酶基因的克隆表达和酶学性质研究

本文将来自反硝化无色杆菌Achromobacterdenitrificans1104的酯酶基因EHest,转化大肠杆菌中,成功表达了具有不对称水解农药甲霜灵的中间体(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯( MAP )活性的酯酶EHesterase。用重组酯酶EHesterase催化MAP 的水解,底物浓度50 g/L,反应1h的转化率29.5%,产物( R-酸)的eep 是85.1%。该酶的最适反应pH和温度分别为9.0和50℃,在50℃以下和pH5~9之间具有较好的稳定性。该酶水解MAP 的米氏动力学参数Vm、Km 分别是0.733 g/(L·min)和7.49 g/L。加入10%DMSO对酶EHesterase的立体选择性和催化速度有一定的促进作用。 Cu2+、Fe3+对酶活有明显抑制作用。该酶水解MAP 的活性与水解p-对硝基苯乙酸酯的活性数量级相当,是水解橄榄油活性的333倍。     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅵ.白氨酰胺的聚合作用

木瓜蛋白酶于pH7在半胱氨酸存在下能催化白氨酰胺生成聚白氨酸,聚合物分子量約为1,200,过程中只有聚合作用并无白氨酰胺的水解。当反应系統中同时有苯丙氨酸甲酯存在时則生成白氨酸与苯丙氨酸之比为1∶1的,分子量約为1,400的共聚物。虽然从酶制剂的均一性,离子交換柱层析时活力的平行分布以及溴代乙酸的抑制看来,轉酰基反应和水解反应一样都是由木瓜蛋白酶所催化的,但根据白氨酰胺与苯甲酰精氨酰胺同时存在时的总反应速度为二者在相同条件下分別作用速度之和,催化白氨酰胺聚合的pK_b为5.3与苯甲酰精氨酰胺水解的pK_b值(3.3)显著不同,以及N-溴代琥珀酰亚胺对水解和聚合作用的影响也不相同等看来,木瓜蛋白酶催化水解与聚合作用的活性中心很可能不完全相同。     

皮状丝孢酵母同步利用葡萄糖/木糖的糖转运动力学

皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)能够同步利用葡萄糖和木糖生产油脂。以2-脱氧葡萄糖(2-DOG)为底物,考察皮状丝孢酵母糖跨膜运输的转运动力学。结果表明:2-DOG转运符合米氏方程,表观米氏常数K m为0.19 mmol/L,最大转运速率V max为14.1 nmol/(min·mg)。葡萄糖和木糖均竞争性抑制2-DOG转运,葡萄糖表观抑制常数K i远低于木糖,表明存在一个共用转运体系,且该转运体系对葡萄糖亲和力更高。大量木糖与2-DOG同时转运到胞内,进一步说明木糖与葡萄糖共运输。代谢抑制剂和pH对糖转运有明显影响,说明质子/底物同向运输系统是该酵母的主要糖转运系统。     

抑制剂影响生成两个酶中间物系统的动力学

我們用稳态的方法处理了抑制剂存在下,酶作用于一个底物,生成两个酶中間的系統,得到了該系統的动力学方程。根据微扰項消失的条件討論了用Lineweaver-Burk法作图时得到直綫关系的条件。当在不同的抑制剂浓度下,得到一組直綫交于第二象限或横軸时,則有K_1=K的关系。并且只有k_(+2)>>k_(+3)时,米氏常数才等于米氏絡合物的解离常数,亦即Botts和Morales的結論也能够在这个系統适用。此外对于在k_(+2)>k_(+3),和k_(+2)=k_(+3)的情况下,米氏常数与平衡常数之間的关系也进行了討論。应用本文推导的动力学方程,討論了胰凝乳蛋白酶,木瓜蛋白酶和半乳糖苷酶的动力学行为。鉴于一些轉換酶、裂解酶、(?)构酶、合成酶甚至于氧化还原酶也都包含两个酶中間物。本文的討論可能具有較为普遍的意义。     

木瓜蛋白酶酶解鱼鳞提取胶原蛋白的工艺研究

用木瓜蛋白酶水解鱼鳞提取胶原蛋白,对影响酶解过程的的主要因素(酶量、温度、底物浓度)分别作为单因素进行了实验。并通过正交实验得到鱼鳞胶原蛋白提取条件的优化组合,同时对提取物进行了分析检测。结果表明,木瓜蛋白酶对鱼鳞有较好的水解效果,酶用量宜采用4g/L,最佳温度为60℃,底物浓度宜选择20%。     

木瓜蛋白酶水解壳聚糖的工艺研究

本文通过正交试验对木瓜蛋白酶水解壳聚糖的工艺进行优化,并对降解过程中粘度、还原糖等一些指标的动态变化进行研究。结果显示,木瓜蛋白酶在反应温度45℃下降解壳聚糖的最佳工艺条件为壳聚糖的脱乙酰度70%,pH4.0,底物浓度1%,壳聚糖与酶的比例为25∶1(w/w)。其中底物脱乙酰度对酶解效果影响呈极显著水平,pH值影响呈显著水平。木瓜蛋白酶可较为有效地降解脱乙酰度为70%的壳聚糖,在其最适条件下对壳聚糖水解约60min,可控制产物平均分子量在1万以内。木瓜蛋白酶起始降解速率很快,20min后VDP变化趋于平稳,60min后基本维持在93～94%上下。反应进行60min后产物的平均分子量约为9000。还原糖含量在反应进行150min之后,还原糖的生成速度基本趋于平稳。     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅳ.活性中心组氨酸残基的羧甲基化

(1)在过量半胱氨酸存在下微量溴代乙酸或碘代乙酸在pH5对木瓜蛋白酶有強烈的抑制作用,当抑制剂与酶的克分子比为0.5时,抑制即达完全。抑制前后木瓜蛋白酶巯基含量不变。溴代乙酸作用后所得到的羧甲基木瓜蛋白酶汞盐結晶,与木瓜蛋白酶汞盐結晶相同。(2)在6M尿素溶液中溴代乙酸与木瓜蛋白酶的作用速度显著降低,底物L-白氨酰胺及抑制剂对氯汞苯甲酸都具有保护作用。这些事实表明溴代乙酸的抑制与木瓜蛋白酶的催化活性有密切关系,其作用点很可能是活性中心所在。(3)以双相电泳层析进行氨基酸組成分析結果指出,溴代乙酸作用点很可能是組氨酸殘基。     

牦牛骨蛋白的酶解条件研究

以蛋白质水解度为评价指标,辅以固形物溶出率,比较了中性蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶对牦牛骨蛋白的水解效果,研究了酶用量、料液比(底物浓度)、酶解时间对水解度的影响,采用正交试验对酶解条件进行了优化。结果显示,木瓜蛋白酶是牦牛骨蛋白水解的适宜催化剂。在一定条件下,样品水解度随酶用量和酶解时间的增加而增大,底物浓度过低或过高均不利于原料中蛋白质的酶解。木瓜蛋白酶水解牦牛骨蛋白最佳条件为:酶解温度60℃,酶解时间8 h,酶用量3500 U/g蛋白质,料液比1:25(g:m l)。     

一种新型蚯蚓纤溶酶的部分性质研究

为获得一种高效的溶栓药物。从赤子爱胜蚓(Eiseniafoelida)中分离纯化得到了一种纤溶酶组分。用Lowry法测定蛋白质浓度,SDSPAGE鉴定纯度为98%,表观相对分子质量(Mr)为14850,纤维蛋白平板法测定其总纤溶活性为65.51×103mm2/mg,直接纤溶活性为15.61×103mm2/mg,间接纤溶活性为26.34×103mm2/mg。水解BAEE的米氏常数(Km)为1.82×105mol/L。水解ChromozymPL的米氏常数(Km)3.98×105mol/L,水解ChromozymtPA的米氏常数(Km)5.55×105mol/L活性,N端氨基酸序列测定的结果为VIGGTNAIPGEFPYQ。结果表明该纤溶酶分子量较小,间接活性较高,适宜作为一种新型的溶栓药物。     

木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶和木瓜蛋白酶Ⅲ的蛋白水解活性

番木瓜(Carica papaya)浆汁中含有三种蛋白酶——木瓜蛋白酶,木瓜疑乳蛋白酶和木瓜蛋白酶Ⅲ(以前称为肽酶)。本研究旨在确定木瓜凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶Ⅲ的蛋白水解活性在量和专一性方面是否与木瓜蛋白酶相同。在测试中用偶氮酪蛋白、血清清蛋白和软骨蛋白多糖作底物,精确比较标准酶制剂的水解蛋白活性;以清蛋白和磷酸化酶α作底物,比较它们的相对专一性;把蛋白质中的肽键与合成底物的水解动力学参数加以比较。     

里氏木霉纤维素酶的分离纯化及酶学性质

通过(NH4)2SO4分级沉淀、HiPrep 26/10 Desalting凝胶色谱脱盐、Source 15 Q阴离子交换色谱技术,里氏木霉(Rut C-30)纤维素酶主要组分得以初步分开,再经过Source 15 S阳离子交换色谱、HiPrep Sephacryl S-100 HR凝胶过滤色谱、Superdex 75 PrepGrade凝胶过滤色谱进一步分离纯化,得到2个纯化的内切葡聚糖酶组分EGⅡ、EGⅠ和一个外切葡聚糖酶组分CBHⅠ;经过SDS-PAGE电泳鉴定为电泳纯,测得相对分子质量分别为5.22×104,5.62×104和6.90×104。EGⅡ的最适反应pH是5.6,最适反应温度为65℃;EGⅠ的最适反应pH是4.4,最适反应温度为55℃;以羧甲基纤维素(CMC)为底物时,EGⅠ、EGⅡ的米氏常数(Km)分别为2.20 mg/mL、3.38 mg/mL。CBHⅠ的最适反应pH是5.8,最适反应温度为60℃,以对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷(PNPC)为底物时,米氏常数(Km)为0.12 mg/mL。     

猪肾酰化酶作用机制的研究——Ⅱ.酶蛋白中巯基,咪唑基与酶活力的关系

(1)酰化酶能被各种巯基試剂所抑制,其中以PCMB的抑制最为明显,在所有的抑制情况下,都保留有一定的剩余酶活力。巯基乙酸能完全解除PCMB的抑制,恢复程度随所加的浓度而定,当巯基乙酸过量子抑制剂150倍时,酶活力反而高于原始活力20%,若浓度再高,酶活力又重新下降。(2)酰化酶經光氧化后活力就迅速丧失,但加对色氨酸殘基专一的試剂N-溴代琥珀酰亚胺并不影响酶的活力。溴代乙酸在較高浓度下亦能抑制酶的活力,抑制程度在作用pH为5左右时較为明显。(3)pH不影响酰化酶与底物結合的米氏常数K_M,而影响最大反应速度V。从pH对V影响的作图中求出活性基团的pK值为5.9和8.6,分別相当于酶蛋白中組氨酸和半胱氨酸的解离常数。(4)从实驗結果中推測,組氨酸和半胱氨酸是酰化酶的必需基团,它們可能与酶中金属离子以配位价的形式結合而共同构成一活性中心,在酶催化反应吋底物先通过金属离子与酶相結合,然后再进一步被催化。     

简单节杆菌转化氢化可的松的△-脱氢反应动力学I．简单节杆菌BY-2-13自由细胞转化氢化可的松的△-脱氢反应动力学

本文研究了简单节杆菌(Arthrobacter simplex) By-2-13转化氢化可的松为氢化泼尼松韵△一脱氢反应动力学。其中包括溶解底物的底物浓度对反应速度的影响,反应初速度与底物浓度的关系;固体悬浮液中底物总浓度对反应速度的影响,反应初速度与底物浓度的关系;酶量对反应的影响以及产物的抑制作用等。溶解底物和固体悬浮液底物的反应初速度与底物浓度的关系都符合简单米氏方程,米氏常数Km分别为0．33mg／mJ和29．41n,g／ml,而两者的反应过程曲线均与简单米氏方程不符。无论在较低或较高浓度的固体悬浮液底物转化过程中,产物对A’。脱氢反应都呈现抑制作用。由此建立了该反应的反应动力学模型及相应的动力学方程,井经线性化后回归得出反应的动力学参数。当反应时间小于‘(达到约85％的转化率所需要的时间)时,用此动力学方程拟合所得的数据与实验测定值相符。