增强UV-B辐射对小麦叶肉细胞核内F-actin的影响

以增强紫外线B(UV-B)处理的小麦幼苗叶肉细胞核为材料,以异硫氰酸荧光素标记鬼笔环肽(FITC-Ph)荧光标记后,利用流式细胞仪以及激光共聚焦显微镜,对核内肌动蛋白丝(F-actin)进行研究。结果表明:小麦细胞核内确实存在F-actin; 以FITC-Ph标记后用流式细胞仪检测显示,以10.08 kJ·m^-2·d^-1增强的UV-B处理后的小麦叶片细胞核内F-actin的含量升高; 激光共聚焦技术显示细胞核内F-actin的分布,发现小麦叶肉细胞核核仁处F-actin含量较高。推测可能是增强UV-B辐射导致细胞质内F-actin骨架断裂进入细胞核。究其具体作用还待进一步研究,该研究推测其与“分束分裂”有关。     

利用流式细胞仪分选拟南芥根尖发育早期非根毛细胞

建立了应用流式细胞仪分选植物特定类型细胞的方法。以拟南芥(Arabidopsis thaliana)Wer::GFP转基因株系为材料,用激光共聚焦显微镜鉴定GFP的表达位置,采用酶解法制备拟南芥根尖原生质体,应用流式细胞仪荧光激活细胞分选技术(FACS)分选收集GFP阳性细胞,并提取细胞的RNA。结果表明,Wer::GFP转基因株系仅在根表皮发育早期的非根毛细胞中表达GFP;利用酶解法制备的根尖原生质体数目较多;从FACS分选收集的细胞中提取的RNA质量较好,可用于研究特定类型细胞的基因表达谱。应用流式细胞仪分选拟南芥非根毛细胞的方法为研究植物特定类型细胞的基因表达谱及基因功能奠定了技术基础。     

利用流式细胞仪分选拟南芥根尖发育早期非根毛细胞

建立了应用流式细胞仪分选植物特定类型细胞的方法。以拟南芥（Arabidopsis thaliana）Wer：：GFP转基因株系为材料,用激光共聚焦显微镜鉴定GFP的表达位置,采用酶解法制备拟南芥根尖原生质体,应用流式细胞仪荧光激活细胞分选技术（FACS）分选收集GFP阳性细胞,并提取细胞的RNA。结果表明,Wer：：GFP转基因株系仅在根表皮发育早期的非根毛细胞中表达GFP;利用酶解法制备的根尖原生质体数目较多;从FACS分选收集的细胞中提取的RNA质量较好,可用于研究特定类型细胞的基因表达谱。应用流式细胞仪分选拟南芥非根毛细胞的方法为研究植物特定类型细胞的基因表达谱及基因功能奠定了技术基础。     

Cu2O纳米颗粒对小麦根系形态及遗传毒性的影响

为了阐明Cu₂O纳米颗粒(NPs)暴露对植物根系的毒性效应,本研究以小麦品种‘周麦18’为材料,采用水培试验方法,研究了10、50、100和200 mg·L^-1浓度的Cu₂O-NPs对小麦幼苗生长、根系活性、形态结构及细胞遗传学毒性的影响。结果表明: 不同浓度的Cu₂O-NPs降低了小麦幼苗的根芽长度、鲜重、根活性和根冠比,增加了初生根的数量;随着Cu₂O-NPs浓度的升高,幼苗根伸长区缩短、根系变硬变脆、根径增加、根冠变大;100 mg·L^-1浓度的Cu₂O-NPs处理下,小麦根尖有丝分裂指数显著降低,根尖细胞形状不规则化、质壁分离、细胞出现空泡化、细胞核核膜模糊、核内染色体异常。在水培条件下,Cu₂O-NPs对小麦幼苗具有一定的遗传学毒性效应,从而影响小麦幼苗的生长发育和根系形态结构。     

菌落PCR改良技术快速鉴定阿萨希毛孢子菌的实验研究

目的探索快速鉴定阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)的简便方法。方法分别应用直接法、直接离心法、酶解法、酶解改良法4种方法进行样本预处理后的菌落PCR技术检测16株T.asahii,评价上述4种方法的敏感性和微量样本阳性率,同时与DNA常规提取法PCR结果进行比较。结果酶解改良法、直接法、常规提取法敏感性均为102CFU/m L,阳性率分别为93.75%、75%、50%;直接离心法敏感性为104CFU/m L,阳性率为43.75%;酶解法结果为阴性。结论酶解改良法是一种简便快速的PCR模板获取方法,适用于菌落PCR技术对T.asahii进行快速鉴定时的样本预处理。     

鲍姆木层孔菌（桑黄）脂溶性提取物对PC12神经元细胞衰老的保护作用

鲍姆木层孔菌（桑黄）Phellinus baumii脂溶性提取物对叠氮钠诱导PC12神经元细胞衰老的保护作用。用叠氮钠作用于体外培养的PC12细胞,并用该菌脂溶性提取物对其进行保护,分别用MTT法、流式细胞仪法、细胞核染色法和β-半乳糖苷酶检测试剂盒检测细胞活力、早期凋亡率、晚期凋亡率和β-半乳糖苷酶阳性细胞率变化,筛选出具有延缓细胞衰老的有效部位和有效作用浓度。通过细胞活力检测发现正丁醇萃取的活性部位可以有效保护叠氮钠诱导的细胞活力下降,其有效工作浓度为200mg/L。流式细胞仪和细胞核染色测定结果均表     

小麦根蛋白提取与双向电泳方法的优化与应用

为了建立一套适合小麦根蛋白质组分析的双向电泳系统（2-DE）,得到更加清晰的电泳图谱,本研究以小麦幼苗根系为材料,对根蛋白的提取方法、上样量等进行了优化。研究发现,上样量为1200μg时,Trizol抽提法提取的蛋白能够获得图像清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,基本满足小麦根系蛋白质组学的分析和研究。     

一种来源于脆弱类杆菌的α-半乳糖苷酶的理化性质及其酶解B型红细胞的工艺研究

利用α-半乳糖苷酶去除红细胞表面的B抗原是制备通用O型红细胞的有效方法.本文在克隆表达纯化脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶的基础上对其理化性质进行了研究,该酶的分子量为64908Da,等电点在7.12～7.30之间,最适温度为41℃,最适pH为5.6～6.0,其理化性质适合用于B型红细胞的血型改造;为了确定高效、快速、温和的酶解条件,本文对酶解B型红细胞的工艺进行了优化.通过研究缓冲液对酶与红细胞结合的影响,确定了最佳酶解缓冲液为250mmol/L甘氨酸和3mmol/LNaCl,pH6.8;酶解的最适红细胞压积为40%,酶解温度为26℃,酶解时间为1h.利用优化的酶解工艺获得的B-ECORBCs形态及结构功能指标均正常,流式细胞结果证明其B抗原和H抗原标记率与O型红细胞相当,说明制备B-ECORBCs的工艺已成熟.这种工艺具有酶用量少、酶解条件温和、制备过程简单和时间短等优势,具有很好的临床应用前景.     

麻疯树几丁质酶性质的研究

为了评价麻疯树几丁质酶的性质,本研究采用不同pH的提取缓冲液提取麻疯树种子的几丁质酶,并比较分析了不同温度、不同反应时间对几丁质酶活性的影响。结果表明,在提取液pH为7．0时获得的几丁质酶活性最高;且在55℃时与底物胶体几丁质温育60min后可达最高酶活性。同时,本研究还提取麻疯树幼苗不同器官几丁质酶,并比较其比活力,结果表明,在叶中几丁质酶比活力最高,而根中比活力最低。实验结果为进一步研究麻疯树提供了理论依据。     

小麦根尖细胞同步化诱导和DNA纤维的制备

为了简易快速地获得大量小麦（Triticum aestivumL．）中期染色体和DNA纤维,以普通小麦根尖为材料,采用羟基脲（hydroxyurea,简称HU）,氟乐（trifluralin）结合的双阻断法进行了染色体中期同步化诱导。结果表明,染色体有丝分裂中期指数（metaphaseindex）达70％～80％;以同材料小麦黄化苗提取小麦细胞核,成功制备出小麦DNA纤维。这为研究细胞有丝分裂的调控、染色体形态结构、易位染色体检测和易位染色体片段的精确测量与定位等提供了新的技术支撑。     

杨柳科植物倍性测定不同解离缓冲液效果比对分析

多倍体育种是杨柳科植物育种的重要手段,利用流式细胞仪可以对植物的倍性进行检测,然而解离缓冲液选择是否合适对检测结果有重要影响。本研究利用不同缓冲液对杨柳科植物叶片进行了解离,然后用流式细胞仪测定了解离细胞核的前向散射光(FS)、侧向散射光(SS)、相对荧光强度(FL)、G_0/G_1期峰的变异系数(CV)以及背景碎片系数(DF)等参数。结果比对分析表明,SLB-3缓冲液解离出的细胞核DNA平均荧光强度高、变异系数小,同时对所有被测物种均有较理想的解离效果,是利用流式细胞仪测定杨柳科植物倍性的理想解离缓冲液。SLB-3解离缓冲液的配方为:0.5 mmol·L~(-1)四盐酸精胺,30 mmol·L~(-1)柠檬酸钠,200 mmol·L~(-1)Tris,80 mmol·L~(-1)KCl,0.5%(v/v)Triton X~(-1)00,p H7.5。通过研究,我们建立了利用FCM测定杨柳科植物倍性的实验体系,为杨柳科植物多倍体育种提供了可靠的实验技术手段。     

空间条件对植物细胞和亚细胞器的影响

空间条件对细胞核的影响是各种各样的。松树苗的细胞核数量减少,小麦核体积增大。缩合染色质体积增加,降低了它的功能,也影响了蛋白质合成。空间生长的豌豆、黄瓜幼苗中内质网的潴泡减少,水芹的内质网增多。玉米幼苗线粒体内膜序性降低,体积膨胀,但玉米根冠细胞中的线粒体体积比地面的减少31％。豌豆根分生组织中的高尔基体在失重下其潴泡形态有变化。在微重力下玉米根冠的高尔基体比对照少50-     

基于液氮研磨法的流式细胞术检测马铃薯倍性的研究

染色体组倍性鉴定是马铃薯种质资源评价的重要内容,流式细胞仪能够快速、准确地对细胞核DNA含量进行测定,从而广泛用于检测植物染色体组倍性。建立适于马铃薯倍性鉴定的高通量流式细胞术体系,对马铃薯育种工作提供依据。以20份马铃薯合作88孤雌诱导后代为材料,用液氮研磨法制备叶片细胞核悬液,并将其与传统刀片切碎法制备的细胞核悬液进行比较,对已知四倍体马铃薯合作88和二倍体马铃薯IVP101进行染色体倍性测定,结果发现这两种方法在倍性测定结果之间无明显差异,但是液氮研磨法操作简单、耗时少。基于液氮研磨法的流式细胞术可快速、准确检测其倍性。另外,在液氮研磨法中,对细胞核悬液染色时间的长短(从15 min到12 h)并不会影响倍性测定结果,从而方便研究人员在实际操作中灵活选择染色时间。     

阿魏酸钠生物学活性——对高糖诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

探讨阿魏酸钠对高糖诱导的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞凋亡的保护作用及其机制。分别通过葡萄糖培养液,以及具有阶梯阿魏酸钠含量的葡萄糖混合培养液进行SH-SY5Y细胞培养,持续时间为48 h。对其中细胞的存活率使用MTT比色法检测;通过Hoechst33258染色观察细胞核形态改变;细胞凋亡率引入流式细胞仪进行测验;离心获得细胞上清液后,使用对其中含有的8-羟基脱氧鸟苷酸(8-OHd G)组分使用酶联免疫吸附法检测。结果显示阿魏酸钠保护组细胞存活率明显升高,细胞核形态明显改善,组细胞早期凋亡率、上清液中8-OHd G的分泌量均明显降低。结果可见,阿魏酸钠对高糖诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有保护作用,其机制可能与阿魏酸钠的抗氧化作用有关。     

He-Ne激光和增强UV-B辐射对小麦幼叶叶绿素荧光和Rubisco活化酶的影响

选用小麦‘ML7113’品种为材料,人工模拟He-Ne激光(5mJ·s-1·mm-2)、增强UV-B(10.8kJ·m-2·d-1)辐射及两者复合辐照进行处理,利用叶绿素荧光仪、考马斯亮蓝G-250染色法和PCR技术研究7d龄小麦幼苗叶绿素荧光特性、Rubisco活化酶含量、基因表达量及其基因序列的变化。结果表明:(1)与对照组相比,增强UV-B辐射后,小麦幼苗叶绿素荧光特性减弱,Rubisco活化酶含量及其基因表达量均下降;而低剂量的He-Ne激光辐照后能够在一定程度上修复经UV-B辐射后对小麦幼苗叶绿素荧光特性所造成的损伤,且使Rubisco活化酶含量及其基因表达量上升。(2)与对照组相比,经He-Ne激光和增强UV-B辐射以及两者复合辐照处理后基因序列均出现两个相同的点突变,但并未造成氨基酸序列的变化。研究认为,低剂量He-Ne激光辐照能够在一定程度上修复受UV-B辐射小麦幼苗叶绿素荧光活性、Rubisco活化酶含量及其基因表达量的降低;He-Ne激光和增强UV-B辐射对小麦幼苗Rubisco活化酶活性的影响可能发生在其转录水平,从而使小麦光合能力发生相应的变化。     

小麦TILLING分析中CELⅠ酶切及PCR反应体系的优化

在小麦中建立稳定的基于CELⅠ酶切的目的基因突变位点检测技术,有助于高通量鉴定目的基因片段的点突变及提高突变检测效率。本研究以冬小麦品种新麦18空间诱变SP2群体为材料,以小麦糯质基因Waxy为目标片段,通过优化基因组DNA提取方法、调整PCR反应体系中dNTP、Mg2+及引物浓度、改变目标片段CELⅠ酶切缓冲液成分,以及调整纯化过程中的空气相对湿度等方式,优化了小麦TILLING技术体系。在利用PVP-40法提取DNA过程中,研磨器振动频率提高到30/s,KAc溶液的反应时间延伸为20min时,基因组DNA质量和纯度最佳;在设定的浓度范围内dNTP和Mg2+浓度对产物影响差异不明显,均能高效扩增出目的条带。引物浓度对产物影响差异显著,最佳引物浓度为0.4μmol/L。20μl酶切体系中,最佳CEL I酶浓度为0.1U且利用超纯水代替CELⅠ缓冲液。最终在小麦中建立起了基于CELⅠ酶切的高通量TILLING筛选技术体系。     

巴西橡胶树胶乳黄色体蛋白提取及双向电泳方法初探

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）的黄色体在胶乳凝固和保护植株过程中有重要作用。本文比较使用三氯醋酸/丙酮（TCA/ ACE）、Tris缓冲液、磷酸缓冲液提取橡胶树胶乳黄色体总蛋白的双向电泳效果。确定一种适合双向电泳的蛋白提取方法。结果表明Tris缓冲液提取法得到的双向电泳图谱可以达到300个,尤其是低丰度蛋白呈现性较好,适合提取黄色体蛋白以进行双向电泳。     

巴两橡胶树胶乳黄色体蛋白提取及双向电泳方法初探

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)的黄色体在胶乳凝固和保护植株过程中有重要作用。本文比较使用三氯醋酸/丙酮(TCA/ ACE)、Tris缓冲液、磷酸缓冲液提取橡胶树胶乳黄色体总蛋白的双向电泳效果。确定一种适合双向电泳的蛋白提取方法。结果表明Tris缓冲液提取法得到的双向电泳图谱可以达到300个,尤其是低丰度蛋白呈现性较好,适合提取黄色体蛋白以进行双向电泳。     

几种直接从高温热泉沉积物中提取DNA方法之比较

用酶解法,化学裂解法和微波炉法,冻融法等物理裂解方法组合出5种方法直接从滇西一个高温热泉沉积物提取DNA。经常规的琼脂糖凝胶电泳检测,发现用溶菌酶,蛋白酶K酶解,SDS化学裂解结合微波炉法裂解不仅可以得到较大量的DNA。而且碎片段较少,提取出来的DNA经RNA酶和蛋白酶K处理后可直接进行PCR扩增。同时DGGE（变性梯度凝胶电泳）电泳检测,结果表明,此法不仅可以得到该种环境中较多微生物分类单位的DNA,而且还能够较好地体现出它们在量上的差异。     

微量限制性酶切法快速鉴定阳性重组克隆

介绍了一种简便的能在１ｈ内阳笥重组克隆的方法。该方法准确性高于ＰＣＲ法,比常规先小鼠提取质粒再酶切鉴定的方法简便、快速。同时配制的１种适合多种酶切反应的缓冲液,每种限制性内切酶在该缓冲液中的活笥与其最适下的活性相当。２种或２种以上的酶切反应可以同时在这种缓冲液中进行,不用更换缓冲液一步安成。