噬菌体抗体库筛选技术研究进展

噬菌体抗体库技术是一项新兴的基因工程抗体技术,应用这项技术获得高特异性抗体的关键之一就是筛选环节。根据抗原性质以及筛选目的的不同,筛选方法的选择也不相同,各种筛选策略的优化对中和抗体的获得有至关重要的作用。     

噬菌体展示抗体库筛选技术研究进展

噬菌体展示技术已成为制备高亲和力抗体的强有力的工具。而噬菌体抗体库的筛选是在获得高亲和力抗体过程中很关键的一个环节。总结了针对不同复杂程度的抗原所须采用的不同筛选方法,并简单介绍了高通量筛选的优势。     

利用重组系统构建大容量噬菌体抗体库

噬菌体抗体库技术是获得人源抗体的重要方法,此文探讨大容量天然噬菌体抗体库在筛选人源抗体中的实际应用价值。从正常人外周血分离淋巴细胞,通过基因工程方法获得抗体基因并且构建到含有重组位点的载体pDF中获得初级噬菌体抗体库,初级库在重组系统中重组之后获得了容量为9×1010的天然Fab噬菌体抗体库,通过序列测定和重组蛋白筛选来对抗体库的质量进行初步鉴定。对随机挑取的96个克隆测序序列分析表明各种型别比例基本合适;用四种抗原筛选有明显的富集,并且获得了针对其中一种抗原的阳性抗体克隆。     

β淀粉样蛋白人源性抗体的制备

目的:应用噬菌体展示及抗体库技术,制备并鉴定β淀粉样蛋白(Aβ)人源性抗体。方法:应用固相筛选方法,以人工合成的Aβ1-15肽为靶标分子,在大容量全合成人源性噬菌体抗体库中筛选抗Aβ人源性抗体,并进行特异性鉴定。结果:经过3轮筛选,单克隆鉴定获得噬菌体抗体F11,竞争性ELISA表明抗体对Aβ1-42的结合位点位于1～15氨基酸残基内,ELISA结果证实抗体特异性良好。结论:以Aβ1-15肽为靶标分子获得了特异性良好的人源性抗体。     

基于细胞的噬菌体抗体库筛选技术

肿瘤细胞表面抗原的表达量低,免疫原性弱,因抗原构象改变的原因,用传统的固定化抗原方法很难获得有价值的噬菌体抗体。这类抗原大多具有复杂的结构,且其转运、定位与细胞类型及所处的微环境有关。在基于细胞的筛选中,靶抗原以天然状态存在,不需纯化,甚至可以对未知抗原进行筛选,因此广泛用于对内化抗体和血管内皮抗原表位抗体的筛选。基于细胞的抗体筛选中的主要问题是因非特异结合造成的选择背景过高,迄今,已有许多旨在改善选择灵敏度和特异性的研究开展起来。随高通量流式细胞术、组合化学及蛋白质组学研究技术在细胞筛选中的运用,必将使其日趋实用和成熟。我们拟以细胞和组织筛选的技术做一概括,为了解基于细胞的筛选和优化设计提供参考。     

亲和层析法用于噬菌体抗体库的筛选

本研究报道一种基于固定化金属亲和层析(IMAC)的噬菌体抗体库液相筛选方法。将纯化的带有His标签的抗原与噬菌体抗体库混合,噬菌体抗体与抗原充分结合后再加入亲和介质,使噬菌体抗体抗原复合物通过His标签与介质结合,然后通过充分洗涤去除非特异性噬菌体抗体,最后将特异性噬菌体抗体洗脱下来,感染TG1,进行下一轮筛选。整个筛选过程中抗原与抗体的结合在液相中完成,不仅消除了固相介质对抗原表位的影响,也更有利于噬菌体抗体与抗原的充分作用。将此方法应用于HEV NE2蛋白特异性人源噬菌体抗体的筛选,抗原竞争ELISA,阳性血清阻断,可溶性单链抗体表达检测及测序结果表明,最终获得2个特异性人源抗体。     

基于细胞的抗单增李斯特菌单域重链抗体的筛选及鉴定

【目的】获得针对单增李斯特菌的特异性单域重链抗体,并对筛选过程中特异性克隆的富集规律进行分析,为筛选具有种属特异性的噬菌体展示抗体提供参考。【方法】采用固相筛选技术,以热灭活的单增李斯特菌菌体为抗原,通过四轮常规筛选和一轮消减筛选,从驼源天然噬菌体展示文库中筛选针对单增李斯特菌的单域重链抗体。采用Phage-ELISA法,对后四轮筛选洗脱物中随机挑选的噬菌体进行鉴定,阳性克隆进行基因测序及结合特异性分析。通过多序列比对分析将获得的基因序列进行分组和统计。【结果】成功筛选到2株单增李斯特菌特异性的单域重链抗体。【结论】在优化的筛选条件下,基于全细胞的筛选方法能够获得特异性识别单增李斯特菌的单域重链抗体,消减筛选对于去除非特异性克隆是有效的和必要的。     

噬菌体抗体库筛选技术

噬菌体展示技术（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）为制备高亲和性抗体提供了有力的工具。噬菌体抗体库的筛选是其中关键的环节,为了提高筛选效率,用包被在固体表面的抗原进行筛选的传统方法不断地被改进,如宿主菌直接洗脱和双层膜筛选系统和抗抗体替代抗原筛选系统。将噬菌体感染宿主菌的过程与筛选过程相关联,产生了选择性感染筛选系统。     

噬菌体显示技术用于抗体表位的筛选

利用噬菌体随机肽库筛选抗TNF单抗表位的研究中,就抗体的选择、肽库富集的检测、筛选得到的表位多肽的验证及如何提高筛选的成功率等,进行了一些初步探索. 实验结果表明,由识别线性抗原位点的抗体较容易筛选到噬菌体呈现表位,具有较强中和活性的抗体,因多识别空间构型抗原位点而增加筛选难度. NC膜斑点印迹、ELISA及DNA测序均可作为筛选富集的检测方法. 用与天然抗原同源比较的方法及竞争性ELISA分析,可以帮助确定噬菌体呈现多肽是否是抗体表位.     

高效构建卵清白蛋白scFv噬菌体文库及其筛选

目的:建立一种高效噬菌体文库构建方法,获得抗鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)的单链抗体(scFv)噬菌体展示文库,筛选鉴定获得OVA单链抗体。方法:用OVA蛋白免疫Balb/C小鼠,选取血清抗体效价高的小鼠提取脾脏RNA,利用RT-PCR方法扩增获得小鼠重链和小鼠轻链基因。通过无缝连接酶一步将小鼠重链基因、轻链基因和linker DNA连接起来,插入噬菌体表达载体中,构建OVA scFv噬菌体展示文库。测定文库容量,对文库进行富集筛选,ELISA鉴定阳性克隆,测序后构建真核表达载体,转入Expi-CHO悬浮细胞进行真核表达,利用Western blot进行鉴定。结果:成功获得库容量为1. 2×10~7cfu的OVA scFv噬菌体展示文库,并从中筛选出8个阳性克隆,选取效价最高的2号克隆,在Expi-CHO悬浮细胞中表达获得可溶性抗体。结论:建立了一种高效构建scFv噬菌体文库的方法,筛选获得高结合活性的OVA单链抗体,并成功进行了真核表达,为OVA ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。     

人转铁蛋白受体及其特异性抗体的制备

目的:从胎盘中提取转铁蛋白受体并获得抗转铁蛋白受体的抗体。方法:人新鲜胎盘组织被破碎后,用去污剂TritonX-100裂解细胞膜,释放膜蛋白。利用膜蛋白中的转铁蛋白受体能与铁-转铁蛋白复合物特异性结合的特性对其进行亲和纯化。对纯化得到的目的蛋白,经脱盐后进行ELISA及肽质量图谱分析,证明为所需的转铁蛋白受体后,以其包被免疫管,从全合成人源噬菌体抗体库中筛选抗体。结果:从人源噬菌体抗体库中筛选到5个能够与转铁蛋白受体特异性结合的噬菌体单链抗体。结论:以人源转铁蛋白受体为抗体,可从全人源噬菌体抗体库中筛选到其特异性的抗体。     

新疆双峰驼天然单域抗体库的构建及初步鉴定

旨在构建新疆双峰驼天然单域抗体库,及从中快速筛选VHH抗体.采用两种不同的抗原(溶菌酶和cAb-HEWL23)用天然文库进行筛选,成功筛选到了相应的抗体,并融溶菌酶筛选的VHH抗体(A3-1,A4-1和A10-1)进行表达和初步的ELISA检测.结果显示,A3-1和A10-1具有结合溶菌酶的能力.该方法简单方便、省时省力,可以快速从天然单城抗体库中筛选VHH抗体.     

噬菌体单链抗体文库的构建及筛选

噬菌体抗体是继多克隆抗体、单克隆抗体之后兴起的第3代基因工程抗体.噬菌体抗体库技术是抗体基因文库技术和噬菌体表面展示技术相结合形成的一项新技术与方法,在生物科学领域极具潜力.现主要就近年来该技术在抗体基因扩增、抗体库的构建、筛选方法等方面的进展进行综述.     

具有高亲和力和稳定性的人源性抗PD-L1二硫键稳定Diabody的制备

目的：对天然噬菌体抗体库进行筛选并对抗体进行体外亲和力成熟,获得高亲和力人源性抗PD-L1抗体,然后对该抗体进行二硫键稳定改造,获得具有高亲和力和稳定性的人源性抗PD-L1的二硫键稳定Diabody。方法：首先以PD-L1重组蛋白为抗原在天然噬菌体Fab抗体库中筛选Fab抗体,其次分析结合能力较好的抗PD-L1的Fab抗体可变区基因中的热点,通过对轻链、重链CDR3区的7处热点随机突变构建噬菌体抗体突变库,从中筛选出亲和力得到提高的抗体。最后在抗体骨架区引入两个二硫键,构建二硫键稳定的抗PD-L1的ds-Diabody,并在毕赤酵母GS115中进行表达。结果：该方法筛选获得了6株特异性抗PD-L1噬菌体Fab抗体,对结合能力较好的其中一株抗体CDR3区的热点进行随机突变,成功构建库容为1.14×10⁸ CFU/mL的噬菌体抗体突变库,并从中筛选出亲和力提高约6倍的噬菌体抗体突变株。对该抗体骨架区进行二硫键引入,成功构建与表达二硫键稳定的ds-Diabody。结论：构建的ds-Diabody比Fab抗体与PD-L1结合亲和力高、稳定性好,为药物开发、肿瘤治疗等研究P...     

噬菌体抗体库技术在肿瘤抗体药物研究中的进展及应用

目的:综述噬菌体抗体库技术的研究进展,介绍该技术的原理,构建,筛选和应用,为抗肿瘤抗体药物研发提供参考。方法:采用文献综述的方法,筛选近5年来噬菌体抗体库技术试验论文,对噬菌体抗体库技术的原理,构建,筛选和应用进行总结。结果:噬菌体抗体库主要分为免疫抗体库和非免疫抗体库两大类;噬菌体抗体库筛选技术包括亲和筛选、细胞筛选和生物体内筛选三种;噬菌体抗体库技术主要应用于肿瘤标志物的识别和肿瘤诊断,抗肿瘤抗体药物的筛选和制备。结论:噬菌体抗体库技术方便、快速、高效,可以在体外环境下培养,这些特点决定了其在肿瘤标志物的发现和肿瘤抗体药物研发中的广泛应用。目前噬菌体抗体库技术还存在一定缺陷,但技术的不断发展和革新必然使噬菌体抗体库技术成为研制抗体药物的新思路,极大促进了肿瘤抗体药物的研发。     

鼠源性人乳腺癌单链抗体库的构建与乳腺癌相关抗体的筛选

目的:获得乳腺癌的噬菌体呈现型单链抗体(scFv)库,筛选与乳腺癌细胞特异结合的抗体,为乳腺癌的诊断和治疗奠定基础。方法:用乳腺癌细胞系MCF-7、T47D、MDA-MB-435免疫BALB/c小鼠,取脾脏提取总RNA,用RT-PCR分别扩增抗体重、轻链可变区(VH和VL)基因,经Linker连接形成scFv基因片段。将scFv基因片段与噬菌粒载体pCANTAB5E的连接产物转化大肠杆菌TG1。用辅助噬菌体M13KO7进行超感染,获得重组噬菌体抗体。选用乳腺癌细胞系MCF-7和人正常肝细胞系HL02做正负差异的筛选细胞,通过5轮筛选,随机挑取克隆,经phage-ELISA筛选特异性结合MCF-7细胞的scFv。结果:构建了1个库容为1.3×106的单链抗体库。筛选到2株与MCF-7细胞有较高结合活性的噬菌体-单链抗体scFv-873和scFv-874。数据库搜索表明这2株单链抗体基因是与以往抗体序列不同的新基因。用Westernblot检测了这2株单链抗体在琥珀密码子非抑制型菌株TOP10中的表达情况。结论:筛选到2个与乳腺癌细胞结合特异性较好的单链抗体,为乳腺癌的诊断和治疗研究奠定了基础。     

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗DNA-PKcs单链抗体

目的：从单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗DNA-PKcs的人源抗体,用于肿瘤治疗或诊断目的。方法：经抗原性分析及BLAST比对,选定人DNA-PKcs蛋白中抗原性高且与其他蛋白没有同源性的片段,进行原核表达及纯化后将其固定在抗原管上,通过4轮“吸附－洗脱－扩增”过程从大容量抗体库中筛选特异性抗体,转化HB2151菌,制备抗DNA-PKcs的可溶性单链抗体;ELISA检测抗原-抗体结合活性。结果：经生物信息学分析,确定抗原性高且与其他蛋白没有同源性的DNA-PKcs片段DPK3（250个AA）、DPK4（257个AA）。经过4轮筛选,获得26个特异性结合DPK3及31个特异结合DPK4的克隆,指纹分析分别有5种和21种不同的可变区片段;成功制备了可溶性抗体。并做了抗原结合活性鉴定。结论：利用单链大容量抗体库获得抗DNA-PKcs的噬菌体抗体基因并且成功制备成可溶性抗体,为今后的研究和应用奠定了基础。     

人源天然ScFv噬菌体抗体库的构建及鉴定

噬菌体抗体库技术是获得治疗性抗体的一条重要途径。以20份健康人外周血为样本,通过提取淋巴细胞、逆转录－PCR（RT PCR）、抗体可变区基因的扩增、重叠PCR获得单链抗体（ScFv）基因,将ScFv克隆入噬粒载体,通过近300次的电转化获得了库容量为1.3×109的全人源天然ScFv噬菌体抗体库。通过随机挑克隆测序和用5种不同抗原筛选对抗体库进行了初步验证。随机测序表明抗体库具有较好的多样性,用5种不同抗原对其进行筛选,均获得了特异性噬菌体抗体的不同富集,表明成功构建了一个多样性良好的人源天然ScFv噬菌体抗体库。     

鼠源抗B型肉毒毒素Fab抗体库的构建及初步筛选

目的:应用重组噬菌体抗体库技术制备抗B型肉毒毒素Fab抗体。方法:用重组B型肉毒毒素重链C端片段(BoNTB/Hc)免疫BALB/c小鼠,从其脾淋巴细胞扩增免疫球蛋白Fd段和κ链基因,克隆至表达载体pComb3中,并将抗体Fab段表达于噬菌体表面,建立容量为5.96×106cfu的噬菌体抗体库。以BoNTB/Hc为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,获得与B型肉毒毒素特异性结合的克隆,并进行序列测定。结果:构建了抗B型肉毒毒素Fab抗体库,筛选出特异性克隆1个。结论:从鼠源噬菌体免疫抗体库中初步获得了特异性抗B型肉毒毒素的Fab抗体。     

抗呼吸道合胞病毒融合蛋白单链抗体的筛选及初步鉴定

目的：从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗呼吸道合胞病毒F蛋白的单链抗体。方法：以RSV F蛋白为靶抗原,通过“吸附-洗涤-洗脱-扩增”过程从天然人源性噬菌体抗体库中筛选特异性抗F蛋白单链抗体。5轮筛选后,单克隆经ELISA检测,阳性克隆进行核酸序列分析,并将阳性克隆噬菌体感染E.coli HB2151,经IPTG诱导,制备抗RSV F蛋白的可溶性单链抗体,并进行Western及Dot blot分析。结果：经过筛选,获得了18株能与F蛋白特异性结合的阳性克隆,取OD值最高的克隆E4经测序并检索Kabat数据库分析,显示其基因与人免疫球蛋白可变区基因具有高度同源性,Western及Dot blot分析表明为单链抗体。结论：利用天然人源性噬菌体抗体库技术制备出高特异性的人源性抗RSV F蛋白单链抗体。