豆壳过氧化物酶的电子吸收光谱性质

应用电子吸收光谱技术研究了豆壳过氧化物酶 ( EC1 .1 1 .1 .7)的不同氧化态电子吸收光谱 ,并与其它来源的过氧化物酶作了比较研究 .天然态酶的特征吸收峰位为 40 4 nm的 Soret带 ,638nm的α带和 50 8nm的β带 ,与过氧化氢反应可生成三类复合物 .复合物 ( Com )在 40 8、580、61 8和 655nm处出现特征吸收 ;复合物 ( Com )在 41 9、52 9和 556nm处显示特征吸收 ;复合物 ( Com )则于 41 8、543和 578nm处显示特征吸收 .天然态酶经连二亚硫酸钠还原则出现 435和 558nm的特征峰 ,与氰化钾作用在 42 2和 544nm处显示特征吸收 .氰化钾对该酶的抑制为竞争性抑制 ,其 Ki 值为 2 .4μmol/L.     

龙须菜中溴过氧化物酶的分离纯化及酶学性质分析

对中国北方海域江蓠属养殖龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)进行了溴过氧化物酶分离纯化及性质的研究。粗提液中酶催化检测反应不稳定, 活力单位较低或无; 经DEAE cellulose 52离子交换层析, 去除了结构多糖及藻胆蛋白, 酶催化反应稳定, 得到比活力为2.8的电泳纯溴过氧化物酶。对纯化溴过氧化物酶性质研究表明: 该溴过氧化物酶为单体酶, 分子量约66 kD, 溴化单氯双甲酮时的最适pH值为6.0, 在40°C以下和pH 3.0~9.0之间有很好的稳定性。钒酸盐可提高该溴过氧化物酶的催化活性, 而Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+和EDTA等化合物对其有较显著的抑制作用。反应动力学实验表明, 该酶对Br-、H2O2的Km分别为53.5 mmol/L和38 mmol/L。     

龙须菜中溴过氧化物酶的分离纯化及酶学性质分析

对中国北方海域江蓠属养殖龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)进行了溴过氧化物酶分离纯化及性质的研究。粗提液中酶催化检测反应不稳定, 活力单位较低或无; 经DEAE cellulose 52离子交换层析, 去除了结构多糖及藻胆蛋白, 酶催化反应稳定, 得到比活力为2.8的电泳纯溴过氧化物酶。对纯化溴过氧化物酶性质研究表明: 该溴过氧化物酶为单体酶, 分子量约66 kD, 溴化单氯双甲酮时的最适pH值为6.0, 在40°C以下和pH 3.0~9.0之间有很好的稳定性。钒酸盐可提高该溴过氧化物酶的催化活性, 而Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+和EDTA等化合物对其有较显著的抑制作用。反应动力学实验表明, 该酶对Br-、H2O2的Km分别为53.5 mmol/L和38 mmol/L。     

变色栓菌锰过氧化物酶同工酶的纯化及其性质研究

变色栓菌(Trametes versicolor)胞外产酶培养液经硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose DE52离子交换柱层析后,获得两个活性组分D1和D2,其中活性组分D2经Phenyl SepharoseTM6Fast Flow疏水层析后,所得样品MnP1经SDS-PAGE检测已达到电泳纯。活性组分D1经Phenyl SepharoseTM6Fast Flow疏水层析、Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析后,所得样品MnP2经SDS-PAGE检测已达到电泳纯。两种同工酶MnP1及MnP2,各自的比活力为579.09、425.00U/mg;纯化倍数为17.51、12.85;活力回收率为6.17%、2.47%。由SDS-PAGE法测得MnP1及MnP2的表观分子量分别为46.3kD、43.0kD。两种同工酶催化DMP(2,6-二甲氧基酚)氧化反应的最适pH值及最适反应温度有所不同,最适pH值分别为pH5.8、pH6.2,最适反应温度分别为60℃、65℃。在45℃以下,pH4.0~7.0之间,MnP1及MnP2的稳定性好。DMP为最佳酶促反应底物,以DMP为底物的Km分别为13.43μmol/L、12.45μmol/L。在无Mn2 存在的条件下,酶促反应几乎不发生。EDTA在较高浓度时抑制酶的活性,DTT在所试浓度下都完全抑制酶的活性。     

人肝谷胱甘肽过氧化物酶纯化及性质研究

经硫酸铵分级沉淀,离子交换层析和凝胶过滤等步骤,从人肝中获得了ＰＡＧＥ单一条带的谷胱甘肽过氧化物酶,比活提高１２０倍,得率为２５％。凝胶过滤法测得分子量为９０９８０,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定亚基分子量为２２４２３．原子吸收法测得每分子酶含有四个硒原子。等电聚焦显示该酶等电点为５．０．酶活力的最适ｐＨ为８．５,最适温度为３７℃。动力学实验提示该酶作用机理属于乒乓机制型。     

豆壳过氧化物酶的盐酸胍变性与化学修饰研究

研究了盐酸胍对豆壳过氧化物酶(soybeanhullperoxidase,SHP,EC1.11.1.7)构象与活力的影响,发现去辅基SHP的盐酸胍变(复)性及荧光变化关系与SHP全酶分子的盐酸胍变(复)性及荧光变化关系明显不同。应用过碘酸氧化法去除SHP分子表面糖链,研究糖链去除对酶性质的影响,则证实了SHP分子表面的糖链去除导致酶热稳定性下降。应用不同的蛋白质侧链修饰剂对SHP进行化学修饰则表明,巯基、酪氨酸和色氨酸残基为酶活力非必需,而羧基、组氨酸和精氨酸残基为酶活力所必需。     

豆壳过氧化物酶的应用

过氧化物酶是一类重要的氧化还原酶,广泛存在于各种植物、动物和微生物体内。具有多种不同的生物学功能,可以催化过氧化氢氧化一系列的有机底物,在环境保护中用于氧化废水中的有机物,同时,过氧化物酶还可以用于医学检测中,特别是酶联免疫测定和电镜技术中。另外在生物传感器、木素降解、工业“三废”处理等方面都有应用。     

羊蹄叶过氧化物酶的纯化和酶学性质研究北大核心CSCD

采用磷酸缓冲液浸提法提取羊蹄叶POD,对影响酶提取的主要因素(料液比、浸提液p H、浸提温度和浸提时间)进行单因素实验和正交实验,用p H沉淀和丙酮沉淀对酶进行了纯化,并研究了其酶学性质。结果表明,羊蹄叶POD的最佳提取条件是料液比为1∶40,提取液p H为9,浸提温度是35℃,浸提时间为30 min。调节提取液的p H为5以及用1倍和0.8倍体积的丙酮沉淀提取液时蛋白相对沉淀量多和酶的比活性大。羊蹄叶POD以愈创木酚和H2O2为底物的Km分别是0.12 mmol/L和0.62×10-3mmol/L。Cu SO4对羊蹄叶POD活性有激活作用,而Zn SO4、Mg SO4、Ca Cl2、KCl和Na Cl对POD活性有抑制作用。研究证明羊蹄叶POD的提取和纯化方法简单有效,其酶学性质为理解羊蹄植物的生长特性和酶学应用提供依据。     

荔枝果皮过氧化物酶的纯化及部分酶学性质研究

经硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose和Sephadex G-75柱层析分离,从荔枝果皮中分离提纯了过氧化物酶(POD),该酶被纯化了12．5倍,产率为1．9％。经SDS-PAGE确定为单一条带。该酶最适反应温度为35℃,对热具有较强的稳定性,经75℃处理30min,酶活性只损失50％。最适pH约为6．5,但在pH4．0—8．0范围内活力仍比较稳定。该酶在25℃和0．05mol／L磷酸缓冲液(pH7．0)条件下对愈创木酚、邻苯二酚和没食子酸的Km分别是2．75、12．4和12．8mmol／L。二硫苏糖醇和抗坏血酸能完全抑制POD活性,L-半胱氨酸、柠檬酸、FeS04、GSH、SDS和ZnS04对POD活性有一定的抑制作用,而FeCl,和CuSOt对POD则有较好的激活作用。     

担子菌漆酶的分离纯化及其性质研究

采用硫酸铵盐析、DEAE纤维素柱层析、Phenyl SepharoseTM6 Fast Flow疏水柱层析等方法,得到电泳纯的漆酶同工酶Lac1,纯化倍数为318.4,活力回收率为18.6％。用SDSPAGE测得该酶分子量为60.3kD,而经质谱分析为55.94kD。最适反应温度为65℃,最适反应pH值为2.2～2.8,酶的等电点pI（室温）为4.02,其N末端序列为AIGPVTDL,用硫酸酚法测得其含糖量为49.2％。25℃条件下,以ABTS(2,2'azinobis(3ethylbenzthiazoline6sulphonate)为底物的Km为17.5μmol/L。该酶在45℃,pH3.0～9.5较稳定。Cu^2＋对酶活有明显的促进作用,Fe^2＋完全抑制酶的活性,Mn^2＋和Ag^＋对酶活无明显影响。DTT（Dithiothreitol,二硫苏糖醇）和NaN3完全抑制酶的活性。Koshland试剂对漆酶的活力影响比较大,色氨酸可能是酶活力的必需基团。     

关于巯基和Mn~(2+)介导豆壳过氧化物酶氧化藜芦醇的研究

藜芦醇作为非酚型木素模型物具有较高的氧化还原电位,豆壳过氧化物酶(soybeanhullperoxidase,SHP,EC.1.11.1.7)通过依赖于过氧化氢的正常过氧化物酶催化循环不能氧化藜芦醇,但在还原型谷胱甘肽、Mn2+和有机酸络合剂存在下却可以通过不依赖于过氧化氢的氧化酶反应途径完成对藜芦醇的氧化,产物为藜芦醛,反应最适pH为4.2。动力学研究表明该反应遵循顺规序列反应机制;对藜芦醇的表观KM值为4.3mmol/L,对谷胱甘肽的表观KM值为4.8mmol/L。巯基还原剂二硫苏糖醇、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇亦可替代还原型谷胱甘肽促进藜芦醇氧化     

粗毛栓菌胞外锰过氧化物酶的纯化及性质

培养于麦草粉上的白腐担子菌粗毛栓菌分泌胞外木质纤维素降解酶(纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶)。经过超滤、盐析、离子交换层析、凝胶过滤和活性聚丙烯酰胺凝胶电泳等步骤,获得了初步纯化的锰过氧化物酶组分。利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电点聚焦技术所测定的锰过氧化物酶的相对分子质量和等电点分别为35.7 ku和pI 2.8。研究结果表明,所纯化的锰过氧化物酶在407nm处具有最大光吸收峰,该酶最适作用pH值和温度分别为pH 5.3和35℃。     

A simple preparation method of crystals of soybean hull peroxidase

Soybean hull peroxidase (SHP) was crystallised from an enzyme solution with low purity by a simple method. The enzyme solution was purified by cooperation salting out of acetone and ammonium sulphate, and lumpy crystals were obtained with the size of about 40 × 30 μm when ammonium sulphate was quickly added to the enzyme solution. The crystal was examined and confirmed to be an SHP crystal by the method of activity test. The result shows that, though the purity of the enzyme solution was not high, crystals could be formed when the enzyme solution rapidly reached to a degree of supersaturation, which was different from the traditional methods of protein crystallisation. Additionally, a purification method of acetone and ammonium sulphate fractional salting out was also studied, in which the procedure was simplified, and a satisfactory purification effect was obtained.     

热带假丝酵母酰基辅酶A氧化酶的纯化及性质研究

利用热带假丝酵母由烷烃生产二元酸时,二元酸面临被β氧化降解的代谢途径。酰基辅酶A氧化酶是二元酸β氧化的限速酶。以热带假丝酵母1230菌株为材料,经硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析、BlueSepharose亲和柱层析,得到电泳均一的酰基辅酶A氧化酶。该酶有两种亚基,分子量分别为74kD和78kD。酶作用最适pH和最适温度分别为80和50℃。金属离子Ag+、Pb2+完全抑制酶活性,Ba2+、Mg2+、Ca2+对酶活性有明显抑制作用。丙烯酸是酶的反竞争性抑制剂,Ki为0633mmol/L,维生素C是竞争性抑制剂,Ki为2.01×10-3mmol/L。     

硫酸乙酰肝素3-O硫酸基转移酶5的表达、纯化及酶学性质研究

经过PCR克隆得到硫酸乙酰肝素3-O硫酸基转移酶5(3-OST-5)的基因,将其与大肠杆菌表达载体pET-15b连接后,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,使用镍亲和层析柱纯化得到具有活性的3-OST-5。经测定纯化后的3-OST-5比活达到0.58 U/mg,是纯化前的5.27倍,回收率达80.4%。在此基础上,研究了该酶的酶学性质,酶反应的最适温度为35℃,稳定范围为20-40℃;最适pH为7.0,在pH7.0-9.0范围内稳定。在反应液中加入终浓度为1 mmol/L的K+、Ca2+、Ba2+对酶促反应有一定的促进作用。     

Purification and Characterization of Glutamate Decarboxylase from Lactobadllus bvevis IFO 12005

Glutamate decarboxylase (GAD) [EC 4.1.1.15] was purified from a cell-free extract of Lactobadllus brevis TFO 12005 by chromatographies on Sephadex G-100, DEAE-Sepharose CL-6B, and Mono Q. About 9 mg of purified GAD was obtained from 90.2 g of wet cells. The purified preparation showed a single protein band on SDS-PAGE. The molecular weights of purified GAD by SDS-PAGE and gel filtration on Superdex 200 were 60,000 and 120,000, respectively, indicating that GAD from L. brevis exists as a dimer. The N-terminal amino acid sequence of the purified GAD was NH₂-Met-Asn-Lys-Asn-Asp-Gln-Glu-Gln-Thr-. The optimum pH and temperature of GAD were at pH 4.2 and at 30°C. The GAD activity was increased by the addition of sulfate ions in a dose-dependent manner. The order of effect was as follows: ammonium sulfate?>?sodium sulfate?>?magnesium sulfate, indicating that the increase of hydrophobic interaction between subunits causes the increase of GAD activity. The purified GAD reacted only with l-glutamic acid as a substrate and the K_m, k_cat, and k_cat/K_m values were 9.3 mm, 6.5 s^?1, and 7 × 10² m^?1 s^?1, respectively.     

Enzymatic Biobleaching of Two Recalcitrant Paper Dyes with Horseradish and Soybean Peroxidase

A stilbene dye (Direct Yellow 11) and a methine dye, Basazol 46L, recalcitrant to common chemical bleaches, were treated with horseradish and soybean peroxidases. Both enzymes were effective at chromophore removal. When compared to laccase in combination with a mediator (ABTS), soybean peroxidase was more effective at oxidative dye removal, especially for the methine dye.