由D、L-苯丙乳酸盐消旋混合物酶法生产L-苯丙氨酸

本文研究了在酶膜反应器中由D.L苯丙乳酸盐消旋混合物生产L-苯丙氨酸。反应的第一步消旋混合物在羟基异己酸脱氢酶作用下,脱氢生成本丙酮酸;第二步苯丙酮酸在苯丙氨酸脱氨酶作用下,还原胺化成L-苯丙氨酸。从化学计量来看,上述两步反应均需要辅酶参加。第一步需要NAD,第二步需要NADH,在此反应中,辅酶可以直接再生而起到催化作用。由于铺酶被共价结合到聚乙二醇—2000上,所以铺酶就类似于其它三种酶一样保留在反应器中。为了由D.L-本丙乳酸盐能不断连续地生产L-苯丙氨酸,我们设计了反应动力学及反应器体系模型。按照上述模型,我们可以计算出反应器中三种酶的最适比率,辅酶的最适浓度,以及投料中苯丙酮酸的最适浓度。采用这一程序,我们用底物浓度为50mM D.L-苯芮乳酸盐,可获得28克/升L-苯丙氨酸。     

大肠杆菌ptsHI-crr基因的敲除及其对苯丙氨酸生产的影响

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)是重要的食品和医药中间体。利用大肠杆菌发酵葡萄糖生产苯丙氨酸时,对葡萄糖转运起重要作用的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)对苯丙氨酸产量有很大影响。由ptsHI-crr操纵子编码的磷酸组氨酸载体蛋白(HPr),酶I(EI)和酶IIAGlc是PTS的必要组分,通过敲除ptsHI-crr得到PTS缺陷菌株,可以使葡萄糖代谢更多地流向苯丙氨酸生物合成。采用Red同源重组技术将大肠杆菌染色体上的ptsHI-crr基因替换为四环素抗性基因,得到PTS缺陷菌株。该菌株在以葡萄糖为惟一碳源的培养基中摇瓶培养,菌密度为对照菌株的2.7倍,苯丙氨酸产量为对照菌株的6.3倍。     

产碱菌（Alcaligenes sp.）119转化苯丙酮酸形成L—苯丙氨酸的研究

从土壤中分离到一株产碱菌１１９,能将苯丙酮酸一步转化成Ｌ－苯丙氨酸。酶反应的最适ｐＨ为８．５,该酶在ｐＨ８－９之间稳定,最适反应温度为３７－４５℃,金属离子Ｆｅ＾２＋,Ｍｎ＾２ｎ等对酶有不同程度的抑制作用。该菌株培养在由葡萄糖,蛋白胨、牛肉膏等组成的培养基中,可获得最高转化率。Ｌ－天冬氨酸为酶反应的最佳氨基供体。当苯丙酮酸浓度为０．２ｍｏｌ／Ｌ时,细胞在３７℃下反应１６小时,可产Ｌ－苯丙氨酸３０．     

L-苯丙氨酸产生菌的选育

本文报导了不产酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)经亚硝基胍处理,在一定浓度的L-苯丙氨酸结构类似物——对氟苯丙氨酸(DLP-Fluorophenylalalline,PFP)存在下,筛选获得了一批能产生与积累L-苯丙氨酸的抗代谢突变菌株,其中PFP-17突变菌株的产物在纸层析谱上L-苯丙氨酸的显色点较深,定量测定产酸为1.5mg/ml经两次自然分离获得的17-3-4菌株产酸特性稳定,在以葡萄糖为主要碳源,初糖为4.5%的摇瓶发酵中。产酸可达5.5mg/ml,产物经氨基酸自动分析代鉴测确证其主要产物是L-苯丙氨酸,此突变菌株经进一步选育所得的突变菌株3-PAP-42在提高初糖为6%时,发酵产酸可达8.28mg/ml。     

产碱菌(Alcaligenes sp．)119转化苯丙酮酸形成L-苯丙氨酸的研究

从土壤中分离到一株产碱菌(Alcaligenes sp)119．能将苯丙酮酸一步转化成L-苯内氨酸。酶反应的最适pH为8 5．该酶在pH8 9之间稳定．最适反应温度为37-15℃．金属离子Fe2+、Mn2+等对酶有不同程度的抑制作用,该菌株培养在由葡萄糖、蛋白胨,牛肉膏等组成的培养基中,可获得最高转化率L-天冬氨酸为酶反应的最佳氨基供体。当苯丙酮酸浓度为0.2mol／L时,细胞在37℃下反应16小时．可产L-苯内氨酸30.lg/L．其克分丁转化率为92.7% 采用离子交换树脂分离提纯产物．总收率在69％以上。产物经熔点、比旋光度、元素分析、红外光谱及纸上层析鉴定．证实是L-苯丙氨酸。     

长链二元酸代谢中肉毒碱脂酰转移酶的作用

肉毒碱脂酰转移酶包括肉毒碱棕榈酰转移酶、肉毒碱乙酰基转移酶和肉毒碱辛酰基转移酶,它们对脂肪酸的进一步β氧化代谢起到了转运的作用。综述近年来对肉毒碱脂酰转移酶族成员酶学特性的研究进展,探讨在热带假丝酵母(Candidatropicalis)中肉毒碱脂酰转移酶的作用与调控 。     

代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌合成及分泌途径生产L-缬氨酸

谷氨酸棒状杆菌是目前微生物发酵生产L-缬氨酸的主要工业菌株。文中首先在谷氨酸棒状杆菌VWB-1中敲除了alaT (丙氨酸氨基转移酶),获得突变菌株VWB-2,作为出发菌株。进而对L-缬氨酸合成途径关键酶——乙酰羟酸合酶 (ilvBN) 的调节亚基进行定点突变 (ilvBN1M13),解除L-缬氨酸对该酶的反馈抑制。然后辅助过量表达L-缬氨酸合成途径关键基因ilvBN1M13、乙酰羟酸异构酶 (ilvC)、二羟酸脱水酶 (ilvD)、支链氨基酸氨基转移酶 (ilvE),加强通往L-缬氨酸的碳代谢流,提高菌株的L-缬氨酸水平。最后,基于过量表达L-缬氨酸转运蛋白编码基因brnFE及其调控蛋白编码基因lrp1,提高细胞的L-缬氨酸转运能力。最终获得工程菌株VWB-2/pEC-XK99E-ilvBN1M13CE-lrp1-brnFE在5 L发酵罐中的L-缬氨酸产量达到461.4 mmol/L,糖酸转化率达到0.312 g/g葡萄糖。     

大肠杆菌ppsA基因的克隆表达

L-苯丙氨酸是人体内8种必需氨基酸之一,是医药大输液的基本成分.苯丙氨酸和门冬氨酸组成的二肽甲酯是一种新型甜味剂,市场需求正在不断增长,因此构建高产酸的苯丙氨酸基因工程菌已成为形势所趋.苯丙氨酸工程菌的构建是基于芳香族氨基酸的生化合成途径进行的,包括单基因表达工程菌和多基因表达工程菌.单基因表达主要集中在芳香族转氨酶tyrB基因上,国内外有不少报道[1～3],苯丙酮酸转化为苯丙氨酸的转化率约为91%.在多基因表达方面,Ikeda等[4]克隆了3个芳香族氨基酸合成的有关基因,并进行多基因表达,苯丙氨酸产量为28g/L.磷酸烯醇式丙酮酸(P…     

头状轮生链霉菌芳香族氨基酸合成途径的调节

对头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)芳香氨基酸合成途径的研究表明,第一个酶即3—脱氧—α—阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶无同工酶,不被L-色氨酸阻遏,比活力可被硝酸盐促进。L-色氨酸强烈地反馈抑制此酶,L-酪氨酸和L-苯丙氨酸无作用。L-色氨酸的反馈抑制对磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是非竞争性的,K_I为373μmol/L。酶对PEP和4-磷酸亦藓糖(E4P)的K_m值分别为50和100μmol/L。PEP和C0²⁺对酶有稳定作用。邻氨基苯甲酸合成酶活力可被1mmol/L L-色氨酸完全抑制,此酶也受L-色氨酸的阻遏,但是色氨酸支路上其余4个酶不被阻遏。分支酸变位酶被L-酪氨酸抑制。L-苯丙氨酸抑制预苯酸脱水酶,并更强地抑制预苯酸脱氢酶。     

L-苯丙氨酸生产的代谢工程研究

L-苯丙氨酸是一种重要的食品和医药中间体。工业上一般采用酶法和发酵法来生产L-苯丙氨酸。代谢工程的兴起,使得更加理性的改造菌株成为可能,这更加促进了发酵法的广泛应用。主要介绍了代谢工程在L-苯丙氨酸生产菌的改造中的应用情况,其中涉及苯丙氨酸生物合成途径中相关基因及其酶的调控、中央代谢途径的改造和芳香族氨基酸生物合成支路的修饰。并探讨了将来的发展前景。     

钝齿棒杆菌中异源表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶合成L-鸟氨酸的研究

目的:对一株产鸟氨酸的钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYPA5-5/△proB/△argF(SYPO-1)进行代谢工程改造,筛选不同细菌来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶在大肠杆菌中克隆与表达,纯化后对其进行酶学性质的比较;将黏质沙雷氏菌Serratia marcescens Y213来源的Smarg E基因编码的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶在L-鸟氨酸生产菌株C.crenatum SYPO-1中过量表达,进一步提高L-鸟氨酸的产量。方法:通过利用pDXW10穿梭质粒对不同来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰化酶进行克隆表达和酶学性质比较,选择性质最优来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶编码基因Smarg E在产L-鸟氨酸重组钝齿棒杆菌中表达,考察重组菌株发酵过程中参数的变化。结果:来源于S.marcescens Y213的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶比酶活最高为798.98U/mg,最适pH为7,最适温度为37℃,0.1mmol/L的Mg~(2+)、Li~+、Mn~(2+)促进酶的比酶活提高了50%;在钝齿棒杆菌中表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶酶活达到128.4U/ml,显著提高了钝齿棒杆菌中胞内乙酰基循环水平;5L发酵罐发酵重组菌株96h,L-鸟氨酸的产量达到38.5g/L,比出发菌株,L-鸟氨酸的产量提高了33.2%,产率达0.401g/(L·h)。结论:筛选出最佳来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶,在鸟氨酸生产菌株C.crenatum(SYPO-1)中过量表达,可以促进鸟氨酸的前体物质N-乙酰鸟氨酸的快速消耗,实现鸟氨酸的积累。     

我国自行构建的L-苯丙氨酸工程菌株发酵产酸率达国际先进水平

福建省发展和改革委员会于2009年1月17日对福建省麦丹生物集团有限公司和福建沙县侨丹实业有限公司共同承担的"L-苯丙氨酸高产基因工程菌的构建和应用"项目进行科技成果鉴定,由中国工程院院士、浙江工业大学原校长沈寅初教授和清华大学曹竹安教授等专家组成的鉴定委员会,对该项目给予很高的评价,认为所构建的工程菌株ES-4573-2其产酸率达国际先进水平,并足以形成具有自主知识产权的科技成果,使我国L-苯丙氨酸生产进入国际先进行列.L-苯丙氨酸是人体和动物不能在体内自行生物合成的必需氨基酸之一,广泛应用于食品、饲料、医药和日用化工等领域.尤其是低热量、高甜度的二肽甜昧剂-阿可斯巴甜的主要原料,市场需求量大.为进一步提高L-苯丙氨酸产酶产酸水平,增强我国L-苯丙氨酸在国际市场中的竞争力,该项目在两位国家级专家施巧琴教授和吴松刚教授的直接领导下,该课题组在国内外首次应用分子定向协同共进化技术对L-苯丙氨酸代谢途径关键酶基因进行整体改造,构建成突变库,筛选出具有高产酸水平的突变株,取得了显著成效.采用上述技术,工程菌株ES-4573-2经小试、中试进入试产,在采间歇式补料及发酵优化控制的基础上,产酸率较酪氨酸缺陷型宿主菌株提高了292％,取得了重大突破.目前,该工程菌株已在大生产中使用,生产性能稳定,对提高L-苯丙氨酸的产量和质量起了重要的作用,为我国发酵工业的发展作出了贡献.     

3个植物源苯甲醇酰基转移酶合成乙酸肉桂酯的研究

[背景]乙酸肉桂酯是一种重要的香料化合物,在化妆品和食品工业上具有广泛的应用,传统的生产方法主要依靠植物提取和化学合成。[目的]通过筛选不同植物源的酰基转移酶,利用大肠杆菌从头合成乙酸肉桂酯。[方法]首先,通过在苯丙氨酸高产菌BPHE中表达异源基因苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia-Lyase from Arabidopsis thaliana,AtPAL)、对羟基肉桂酰辅酶A连接酶(Hydroxycinnamate:CoA Ligase from Petroselinum crispum,Pc4CL)和肉桂酰辅酶 A 还原酶(Cinnamyl-CoA Reductase from Arabidopsis thaliana,AtCCR),并结合大肠杆菌自身的内源性醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenases,ADHs)或醛酮还原酶(Aldo-Keto Reductases,AKRs)的催化作用构建了从苯丙氨酸到肉桂醇的生物合成途径。然后,苯甲醇苯甲酰转移酶(Benzyl Alcohol O-Benzoyltransferase from Nicotiana tabacum,ANN09798;Benzyl Alcohol O-Benzoyltransferase from Clarkia breweri,ANN09796)或苯甲醇乙酰转移酶(Benzyl Alcohol Acetyltransferase from Clarkia breweri,BEAT)被引入到上述重组大肠杆菌中发酵培养生产乙酸肉桂酯。最后,在大肠杆菌中过表达乙酰辅酶A合成酶(Acetyl Coenzyme A Synthetase,ACS)来提高底物乙酰辅酶A的量。[结果]探讨了 3个植物源苯甲醇酰基转移酶生物合成乙酸肉桂酯的能力,并应用于合成乙酸肉桂酯的细胞工厂,最终使乙酸肉桂酯最高产量达到166.9±6.6mg/L。[结论]植物源苯甲醇酰基转移酶具有一定的底物宽泛性,能以肉桂醇为底物催化合成乙酸肉桂酯。首次利用植物源的苯甲醇酰基转移酶合成乙酸肉桂酯,为微生物细胞工厂以葡萄糖作为碳源生产乙酸肉桂酯提供参考。     

苯丙酸尿症和高苯丙氨酸血症是一回事吗?

<正>答:苯丙酮尿症(phenylketouria,PKU)是一种氨基酸代谢异常疾病。经典型PKU是由于苯丙氨酸羟化酶基因(PAH)的突变导致该酶活性降低或丧失,致使血中苯丙氨酸代谢受阻,不能转化为酪氨酸,表现为高苯丙氨酸血症和高苯丙酮酸尿症。非经典型PKU分别由DHPR,GTP-CH,6-PTS基因的突变所引起,导致生物喋呤代谢缺陷,影响苯丙氨酸羟     

一种E. Coli B菌株的芳香族氨基酸氨基转移酶基因克隆

一种证明由苯丙酮酸盐到苯丙氨酸的转氨作用活性高的E. Coli B菌株为在E. Coli DG30中构建柯斯质粒文库的DNA来源。已知E. Coli DG30缺失三种主要的氨基转移酶基因(asp C,ilv E和tyr B)。通过互补分析,证明柯斯质拉克隆是一种携带有tyr B基因的插入物。这种DNA插入物进一步亚克隆进PAT153,发现E. Coli B的tyrB基因类似于已报道的E. Coli K_(12)的tyrB基因,含有E. Coli B菌株tyrB基因的质粒转化到原来的E. Coli B菌株中,并对重组茵株的转氨酶活性及质粒的稳定性进行了分析。     

洛伐他汀酰基转移酶在毕赤酵母中的高效表达

目的:构建并筛选高效表达洛伐他汀酰基转移酶(Lov D)的毕赤酵母重组菌株。方法:将突变的Lov D基因克隆到毕赤酵母胞外表达质粒p PIC9K和胞内表达质粒p AO815中,将重组表达质粒电转入毕赤酵母GS115中,得到毕赤酵母重组菌株,通过摇瓶发酵筛选高酶活力的重组菌株;在此基础上,研究重组菌在5L发酵罐中的高密度发酵,并将所得酶液进行辛伐他汀催化反应。结果:p PIC9K-Lov D胞外表达重组菌的酶活是p AO815-Lov D胞内表达重组菌的3倍。筛选到酶活高的p PIC9K-Lov D-3菌株进行5L发酵罐放大实验,经过96 h的甲醇诱导表达,酶活可达609.3 U/L;发酵所得酶液冻干后进行酶功效实验,反应45 h后,其底物转化率可达96%以上。结论:构建的毕赤酵母胞外表达菌株可高效表达洛伐他汀酰基转移酶,培养液上清杂蛋白较少,有利于后续分离和纯化,为洛伐他汀酰基转移酶的工业化生产奠定了基础。     

泛酸的功能和生物合成

泛酸是辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)生物合成的重要前体物质,参与生物体内碳水化合物、脂肪酸、蛋白质和能量代谢.在人体中还参与类固醇,褪黑激素、抗体和亚铁血红素的合成.生物体内的泛酸合成是由酮泛解酸羟甲基转移酶(PanB),酮泛解酸还原酶(PanE),L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)和泛酸合成酶(PanC)四种酶协同催化下完成的.由于泛酸合成途径只存在于植物和低等生物中,选择该生物合成途径酶作为药物靶点将会有高度的选择性.本文综述了泛酸的功能和已经研究清楚大肠杆菌和分支结核杆菌中的泛酸生物合成途径所涉及的酶的结构和特性.     

氨基脱氧分支酸合成酶对Corynebacterium glutamicum SYPS-062积累L-丝氨酸的影响

为阐明氨基脱氧分支酸合成酶(ADC合成酶)在Corynebacterium glutamicum SYPS-062体内积累L-丝氨酸过程中的作用,通过交叉PCR以及同源重组的方法敲除叶酸途径关键酶ADC合成酶的编码基因pabAB,构建了叶酸缺陷型菌株Corynebacterium glutamicum SYPS-062△pabAB,同时构建pabAB基因增强表达重组菌C.glutamicum SYPS-062(pJC Ⅰ-pabAB).分别考察了ADC合成酶对菌株生长的影响、对L-丝氨酸降解途径关键酶丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)的影响以及其对L-丝氨酸积累的影响.结果表明,与出发菌株相比,增强表达基因pabAB重组菌的ADC合成酶的酶活力提高了33%.SHMT酶的酶活力提高了30%,其最大比生长速率(μm)提高了48%,单位细胞产酸率(Yp/x)降低了36.2%;而敲除基因pabAB重组菌的ADC合成酶的酶活力降低了61%.SHMT酶的酶活力降低了20%,最大比生长速率降低了32%,单位细胞产酸率提高了12%.     

谷氨酸棒杆菌苯丙氨酸生物合成有关基因克隆及在选育苯丙氨酸产生菌中的应用

谷氨酸棒杆菌K_(38)是一株抗对—氟苯丙氨酸和邻—氟苯丙氨酸的苯丙氨酸产生菌;而谷氨酸棒杆菌KY_(9456)则是一株缺失分枝酸变位酶和预苯酸脱水酶菌株。我们把K_(38)的分枝酸变位酶和预苯酸脱水酶基因克隆到KY_(9456)的pCE_(53)质粒中,构建了质粒pCmB_4。pCmB_4含有一段插入到pCE_(53)BamHI单一酶切位点上的9.4KbBamHIDNA片段。质粒pCmB_4弥补了KY_(9456)的苯丙氨酸和酪氨酸双重营养缺陷。pCmB_4质粒转入谷氨酸棒杆菌RRL_5中:结果RRL_5的分枝酸变位酶活性增加10倍左右。pCmB_4质粒转入K_(38)中,携带质粒的K_(38)菌可累积19.0mg/ml苯丙氨酸(比原K_(38)增产50%以上)。     

植物GPATs基因研究进展

甘油-3-磷酸酰基转移酶(Glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)是三酰甘油(Triacylglycerol, TAG)生物合成的限速酶, 催化TAG生物合成的起始步骤。GPATs主要负责将脂肪酰基从酰基-酰基载体蛋白(acyl-ACP)或酰基辅酶A(acyl-CoA)上转移到甘油-3-磷酸的(Glycerol-3-phosphate, G3P) sn-1位置上。有些成员还具有sn-2酰基转移活性。目前已经在多种植物中克隆得到了GPAT基因。这些GPAT基因编码的酶主要分为三类, 它们在细胞中分别定位于质体、线粒体和内质网上。这些酶参与三酰甘油、几丁质和软木脂等多种脂质的生物合成, 在植物的生长发育中发挥着非常重要的作用。文章介绍了植物GPAT基因的染色体定位和基因结构以及GPAT酶的亚细胞定位、sn-2酰基转移特异性、GPAT酶的底物选择性及其生理功能的最新研究进展。