粗皮侧耳栽培种EST-SSR分子标记的开发应用及初级核心种质库的构建

根据已知的粗皮侧耳、灵芝、香菇EST序列开发出9条粗皮侧耳EST-SSR引物、58条灵芝EST-SSR引物和35条香菇EST-SSR引物,从中筛选出4条多态性好、条带清晰的引物,对选取的185株粗皮侧耳栽培种进行扩增分析。共扩增得到59条带,每个引物扩增条带数为12–19条,扩增片段在100–1,100bp之间。根据扩增结果构建了一个含47株粗皮侧耳栽培种的初级核心种质库P-core47。分析得出P-core47占原群体样品数25%,占资源库的13%,有效等位基因数和多态性位点占有率与原群体一致,多样性指数均值比原群体高0.12747,在原群体的低频率等位基因有所增强。P-core47内菌株来源广泛,基本已覆盖各个栽培地区,统计的质量性状和数量性状均可在其中找到代表性菌株。表明了用EST-SSR分子标记构建粗皮侧耳栽培种初级核心种质库的可行性。     

杂交兰转录组SSR信息分析及EST-SSR标记开发应用

该研究主要开发筛选适用于杂交兰的EST-SSR引物,为杂交兰种质资源评价和遗传变异研究等提供可靠的分子标记。该研究对杂交兰进行转录组高通量测序,挖掘SSR位点和开发EST-SSR标记,并对不同种质的遗传多样性进行分析。结果表明,从31724条杂交兰Unigene中检测出18603个SSR位点,SSR出现频率为58.64%;SSR位点中的主导类型是单核苷酸重复,占总SSR的65.10%,其次是二核苷酸(23.56%)和三核苷酸(10.76%)重复;优势重复基元为A/T、AG/CT、AT/AT和AAG/CTT,分别占总位点的64.72%、13.74%、8.19%和2.51%。利用Primer Premier 5.0共设计了565对SSR引物,从筛选出的64对有效扩增引物中随机选择28对引物,对40份杂交兰种质进行多态性验证与遗传关系分析,其中16对(占57.14%)引物表现出可重复的高多态性,平均多态信息量(PIC)达0.789。基于扩增的多态性SSR信息,40份种质资源可聚为4类,聚类结果与其遗传背景基本一致。该研究印证了转录组测序获得的Unigene是SSR标记开发的有效来源,开发的EST-SSR引物可为杂交兰及近缘种的良种鉴别、遗传图谱构建、分子标记辅助育种及功能基因挖掘等提供有价值的候选标记。     

基于转录组测序的茄子SSR标记开发

应用Trinity软件对茄子转录组测序数据组装,得到总长度为47919660 bp的45404条Unigenes,MISA从中检索到8316个SSR位点,发生频率为18.32%,平均5.63 kb一个位点。SSR位点中单碱基重复类型最多,为5372个,占到64.60%;其次为三碱基重复1628个,占到19.58%。三碱基重复中AAG/CTT是优势重复单元,占三碱基重复数的31.6%;二碱基重复中AG/CT是优势重复单元,占二碱基重复数的42.3%。利用Primer 3设计引物,共得到858对SSR引物,随机选取100对引物对17份茄子材料进行扩增,结果表明:有84对可以扩增出条带清晰的片段,有47对引物扩增片段为多态性片段。对47对多态性引物进行分析,多态性信息含量范围为0.10~0.64,平均多态性信息含量为0.32,UPGMA聚类分析可将17份材料分为3类。以上结果表明,基于茄子转录组测序开发的SSR标记可以为茄子的遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富的标记来源。     

茄子EST-SSR分子标记的鉴定及多态性分析

为了加快茄子(Solanumm elongena L.)分子遗传学研究和分子标记辅助育种,对其开展转录组测序,采用软件MISA(MicroSAtellite)对茄子转录组中的SSR位点进行搜索,共检测出5 562个SSR位点,分布于3 438条Unigene中,出现频率为13.23%,平均分布距离为9.73 Kb。三核苷酸和二核苷酸重复出现频率占优势,分别有3 546个和1 270个,分别占总SSR的63.75%和22.83%。利用Primer 3.0设计引物,随机选择其中20 bp以上SSR序列的100对引物进行合成,92对引物实现有效扩增,占100对SSR引物的92%,从有效扩增引物随机选取30对引物对29份茄子材料进行扩增及多态性评价,30对均有多态性差异。通过UPGMA作图,供试的29份不同的茄子材料被划分为2类。基于茄子转录组测序开发的EST-SSR标记具有较高的可用性,为茄子种质鉴定、亲缘关系分析及遗传图谱构建等提供更丰富的标记来源。     

华仁杏幼果转录组SSR信息分析及其分子标记开发

为了解华仁杏微卫星(SSR)分布规律,开发EST-SSR引物,为华仁杏种质资源评价与辅助育种提供有效的鉴定标记。本研究采用生物信息学方法对华仁杏幼果转录组SSR位点的数量、频率、分布特征进行了统计分析;利用转录组数据进行了SSR引物的筛选和开发,并利用开发出的引物对华仁杏29个无性系进行了多态位点检测和鉴定。结果表明:华仁杏幼果EST-SSR的分布频率为19.21%,重复单元的重复次数分布在5~24次之间,优势重复基序为单核苷酸、2核苷酸、3核苷酸,分别占总SSR的19.81%、46.47%、32.49%。参试的139对引物中有39对引物可扩增出目标序列,其中24对引物可检测出多态性位点,占参试引物总数的17.27%。24对引物在29个华仁杏无性系中共检测出了170个等位基因位点,多态性信息含量(PIC)介于0.33~0.87之间,平均为0.64,其中高多态性引物19条,占多态性引物比例的79.2%。本研究对华仁杏转录组SSR信息进行了分析,并开发出了19对高多态性SSR引物,5对中多态性引物,为华仁杏种质资源评价及分子标记辅助育种提供了基础。     

龙眼顶芽转录组简单重复序列(SSR)标记信息分析及分子标记开发

随着新一代测序技术的发展,大量的转录组数据和表达序列标签(EST)成为开发简单重复序列(SSR)标记的可利用资源。本研究利用MISA软件筛选龙眼(Dimocarpus longan)顶芽转录组数据库序列,从114 445条龙眼转录组unigene序列中发现11 546个SSR位点,SSR出现频率为10.09%。其中1 975条unigene含有两个或两个以上EST-SSR位点,占所有SSR位点的比例为17.10%,SSR出现的平均距离为7.52 kb。从龙眼转录组SSR核苷酸基序类型来看,二核苷酸(52.11%)和三核苷酸(46.15%)出现频率最高,占所有核苷酸出现频率的99.26%。在龙眼转录组SSR中二核苷酸重复基元出现频率最高的是AG/CT(4 250个,占36.81%),三核苷酸重复基元出现频率最高的是AAG/CTT(1 109个,占9.61%)。对含SSR位点的9 571条unigene序列进行引物设计,共设计出了8 347对SSR位点特异引物。随机挑选合成50对EST-SSR引物,以‘石硖’、‘储良’、‘古山2号’、‘立冬本’等四份龙眼材料的基因组DNA为模板对这批引物进行PCR扩增、筛选,结果表明,其中21对引物能产生理想的PCR产物,有效扩增率为42%;16对引物扩增条带具有多态性,占有效引物的76.2%;16对多态性引物共扩增获得50个条带,其中多态性片段21个,每对引物平均产生1.31个多态性片段。     

柱状田头菇EST-SSR的开发及应用研究

借鉴香菇EST序列设计的40对引物对柱状田头菇进行了EST-SSR引物通用性研究。结果显示,挑选的28对引物中多态性好且稳定的有13对,通用率达46.4%。PCR扩增产物获得具有多态性条带81条,每对引物扩增条带的数目范围为2–14,平均5.86条,扩增片段大小在100–400bp之间。多态信息含量（PIC）在0.3750–0.8032,平均0.7084。研究结果表明,EST-SSR分子标记在食用菌的遗传多样性和比较基因组学研究中起到重要的作用。     

陆地棉EST-SSRs在向日葵中的通用性研究

利用陆地棉EST-SSR s(Expressed sequence tags-s im p le sequence repeats)在陆地棉和向日葵品种中进行了通用性分析。利用本实验室合成的1 500对陆地棉EST-SSR s在4个陆地棉品种中进行了扩增,有效扩增比率为95%,扩增产物符合预期大小(50~500 bp);每对引物可以检测到1~6个数目不等的片段(a lle le),平均约为2.7个;每2个陆地棉之间大约有7%~9%的多态性。从1 500对陆地棉EST-SSR s引物中选取400对引物在向日葵中进行了扩增,有效扩增比率为63%,每对引物可以检测到1~6个数目不等的片段,平均为1.7个,片段大小介于50~500 bp之间。选取了200对在向日葵中得到有效扩增的引物对向日葵G 101的父母本进行了多态性筛选,约25%引物具有多态性。结果表明,陆地棉EST-SSR s在向日葵中具有较高的通用性,可用于向日葵比较基因组研究和分子标记研究。     

基于转录组的白沙蒿SSR分子标记的开发

[目的]利用转录组数据开发白沙蒿的SSR分子标记,探索其分布特点并对SSR引物进行有效性检测。[方法]以9个不同样品白沙蒿转录组数据为基础,利用MISA软件对1kb以上的Unigenes进行筛选;把重复序列单元相同、重复次数存在差异、侧翼序列长度完全相同的SSR位点作为引物合成的标准,采用PCR技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对其有效性进行初步验证。[结果]在20 149条Unigenes中共检测出5 692个SSR位点,发生频率为22.95%,平均每隔6.66 kb出现1个位点。优势重复单元单、三、二核苷酸分别占总SSR位点的52.09%、28.30%和17.38%。经过验证筛选出具有多态性且扩增条带清晰的引物18对。[结论]印证了利用白沙蒿转录组测序产生的Unigene信息可作为开发SSR标记的有效来源,且开发的有效SSR引物可用于后续群体的相关研究中。     

中华鲟性别相关的扩增片段长度多态性分子标记筛选

性别鉴定是生产养殖和物种保护中常用的技术。中华鲟Acipenser sinensis是我国特有的一种大型海河洄游性鱼类,已极度濒危。由于中华鲟性成熟时间长,缺乏第二性征,基于外部特征难以进行性别鉴定,因此,筛选中华鲟性别特异性分子标记具有重要意义。利用扩增片段长度多态性(AFLP)分子标记,用10条Eco R I-ANN引物和8条Mse I-CNN引物组成的80对引物,对9尾雄性和15尾雌性中华鲟个体进行PCR扩增和毛细管电泳荧光分型,检测其基因组DNA多态性,寻找与其性别相关的分子标记。在100~500 bp范围,共获得864个位点,其中具有多态性DNA位点411条,多态性位点比例为48.58%,并未发现雌雄特异性位点。但发现33个位点在雌雄个体中的比例存在较大差异,聚类分析显示大部分雄鱼聚为一支,雌鱼聚为一支,从而推断这些位点可能与中华鲟性别具有密切相关性。该研究首次尝试在中华鲟基因组中寻找性别特异性的AFLP分子标记,尽管未找到特异性标记,但这些数据为进一步研究中华鲟性别相关基因和性别决定机制奠定了基础。     

燕麦EST-SSR标记的开发和利用

为拓展分子标记在燕麦种质资源分析与鉴定中的应用,利用公共数据库中的25376条EST(expressed sequence tags)序列,开展了燕麦EST-SSR功能性标记的开发和利用研究。25376条EST序列经拼接去冗余后获得了11618条序列,从中筛选出含有不同重复基元的SSR且重复次数较多、长度较长的556条EST序列进行引物设计,开发了50对燕麦EST-SSR引物,通过筛选得到40对有效的EST-SSR引物。选取其中4对引物对5个燕麦种质资源进行了PCR扩增及产物测序,结果表明扩增条带多态性是由SSR差异造成的。利用40对ESTSSR引物对15个六倍体燕麦种质资源进行遗传多样性分析,共扩增出89个等位基因,平均每对引物产生2.23个等位基因;UPGMA聚类分析表明,15个六倍体燕麦种质资源在Dice系数为0.93处聚为3支,基本上是按照不同种进行聚类的,在相同种中又根据地理来源分别聚集成支。利用40对EST-SSR引物对31个遗传背景不清的燕麦种质资源进行基因组倍性鉴定,发现这些种质中可能存在有四倍体和二倍体的燕麦新资源。本研究开发的燕麦EST-SSR功能性标记将在燕麦遗传多样性分析、遗传图谱构建及燕麦属内种间基因组鉴定等方面发挥重要作用。     

不同类型油菜EST-SSR标记的通用性及其应用研究

以10个甘蓝型油菜、11个芥菜型油菜和7个白菜型油菜品种为材料,选用已报道的14对白菜EST-SSR引物和8对油菜EST-SSR引物,探索其在3种类型油菜中的通用性,并利用筛选出的在3类油菜中有通用性和多态性的EST-SSR标记对供试油菜品种进行聚类分析.结果表明:(1)选用的14对白菜EST-SSR引物和8对油菜EST-SSR引物,在供试的3种类型油菜中都有扩增,完全可用.(2)在白菜型、甘蓝型和芥菜型油菜品种中扩增显示出多态性的引物数分别为18、16 和14对,其中有10对引物在3种类型油菜品种间扩增产物具有多态性.(3)利用这10对扩增多态性EST-SSR引物对供试油菜品种聚类分析,结果显示,在遗传相似系数为0.67时,3种类型油菜品种分别独自聚为一大类,表明开发和建立不同类型油菜间可通用的EST-SSR标记是可行且有应用价值的.     

水涝胁迫下辣椒转录组特征分析及EST-SSR标记开发

为开发适当的生物学工具以探索辣椒对水涝胁迫应答的分子机制,该研究对不同淹水处理的辣椒样本进行转录组分析,获得了丰富的序列数据,并在此基础上对SSR分子标记进行挖掘。结果表明:(1)辣椒转录组检测共获得128 939个Unigene,其总长度平均长度和GC含量分别是55 082 725、1 101 bp和40.57%。与七大功能数据库进行比较,分别有102 123个(NR: 79.20%)、110 157个(NT: 85.43%)、70 203个(SwissProt: 54.45%)、73 539个(KOG: 57.03%)、77 646个(KEGG: 60.22%)、77 442个(GO: 60.06%)以及68 216个(Pfam: 52.91%)个Unigene获得功能注释。发现脂质代谢、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、环境适应、次级代谢物生物合成、信号转导和翻译等途径在辣椒水涝胁迫应答中起重要作用。(2)从辣椒转录组数据中发掘到26 574个SSR位点分布在24 889个Unigene中。SSR的出现频率为20.61%,其中单核苷酸重复所占比例(37.26%)最高,其次是三核苷酸(31.00%)和二核苷酸(25.44%)重复类型,三者占EST-SSR总数的93.70%。在单核苷酸与二核苷酸中最多的基序类型为A/T、AG/CT和TC/GA,然后是AT和TA; 三核苷酸中最常见的基序类型是TTG/CAA和ACA/TGT。(3)用Primer 3在线工具设计了10 002对EST-SSR引物,随机选择30对引物进行PCR扩增,均可获得有效扩增。对3份辣椒材料进行扩增,其中7对引物可以扩增出目标条带。综上所述,在辣椒中优势SSR重复类型的基序结构和其他品种基本相近,并初步探索了辣椒水涝胁迫应答的分子机制,开发了EST-SSR标记,为辣椒耐涝遗传育种提供了参考。     

普通小麦SSR和EST-SSR引物对冰草通用性的比较分析

选用定位于普通小麦7个部分同源群的534对SSR引物和351对EST-SSR引物分别对普通小麦品种‘Fukuho’和四倍体冰草‘Z559’的基因组DNA进行扩增,结果显示:有475对(89.0%)SSR引物和314对(89.5%)EST-SSR引物对‘Fukuho’能有效扩增,226对(42.3%)SSR和258对(73.5%)EST-SSR引物对‘Z559’能有效扩增,表明小麦EST-SSR对冰草的通用性明显高于SSR;扩增强带比率SSR和EST-SSR引物分别为76.1%、84.1%,说明小麦EST-SSR在冰草上扩增带的质量亦优于SSR。选择上述在‘Fukuho’和‘Z559’基因组DNA之间有多态性扩增且带谱清晰的SSR和EST-SSR引物各60对,对‘Fukuho’、‘中国春’、‘北京8号’和二、四、六倍体冰草‘Z804’、‘Z559’、‘Z1075’的基因组DNA再行PCR扩增,结果显示,40对(66.7%)SSR和22对(36.7%)EST-SSR引物在‘Fukuho’、‘中国春’和‘北京8号’间扩增产物表现多态性,且前者高于后者;50对(83.3%)SSR和52对(86.7%)EST-SSR引物在冰草‘Z804’、‘Z559’和‘Z1075’间扩增产物表现多态性,两者相当。通用性、多态性和扩增强带比率综合比较表明,普通小麦EST-SSR和SSR经筛选虽都能转用于冰草,但两者相比EST-SSR更优。     

黄秆乌哺鸡竹转录组EST-SSR分子标记开发与应用

基于黄秆乌哺鸡竹(Phyllostachys vivax McClure f. aureocaulis N. X. Ma)转录组数据,利用生物信息学方法分析其SSR位点分布特征,同时针对“黄秆”和“绿秆”两种类型差异表达基因序列中的SSR位点设计引物,并利用刚竹属(Phyllostachys)材料验证其通用性。结果显示,从黄秆乌哺鸡竹89 874个Unigenes序列中,共鉴定出12 651个SSR位点,分布频率为14.07%;其中单核苷酸重复基序最多(51.02%)、其次为3核苷酸(25.61%)和2核苷酸(21.94%);共发现80种重复基序,其中出现频率最高的为A/T(46.60%),其次是AG/CT(13.97%)和CCG/CGG(9.90%)。在设计的51对引物中,44对(86.27%)能有效扩增,在刚竹属材料中平均通用性为92.41%,其中39对具有多态性,多态性EST-SSR标记能区分同属的不同种,但不能有效区分种内种质资源。     

小麦SSR和EST-SSR引物对无芒雀麦的通用性分析

无芒雀麦(Bromus inermis Leyss.)具有营养价值高、产量大、利用季节长、耐寒耐旱、适应性强等优良品质。为了解小麦SSR和EST-SSR引物在亲缘植物无芒雀麦中的通用性,本研究选用位于普通小麦7个部分同源群的203对SSR引物和46对EST-SSR引物对无芒雀麦基因组DNA进行了扩增。结果显示:有137对(67.49%)SSR和30对(65.22%)EST-SSR引物对无芒雀麦可以有效扩增,平均扩增条带数分别为2.8和2.5,即小麦SSR和EST-SSR引物在无芒雀麦中具有较高的通用性;研究还发现,来自小麦B基因组和第5同源群染色体的引物在无芒雀麦中的有效扩增比率和平均扩增条带数最低。据此推断,小麦B基因组和第5同源群染色体可能与无芒雀麦基因组的亲缘关系较远。该研究对开发无芒雀麦基因组的特异分子标记、进行遗传多样性分析和功能基因定位等具有一定的参考价值。     

橡胶树EST-SSR标记的开发与应用

通过对橡胶树10 778条EST序列进行拼接, 共得到Unigene 3 090条, 从中发掘出分布于353条Unigene的430个EST-SSR位点, SSR发生频率为11.42%, 平均分布距离为3.93 kb。在橡胶树EST-SSR中, 二核苷酸和三核苷酸重复是主要的重复类型, 分别占63.49%、32.09%。TC/AG、CT/GA和CTT/GAA、AAG/TTC、AGA/TCT是二、三核苷酸的优势重复类型。利用PRIMER5.0设计引物148对, 随机挑选21对引物进行合成, 并用其中15对扩增较好的引物, 通过变性聚丙烯酰胺凝胶结合银染的方法对44个橡胶树无性系进行了遗传多样性检测, 构建了聚类分析树状图。研究结果表明, 从橡胶树EST中开发SSR标记是有效、可行的, 文章所开发的EST-SSR引物可用于橡胶树遗传分析研究。     

Development of microsatellite and amplicon length polymorphism markers for Camellia japonica L. from tea plant (Camellia sinensis) expressed sequence tags

Simple sequence repeats and amplicon length polymorphism markers for Camellia japonica were developed, based on Camellia sinensis sequences in the National Center for Biotechnology Information database. In total, 2495 gene sequences were used to design 216 primer pairs. To identify amplicon length polymorphism markers, 61 gene loci in 16 Camellia individuals were re-sequenced. In total, 10 markers (three expressed sequence tags-simple sequence repeats and seven amplicon length polymorphisms) yielded polymerase chain reaction products with clear polymorphic patterns and were used for genotyping 22 C. japonica individuals from a population. Numbers of alleles and expected heterozygosity ranged from two to 13 and from 0.28 to 0.90, respectively.     

茶树EST-SSRs分布特征及引物开发

为了在茶树中开发EST-SSRs功能性标记,利用生物信息学方法对NCBI网上公开的3288奈茶树（Camellia subebsus）ESTs序列进行EST-SSRs特征分析。剔除冗余序列,得到非冗余序列2083条。在非冗余序列中发现含不同重复基元SSRs的EST序列有385条,共486个EST-SSRs,平均相隔2．10kb出现1个SSR。在2～6bp的重复基元中,二核苷酸重复基元的SSRs出现频率最高（51．97％）,其次是三核苷酸（19．55％）。对所有的重复基元类型进行统计分析发现,所占比例最高的是AG／CT（47．74％）,其次分别是AT／TA（4．73％）和AAG／CTT（4．73％）。利用Prime5软件,设计了206对EST-SSRs引物,随机选用72对引物进行SSR扩增,发现31对引物可以扩增出条带,其中29对引物具有多态性,多态性比率为93．5％。这些EST-SSRs将有助于茶树基因组学方面的研究。