猪传染性胃肠炎病毒重组核衣壳(N)蛋白的纯化

通过对大肠杆菌表达,经载体pPROEXHTb克隆的TGEV重组N蛋白纯化方法中一系列条件的探索,最终得到了纯化融合蛋白的最佳优化方法。即在裂解液中含有1mM PMSF的条件下,分别经过2倍体积的bufferA和bufferB洗脱后,再收集pH5．9,含有80mM咪唑的1倍体积bufferC洗脱液,在波长280nm处检测蛋白吸收值A,再将峰值经SDS－PAGE电泳分析,可得到纯度较高的融合蛋白。     

重组表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的抗原特性分析

将猪圆环病毒2型(PCV2 )去核定位信号衣壳蛋白(Nuclearlocalizationsignal_defectedcapsidprotein ,dCap)与谷胱甘肽_S_转移酶(GST)融合,在大肠杆菌中表达,经纯化和凝血酶剪切分别获得纯化的GST_dCap融合蛋白和dCap蛋白,Westernblot结果表明二者都能与猪抗PCV2血清发生特异性反应。dCap蛋白免疫小鼠制备的单克隆抗体,不仅能特异地与GST_dCap融合蛋白、dCap蛋白和纯化的PCV2粒子发生反应,而且能特异地与PK_15细胞内的PCV2病毒颗粒发生反应,其中抗dCap蛋白的单克隆抗体4C4、3F6和2G7具有阻止病毒感染细胞的能力。表明原核表达的dCap蛋白完全或部分正确模拟了PCV2天然衣壳蛋白的构像,PCV2衣壳蛋白存在阻止PCV2病毒感染细胞的功能性表位。同时重组PCV2dCap蛋白的获得为进一步研究Cap蛋白晶体结构和将重组的dCap蛋白作为抗原建立血清学诊断试剂及疫苗研究提供了基础     

牛免疫缺陷病毒基质蛋白和衣壳蛋白的可溶性表达

基质蛋白和衣壳蛋白是BIV的主要结构蛋白,在病毒感染及整个复制周期中起重要作用。本文采用 pTXB系统在大肠杆菌中表达出融合状态的牛免疫缺陷病毒 BIV基质蛋白 MA及衣壳蛋白 CA,经几丁质亲合、自剪切纯化后,获得不含融合片段的纯化产物。每克湿菌体MA产量可达毫克级,CA表达量达十毫克级。用原核表达获得的高纯度CA蛋白免疫大白兔获得的抗血清,经Western Blot 分析显示能够与病毒颗粒的 CA蛋白发生特异反应,证实表达产物具有良好的免疫原性和反应原性,可用于制备相应抗体,为研究 BIV相应基因表达变化,进行体外蛋白质相互作用试验提供工具。     

牛免疫缺陷病毒基质蛋白和衣壳蛋白的可溶性表达

基质蛋白和衣壳蛋白是BIV的主要结构蛋白,在病毒感染及整个复制周期中起重要作用.本文采用pTXB系统在大肠杆菌中表达出融合状态的牛免疫缺陷病毒BIV基质蛋白MA及衣壳蛋白CA,经几丁质亲合、自剪切纯化后,获得不含融合片段的纯化产物.每克湿菌体MA产量可达毫克级,CA表达量达十毫克级.用原核表达获得的高纯度CA蛋白免疫大白兔获得的抗血清,经Western Blot分析显示能够与病毒颗粒的CA蛋白发生特异反应,证实表达产物具有良好的免疫原性和反应原性,可用于制备相应抗体,为研究BIV相应基因表达变化,进行体外蛋白质相互作用试验提供工具.     

表达O型口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒构建及其免疫原性分析

为构建表达O型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus, FMDV）衣壳蛋白的复制缺陷型人5型腺病毒（Ad5）为载体的重组腺病毒,本研究设计、合成特异性引物并扩增出FMDV-OZK93的P12A、3B3C基因,通过融合PCR方法连接2个片段,获得P12A3B3C基因后插入到pDC316-mCMV-EGFP质粒,构建了能够表达FMDV-OZK93株衣壳蛋白前体P12A和3B3C蛋白酶的重组穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP-P12A3B3C。利用AdMaxTM腺病毒包装系统进行重组腺病毒rAdv-P12A3B3C-OZK93的包装、鉴定及扩增;并感染人胚胎肾细胞HEK-293进行表达验证。将鉴定正确且高度纯化后的重组腺病毒肌肉免疫小鼠进行免疫原性分析。结果显示,rAdvP12A3B3C-OZK93在病毒传代过程中目的基因稳定存在,且病毒滴度可达1×10^9.1 TCID₅₀/mL。间接免疫荧光和Western blotting结果均表明rAdv-P12A3B3C-OZK93在HEK-293细胞中表达了FMDV特异...     

鸡贫血病毒衣壳蛋白基因克隆、测序和比较

VP1 gene of chicken anemia virus in liver of infected chicken from Harbin was amplified by polymerase chain reaction and cloned into pUC18The recombinant vector was identified by restriction digestionThree clones were sequenced with sequencing kit ABI PRISM by TaKaRa CoLtdThe open reading frame of the VP1 gene is made up of 1,350bpIt encodes 449 amino acid residuesIt was found that there is an abundant Arg region from position 3 to 46Its isoelectric point is up to 107 because of its abundant basic amino acidsComparing this Harbin isolate with 26p4,Cux-1,82-2,Del-rose,A2,Connb,L-028,TR20,CIA-1,CAV15,2A9 showed there were 168 nucleoside differences which lead to 26 amino acid changes of the VP1The amino acid changes may influence the antigenic character of different VP1sIt was also found that there is a hyper-mutation region from amino acids position 139-157,its mutation frequency is up to 42% among these CAV's VP1s.It is necessary to research the function of this region     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因片段的克隆和表达

目的　构建pMal N重组表达载体 ,转化E .coliDH5α ,诱导表达犬瘟热病毒 (CDV)重组核衣壳 (N)蛋白。方法　采用RT PCR技术 ,从CDVRNA中扩增编码N蛋白的基因片段 ,通过连接反应 ,构建重组克隆载体和重组表达载体 ,转化感受态。E .coliDH5α细胞。通过IPTG诱导表达CDV重组N蛋白。结果　扩增出约 1 7kbCDV全长的主要结构蛋白N蛋白基因 ,通过PCR获得 5 36bpN蛋白基因片段。将N蛋白基因片段克隆入原核表达载体pMal C2 ,表达产物麦芽糖结合蛋白 (MAP)与N蛋白的融合蛋白的相对分子质量约 6 0× 10 3,与预期大小一致。结论　构建的pMal N重组载体所表达的CDVN蛋白为进一步研究CDV的特异、敏感的抗体检测方法打下基础     

腺相关病毒的衣壳装配和DNA衣壳化机制

重组腺相关病毒载体 (rAAV) 是基因治疗临床应用载体的选择之一。在简述野生型AAV基因组结构和复制机制的基础上,阐述了AAV包装过程中两个主要事件：衣壳蛋白的装配和基因组DNA的衣壳化。虽然对AAV的包装机制总体上已有一定的认识,但其详细的分子机制、构效关系仍需完善和充实。AAV病毒本身相关机制的深入研究有助于改善rAAV载体的制备技术,促进rAAV基因药物研发。     

重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白工程菌的高密度培养

在10L发酵罐中对戊型肝炎病毒衣壳蛋白在重组大肠杆菌中表达发酵工艺进行了研究,用分批培养方法探讨了不同培养基、培养基中磷酸盐浓度和Mg^2＋浓度等因素对菌体生长与重组蛋白表达的影响;用分批补料培养研究了不同的补料工艺对菌体生长与重组蛋白表达的影响,同时对重组菌诱导时期、诱导持续时间以及不同诱导温度表达包含体在尿素溶液中的溶解性进行了研究。结果表明,在优化后的培养基中,磷酸盐浓度、Mg^2＋浓度分别为80mmol/L 与20mmol/L时菌体生长与表达效果较好;分批补料培养中,37℃培养9h菌体达到对数期中期(约45OD600)为适宜诱导时期,加入终浓度为10mmol/L IPTG后诱导5h,OD600达到80以上,重组蛋白表达量达到29.74％,为最适收获菌体时间;37℃表达的包含体80％以上溶解在4mol/L的尿素溶液中,最终浓度达到14mg/mL; 10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在30L发酵罐中进行了放大培养,10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在30L发酵罐上具有可放大性与重复性, 可以应用于工业生产。     

云南省昆明地区番茄斑萎病毒核衣壳蛋白和运动蛋白变异分析

为了明确对番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)免疫的番茄YNAU335自交系表现出TSWV感病症状(抗性被打破)的原因,在排除YNAU335自交系不纯和或混杂其它感病番茄材料的因素外,选取96172I(感病)和YNAU335(抗性被打破)自交系感病植株,进行TSWV核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)和运动蛋白(movement protein,MP)基因的RT-PCR检测,并对阳性克隆进行基因测序分析。结果表明:(1)2个自交系中均克隆出TSWV的NP和MP基因,共获得5条NP(登录号:MK628735～MK628739)和3条MP(登录号:MK883723、MK883724和MK887284)多态性基因序列。(2)96172I感病材料中克隆出以上所有基因序列,YNAU335感病材料中克隆出其中的3条NP和1条MP基因序列。(3)对YNAU335中TSWV特有的NP和MP氨基酸突变位点进行分析,结果发现4个特异突变位点可能与打破YNAU335抗性有关,4个突变位点分别为:NP 18位氨基酸G突变为V,36位T突变为I,39位L突变为R,MP 274位E突变为K。(4)系统发育分析显示,5条NP和3条MP与云南省已登记的NP和MP聚类在不同的分支,表明云南省昆明地区TSWV存在丰富的遗传多样性。     

铁蛋白与法氏囊病毒核衣壳蛋白重组蛋白的原核表达及纳米颗粒胞外自组装

传染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）是传染性法氏囊病（infectious bursal disease,IBD）的病原,其导致的高死亡率使全球的家禽养殖业受到了严重的经济损失。近年来,基因工程疫苗和DNA疫苗的迅速发展为IBD更有效的防控带来了希望。基于自然合成的铁蛋白大多可以组装成较稳定的多聚体这一特点,其可以作为很多疾病的免疫原载体。根据大肠杆菌密码子的偏好性,对IBDV-VP2、铁蛋白序列进行了优化,并通过大肠杆菌表达系统进行了融合表达,通过质谱、Western blotting、SDS-PAGE检测,该融合蛋白已成功在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,且通过透射电镜可观察到大小均一的纳米级颗粒,研究结果为后期探究铁蛋白自组装对提高IBDV疫苗的广谱性、免疫原性的作用提供了参考,也为进一步研究其作为药物和抗原载体的应用机制奠定了基础。     

病毒蛋白的解离和聚合作用 Ⅰ.烟草花叶病毒(TMV)的解离及其蛋白亚基的构型变化

近年来,通过对简单病毒细微结构的研究,已经揭示了病毒的一般结构原则,即许多蛋白亚基聚合成棒或廿面体,并将活性核酸包围在中心,蛋白外壳与核酸相互作用而各自得到更高的稳定性。在此我们第一次看到蛋白质分子的聚合反应在形成最原始的生命中所起的重要作用。     

诺如病毒分子结构特征及其衣壳蛋白功能研究进展

诺如病毒(Norovirus,NoV)目前是流行病毒性胃肠炎最常见病原之一。该病原体流行株多变、致病剂量低、极易传播且缺乏理想的疫苗,致使全球范围内因NoV引起的胃肠炎频繁暴发,近年来其感染发病率呈明显增加的趋势。掌握NoV的结构特征及蛋白功能对预防NoV引起的流行性胃肠炎具有重要意义。本文对NoV的衣壳蛋白的功能及其基因组特征的研究现状做一综述。     

小鼠诺如病毒分离鉴定及病毒衣壳蛋白基因序列分析

目的了解广东地区小鼠诺如病毒（murine norovirus,MNV）的分子遗传特征和进化来源。方法采用小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞对RT-PCR检测为阳性的小鼠样本进行病毒分离,通过细胞病变、RT-PCR、间接免疫荧光试验、测序方法对病毒分离株进行鉴定。应用RT-PCR技术针对15株MNV分离株的VP1基因的1626个核苷酸片段进行基因扩增,将扩增产物连接在pMD18-T载体后转化到大肠杆菌中进行克隆。通过氨苄青霉素平皿筛选,将鉴定为阳性的克隆菌进行核苷酸序列测定及序列分析。将这15株MNV分离株与从GenBank获得的19株MNV参考株进行序列比较分析,基于VP1基因的1626核苷酸片段构建系统发生进化树,一起进行分子流行病学研究。结果从80个小鼠样本中分离到了15株MNV病毒,通过细胞病变试验、RT-PCR试验、间接免疫荧光试验和测序分析鉴定确认分离到的病毒为MNV。序列分析结果显示MNV分离株的VP1蛋白基因全长均为1626个核苷酸,广东地区15株MNV分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别在89.7%~100%和94.8%~100%之间,15株MNV分离株与其他19株MNV参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别在87.5%~92.9%和92.4%~98.2%之间。进化树分析表明来自设施A和设施D的13株病毒之间的亲缘关系较近,同属一个进化分支。来自设施B的ZD-1毒株和设施C的ZYY-163毒株与来自广东（K162）、日本（S7-P2、S7-PP3）、韩国（K4）和德国（Berlin/04/06/DE、Berlin/05/06/DE）同属另一个进化分支。结论成功分离到15株MNV病毒。遗传进化分析表明广东地区的MNV分离株来源并不相同,来自设施B和设施C的MNV分离株与国外分离株的亲缘关系较近,而来自设施A和设施D的13株MNV分离株可能是本地固有的毒株。     

草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白VP7真核重组质粒的构建及免疫效果评价

为研究开发草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)基因疫苗, 以编码其主要衣壳蛋白VP7的序列为靶基因, 克隆构建了真核表达重组质粒 pEGFP-N1-VP7。用脂质体法将其转染真核细胞COS-1和CIK进行瞬时表达, 荧光显微镜观察及特异性RT-PCR检测结果表明, 成功转染并得到了高效表达。大量扩增重组菌, 提取并制备重组质粒pEGFP-N1-VP7, 肌肉注射免疫(205) g的健康草鱼, 重组质粒按0.5和5 g分为2组, 同时设5 g空载体组及对照组。免疫草鱼22d后, 检测草鱼肠、外周血、肾脏、脾脏的呼吸暴发活性及淋巴细胞的增殖反应; 免疫草鱼21d、28d、35d、42d、56d、70d、84d和98d后, 分别尾静脉采血并分离血清, 用双抗体夹心ELISA方法进行抗体水平的测定。结果表明, 构建的含VP7蛋白的核酸疫苗既可诱导草鱼的细胞免疫, 又可诱导特异性体液免疫, 具有明显的免疫应答作用。按照每尾0.5 g重组质粒的剂量免疫草鱼后35d进行攻毒, 免疫保护率达到67%, 此研究为GCRV基因疫苗的研制提供了实验资料。       

非洲猪瘟病毒及其衣壳蛋白CD2v研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起的严重急性、出血性、烈性传染病,病死率可达100％.2018年我国发生首例非洲猪瘟疫情,并迅速蔓延,给我国生猪产业造成数百亿元的经...     

兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的克隆和序列分析

应用RT-PCR技术,从兔出血症病毒中国分离株WX84中成功扩增出预期大小为1.7kb的特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入pGEMR-T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆,序列分析表明扩增的中国株RHDV衣壳蛋白基因片段长度为1 740bp,共编码580个氨基酸.该核酸序列与其它国家报道的多株RHDV序列相互间同源性高达98.2%～99.0%,其推导的氨基酸序列同源性也达98.3%～99.1%,为极度保守片段.     

口蹄疫病毒多基因重组质粒的体外表达及衣壳组装

PCR扩增获得包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分2B编码区的目的基因片段P12X3C3D,将P12X3C3D经AflⅡ和XbaⅠ双酶切后,定向克隆于真核表达质粒载体pcDNA3.1( );另将PCR扩增获得的P12X3C3D直接与真核表达质粒载体pTARGET^TM连接,进行筛选、鉴定及DNA序列分析,分别获得重组质粒pcDNA3．1／P12X3C3D、pTARGET／P12X3C3D。将重组质粒分别转染BHK-21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原,用磷钨酸负染,以电子显微镜观察转染重组质粒的细胞中组装的口蹄疫病毒空衣壳。结果表明,口蹄疫病毒基因组片段正确克隆到真核表达质粒载体上,重组质粒pcDNA3．1／P12X3C3D、pTARGET／P12X3C3D均可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白。其中重组质粒pTARGET／P12X3C3D表达的口蹄疫病毒抗原蛋白,能够在细胞内正确组装成病毒空衣壳。     

草鱼呼肠孤病毒的三维重构与衣壳蛋白特性

草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)为呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属一新成员. 最新的基因组序列分析发现, GCRV与哺乳动物呼肠孤病毒(mammalian reovirus, MRV)具有高度的同源性. 为了解GCRV致病机理, 进行了分辨率达到17 Å的三维重构与衣壳蛋白特性研究. 结果表明: GCRV颗粒呈多层排列, 包括RNA核心与内壳层、中间层及外壳层. 由200个按T = 13对称排列的三聚体组成外衣壳, 其典型特征是在5次轴上出现三聚体缺失凹陷区, 暴露出中间层三聚体亚单位. 内壳层由120个单体组成, 按T = 1排列, 结构特点与呼肠孤病毒科成员内衣壳特征相一致. 衣壳蛋白电泳显示, GCRV颗粒含有7种蛋白(VP1-VP7)组分, 与MRV衣壳蛋白特性相近, 两者在衣壳结构组成上的相似性与基因组序列的高度同源性相吻合. 此结果对进一步研究GCRV与宿主细胞相互作用机理具有指导意义.