双杂交扩展技术——报告蛋白片段互补及功能重建技术的应用与展望

报告蛋白片段互补及功能重建技术是对传统的酵母双杂交技术的改进。其原理是将报告蛋白分割成两个没有功能的片段,分别与两个待检测的蛋白质融合,如果待检测的两个蛋白质能够发生相互作用,就可以使报告蛋白的两个片段发生互补,从而使其功能得以重建。这一技术在检测方法和适用的细胞类型上都对酵母双杂交系统进行了扩展。     

蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂高通量筛选模型建立和应用

本文以蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase,PTP1B）作为靶点,采用分子克隆GST融合蛋白的方法,重组表达获得PTP1B,结合自动化操作技术和比色分析,建立了一种PTP1B抑制剂的高通量筛选模型.经在96孔板优化各种反应条件并对17940个样品的筛选结果表明,靶向PTP1B建立的高通量筛选模型具有微量、快速、特异、灵敏等特点,平均日筛选量可达15000样次以上,为寻找新的抗糖尿病药物和先导化合物提供了一种先进的手段.     

抗增殖蛋白与氧化应激北大核心CSCD

抗增殖蛋白为一种高度保守、分布广泛、功能多样的蛋白,由核基因编码,定位于线粒体内膜、细胞核、细胞膜和基质中,由于其参与多种生物学进程,已引起广泛关注。由于其在线粒体上的特殊定位、结构和功能,使其近年在与氧化应激功能相关的研究中开始逐渐成为新的热点。针对抗增殖蛋白与线粒体的研究,系统阐述其在氧化应激及相关疾病和老龄化过程中的重要作用,并对其应用前景作以展望。     

蛋白质相互作用数据库北大核心CSCD

随着"蛋白质组学"的蓬勃发展和人类对生物大分子功能机制的知识积累,涌现出海量的蛋白质相互作用数据。随之,研究者开发了300多个蛋白质相互作用数据库,用于存储、展示和数据的重利用。蛋白质相互作用数据库是系统生物学、分子生物学和临床药物研究的宝贵资源。本文将数据库分为3类:(1)综合蛋白质相互作用数据库;(2)特定物种的蛋白质相互作用数据库;(3)生物学通路数据库。重点介绍常用的蛋白质相互作用数据库,包括BioGRID、STRING、IntAct、MINT、DIP、IMEx、HPRD、Reactome和KEGG等。     

荧光素酶在蛋白相互作用研究中的应用

蛋白质相互作用参与细胞的多项生理活动,是生命科学研究的一个重要领域。化学发光,特别是基于生物酶的化学发光即生物发光,提供了极灵敏的检测信号,因而在实际应用中具有诸多优势。荧光素酶如萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶、海肾荧光素酶,以及近年来出现的几种低分子量荧光素酶,具有不同的酶催化特性及理化特征。它们应用于蛋白质片段互补与共振能量转移技术等各种生化检测方法,为观察蛋白质相互作用提供了更安全便捷的手段,拓宽了蛋白质相互作用检测技术的适用范围。本文综述了常用荧光素酶的特征和它们在各种蛋白质相互作用检测方法中使用的原理、策略及其适用性。     

白芸豆球蛋白的提取及其氨基酸组成研究北大核心CSCD

本文研究了白芸豆球蛋白的提取工艺、分子量和氨基酸组成。结果表明,白芸豆球蛋白最佳提取工艺为NaCl浓度2.5 g/100 mL,料液比1∶22(g/mL),提取温度55℃,提取时间5 h,在此条件下的球蛋白提取率为31.46%;用60%的硫酸铵,在4℃下盐析1 h,球蛋白的盐析得率为73.55%;球蛋白的SDS-PAGE电泳图谱中有6条蛋白亚基条带,其相对分子质量分别为97.52、47.35、33.84、29.62、26.28和21.99 ku,其中有5条与白芸豆分离蛋白的亚基条带相吻合;球蛋白的氨基酸组成种类齐全,必需氨基酸含量接近FAO/WHO推荐模式,是一种优质植物蛋白质资源。     

代谢性心血管病变-生物信息学的应用北大核心CSCD

随着高通量生物学技术在生物医学研究中的广泛应用,生物信息学在生物医学研究中的应用也越来越广泛。在代谢性心血管病变研究中,从DNA到RNA,从蛋白质到小分子,再到系统水平,都能找到生物信息学成功应用的证据。本章将简要介绍DNA、RNA、蛋白质、药物、生物网络等各层面具有代表性的生物信息学方法和工具在代谢性心血管病变研究中的应用。     

导读北大核心CSCD

本期导读主题:基因诊断技术、抗新冠抗体药物、高通量药物筛选技术、纳米抗体、多组学肿瘤药物敏感性预测、植物质体转基因技术、肠道微生物与疾病。以基因工程为基础、细胞工程为导向的现代生物技术在医药领域的广泛应用,被称之为现代医药生物技术。现代医药生物技术在疾病的诊断、预防和治疗及生物技术药物的研发中的应用,促进了诸如传染病、恶性肿瘤、心脑血管疾病等重大疾病在诊断、预防、治疗上的技术革命,已成长为现代工业的支柱产业之一的生物医药产业,服务于人类的健康事业。     

针对DNA长片段靶标的锌指筛选体系

锌指蛋白能够特异性识别目标DNA序列,常被作为分子靶向因子用于定点核酸编辑以及定点转录调控等方面,具有十分广泛的应用前景.然而,目前常规采用的实验方法得到的锌指蛋白通常结合的目标DNA序列较短,结合能力不强,因而一直难以高效运用在核酸序列与调控蛋白在基因组上的原位互作等方面的研究中.为了解决这个问题,本研究构建了一个高通量筛选系统,利用N4噬菌体gp8毒蛋白和LacZ作为报告基因,以300 bp以上的DNA长片段为靶标,来筛选能够结合多位点的锌指蛋白组合,提高锌指蛋白应用的精确度以及效率.该系统针对小鼠Nrxn-1?启动子区域进行了锌指蛋白文库筛选,得到了具有序列选择特异性的混合锌指蛋白库,并对筛选结果进行了初步功能验证.研究表明,本系统具有简便快捷的特点,不仅大幅度缩短了筛选时间,而且减少了因靶标序列DNA片段较长而不得不反复设计多位点结合锌指蛋白造成的成本浪费;筛选得到的锌指蛋白库具有较高的长片段DNA靶标结合能力和一定的序列特异性,并且能够在真核细胞内特异地结合目标DNA序列.因此,本研究建立的新型锌指筛选系统不仅可以广泛应用于高通量筛选,而且在DNA-蛋白相互作用的研究中也具有重要意义.     

酵母双杂交系统及其应用

酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system)是直接于细胞内研究蛋白质间相互作用的一种灵敏度很高,且非常有效的遗传学方法,在不同研究领域中广泛应用,并不断完善及改进,发展出单杂交系统（one-hybid system)和三杂交系统（three-hybrid system)等一系列相关的技术,克服了原系统的局限,本文对双杂交系统的原理,发展概况,应用,存在问题和前景等进行了综述。     

RAS-RAF蛋白相互作用结构域的单分子力谱分析北大核心CSCD

利用自行构建的光镊系统,通过in vitro单分子力谱测量,在单分子水平研究了RAS/RAF/MEK/ERK信号传导通路中的重要信号传导蛋白RAF与其上游G蛋白RAS结合的势垒形态。RAS与野生型RAF的单分子结合力分布情况显示,RAS-RAF结合至少涉及RAS结合区(RAS binding domain,RBD)及半胱氨酸富集区(cysteine rich domain,CRD)两个作用位点。而RAS与RAF突变体RAF(Q257R)的单分子结合力分布,存在两个以上的结合域:最可几力为95 pN的包络对应RAS-RAF[RBD]结合;最可几力为117 pN的包络对应RAS-RAF[CRD]结合;最可几力为159 pN的包络对应RAS-RAF[RBD]和RAS-RAF[CRD]同时存在(叠加)时的相互作用。而且在大于200 pN的范围(光镊有效量程之外),RAS与RAF(Q257R)的结合力仍然有相当的概率分布。这说明,突变体RAF(Q257R)比其野生型更易于与RAS结合,且可能涉及新的结合位点。该发现对解释Q257R的致病机理及设计拮抗剂均有重要指导意义。     

P100蛋白及其片段重组质粒构建与表达

目的分别将人类p100基因,p100的SN基因片段和TD片段定向连入pERFP-CI质粒,使它们可与红色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,从而为进一步研究P100蛋白及其片段的定位、功能及与其它蛋白的相互关系奠定实验基础。方法PCR分别扩增出P100蛋白全长,SN片段和TD片段基因的序列,定向克隆至真核表达载体pERFP-CI,构建相应的3种重组质粒。将构建成功的质粒转染入HeLa细胞,荧光显微镜下可观察红色荧光融合蛋白表达。结果①PCR法获得P100基因序列,长度为2659bp,SN基因片段1918bp,TD基因片段741bp;②将重组质粒直接进行双酶切鉴定可见P100片段,将经过蓝白斑筛选后的重组子经双酶切再与pERFP-CI载体连接并酶切得到SN片段和TD片段;③转染重组质粒后可观察到红色荧光蛋白的表达。结论3种外源片段成功载人pERFP-CI质粒;P100全长、SN片段、TD片段均可与红色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达。     

基于流感病毒PA_N蛋白的高通量药物筛选

流感病毒的PA N蛋白高度保守,并且具有核酸内切酶活性,是抗流感药物研发的潜在靶点。通过高通量药物筛选体系,从372种化合物中筛选出3种对流感病毒H5N1的PA N蛋白抑制作用较好的化合物。将这3种化合物分别与PA N蛋白进行分子对接模拟,结果显示它们均可以与PA N蛋白活性位点的二价金属离子和氨基酸残基相互作用,从而为抗流感病毒药物的发现提供了先导化合物。     

蜂毒肽片段的合成及其与钙调蛋白的相互作用

采用固相法设计合成了４个蜂毒肽片段：Ｍｅｌ１２、Ｍｅ１１３、Ｍｅｌ１４、Ｍｅｌ１５。应用电泳技术,抑制钙依赖性的磷酸二酯酶酶活方法和荧光技术研究了这些多肽与钙调蛋白的相互作用。结果表明这些多肽与钙调蛋白均形成１：１复合物,抑制钙依赖性的磷酸二酯酶的活性,其中Ｍｅｌ１４和Ｍｅｌ１５对钙调蛋白的结合活性与完整的蜂毒肽比较接近。     

宏基因组学在传染病防控中的应用进展北大核心CSCD

新发突发传染病暴发给全球公共卫生防控带来严峻挑战。快速识别致病病原体是应对新发突发传染病的首要问题,传统病原检测方法难以应对已知变异较大病原或未知病原,基于高通量测序的宏基因组学研究给病原识别鉴定带来了新的方法和思路。核酸提取、高通量测序和数据分析等关键技术方法不断发展,使宏基因组学成为新突发传染病防控的重要研究方向。宏基因组学可对传染病防控中的多种类型样本进行直接测序,获得高通量的测序数据,并结合病原核酸数据库,通过序列比对、变异进化分析等生物信息学方法,通过监测可疑样本对疫情暴发进行预测预警;识别传染病患者感染致病病原,为临床诊治提供指导;构建病原系统发育关系,追溯疫情潜在感染来源,最终实现新突发传染病病原的快速识别、分型、耐药及溯源分析。宏基因组学作为一项新兴技术,在传染病防控领域具有巨大潜力和发展空间。通过对宏基因组学在传染病病原监测、检测及溯源等方面的应用进展进行综述,以期为传染病防控提供新的视角。     

红花脂质转运蛋白基因的克隆及表达分析北大核心CSCD

克隆红花脂质转运蛋白基因(Lipid transfer protein,LTP),并进行生物信息学及表达分析,旨为研究LTP在红花抵抗逆境胁迫中的作用提供依据。通过RT-PCR方法从红花种子中克隆LTP基因序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建LTP与相关物种LTP的系统进化树,利用Real-time PCR方法分析在红花不同号组织中LTP基因的表达量。结果显示,LTP基因ORF全长294 bp,编码97个氨基酸,相对分子量为7.46 kD,等电点为8.91。红花LTP蛋白包含一个长为29个氨基酸残基的信号肽序列;该蛋白含有一个丝氨酸磷酸化位点;三级结构预测表明该蛋白是由3个α-螺旋和一个β-转角简单的缠绕在无规则卷曲上的简单结构。分子进化表明,红花LTP基因与十字花科的甘蓝型油菜进化关系最近。通过荧光定量PCR对红花LTP基因的组织表达特异性进行分析,结果表明Ct LTP在不同组织的表达水平具有显著差异,在种子和花中呈现高表达,而在其他组织中低表达。     

GST pull-down联合质谱筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在小鼠睾丸组织中的相互作用蛋白质北大核心CSCD

(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1(dystrobrevin binding protein 1,dysbindin-1)是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(biogenesis of lysosome-related organelles complex 1,BLOC-1)的1个亚基,在多种组织细胞中广泛表达;然而,其在睾丸组织中的作用至今尚不明确。为寻找(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质,以进一步研究(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸中的作用,本研究首先在Rosetta(DE3)菌种中表达可溶性GST-dysbindin-1融合蛋白,经谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化后,与小鼠的睾丸组织蛋白质孵育进行GST pull-down实验,并通过液相色谱串联质谱(LC MS/MS)分析筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质。利用Bio GPS数据库聚类在睾丸组织中高表达和特异性表达的互作蛋白质,运用DAVID6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程和KEGG通路等方面对筛选出的互作蛋白质进行GO(gene ontology)富集分析。本实验共筛选出108个(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的潜在互作蛋白质,其中98个为尚未报道的(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1相互作用蛋白质,7个为睾丸高表达蛋白质,5个为睾丸特异性表达的蛋白质。这些候选蛋白质主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外泌体等细胞组分中,通过与蛋白质、核酸等分子结合参与蛋白质翻译和转运、囊泡运输及凋亡等生物学过程以及氨基酸生物合成、溶酶体及蛋白酶体等生物学通路。我们推测,在睾丸组织中(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1可能通过与多种蛋白质相互作用参与精子的发生和受精等过程。     

山药Actin基因片段的克隆及表达分析北大核心CSCD

通过山药Actin基因的克隆和表达分析,为研究山药生长发育中肌动蛋白的作用及其他基因的表达和调控奠定基础。根据Gen Bank中已经公布的其他植物肌动蛋白基因(Actin)的保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR技术从山药块茎中分离出1个Actin基因cDNA片段,命名为DoActin。片段长度为1 091 bp,编码357个氨基酸,并提交Gen Bank(登录号:KU669295)。与NCBI核酸和蛋白质数据库序列比对,该序列与其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在83%以上,氨基酸序列的同源性均在97%以上。进化分析结果显示,DoActin与海枣Actin-2、木本棉Actin-7的亲缘关系最近。实时定量PCR结果显示,DoActin在山药叶片、地上茎和地下块茎以及不同发育期的块茎和叶片中表达量相对稳定,表明其适宜作为山药的内参基因。