用人造微小染色体技术研究着丝粒和端粒的DNA结构与功能

为了在细胞世代中保持其稳定性,染色体起码应 具备3个结构要素,那就是有一个DNA复制起点;一 个着丝粒(centromere）使细胞分裂时两个姊妹染色单 体能平均分配到子细胞里;最后,在染色体的两个末端 必须有端粒(teloxnere),使DNA能完成复制。近年 来人们采用分子克隆技术把真核细咆染色体的复制起 点、着丝粒和端粒的DNA片段分别克隆成功。并且 把它们互相搭配或改造而构成所谓“人造微小染色体” (artificial minichromosornes),以研究这3种成分的结 构与功能。     

用凝胶电泳纯化具有生物学活性的质粒DNA

采用一般柱电泳装置,在琼脂糖凝胶上将质粒ColEl、pBR322、pSC101、pCRI的DNA与染色体DNA及小分子核酸杂质分开,切出含有质粒的凝胶薄片,电洗脱回收质粒DNA,产物可被限制酶Eco RI酶解;将pBR 322、PSC 101、pCRI DNA转化大肠杆菌C_(600),每微克DNA可产生10~4个转化子;从pSC 101、pCRI转化子细胞中再抽提出相应质粒,它们同样具有亲本质粒的遗传特性和分子特性。     

转座子Tn233(CH)缺失突变株特性的研究

将带有质粒pBR322::Tn233(CH)(抗药类型为Ap~rTc~rSm~rSu~rHg~r)的大肠杆菌C600ML(多聚酶Ⅰ温度敏感突变株)在非允许温度条件下培养时,分离到12株营养缺陷突变型,其中10株的抗药类型为Sm~rSu~rHg~r,经质粒DNA提取与琼脂糖凝胶电泳分析表明,除1株(突变型3号)仍有质粒DNA外,其它9株细胞中的质粒DNA已不复存在。在12株中另外2株的抗药类型为sm~rSu~r(突变型19号与41号),它们也仍旧带有质粒DNA,经质粒抽提与限制性内切酶分析表明,这3种质粒(分别称为pTD3,pTD19与pTD41)DNA分别比pBR322::Tn233(CH)少了一些相邻的限制片段,经计算,pTD3缺失了1.33kb,pTD19缺失了7.22kb,pTD41缺失了9.09kb。从质粒的遗传图上可以看出,这3株缺失质粒都保留了pBR322载体上的DNA复制点与Tn233(CH)上的转座基因(TnpA),但是Tn233(CH)与pBR322相连处的两个末端反向重复顺序中的一个已经缺失,实验表明它们可能都失去了转座功能。对这些自发产生的缺失变种在转座子演化上的意义进行了讨论。     

质粒pBR322在recA基因缺陷的大肠杆菌细胞内的遗传重组

使用琼脂糖凝胶电泳、DNA限制性内切酶水解以及电子显微镜等分析手段,证明在两株recA~-的大肠杆菌质粒pBR322转化子中,pBR 322 DNA的多倍周长环形寡聚物被大量合成。这个事实说明质粒pBR322 DNA在大肠杆菌细胞中的遗传重组似有独立于rec A基因的途径。本文介绍一个改进的大肠杆菌“清亮裂解液”制备法。按照这个方法制备的细菌清亮裂解液可排除染色体DNA的污染。     

一个体外构建的重组质粒——pCBI

构建了质粒pBR322和pCRI 的重组质粒——pCBI。已通过转化技术将其送入大肠杆菌,在含有四环素和卡那霉素的培养基中筛选了转化子。在细菌培养液内加入氯霉素使转化子中的重组质粒扩增。采用琼脂糖凝胶电泳法及水溶性两相抽提法纯化重组质粒。重组质粒pCBI 的电泳速度低于两个亲本质粒。用限制酶EcoRI 降解重组质粒,在凝胶电泳上看到两条带,它们的位置分别对应于pBR322线性DNA和pCRI 线性DNA。电镜观察到环状pCBI DNA 并测得其长度为5.77±0.30微米,折合分子量为(11.9±0.6)×10~6道尔顿。     

端粒与端粒酶

端粒与端粒酶任波（湖北医学院生物教研室武汉４３００７１）染色体在细胞世代中保持其稳定性应起码具备３个结构要素,即ＤＮＡ复制起点,着丝粒以及端粒（ｔｄｏｍｅｒｅ）。端粒是真核生物染色体末端的特殊结构,由蛋白质与ＤＮＡ构成。其中的ＤＮＡ在结构与功能上与其...     

大肠杆菌cosmid质粒的分离和DNA构型

Bolivar等u]于1977年用人工重组技术从ColEl质粒构建出声pBR322质粒,由于pBR322质粒带有两个抗药性标记,有多拷贝以及多种限制性内切酶单一切点等特性,近年来已被广泛用作重组DNA实验的载体。Collins等^[2]用pBR3222质粒与λ charon 4A的带有Cos位点的EcoRI酶切片段重组,进一步得到cosmid质粒,cosmid质拉除了具有pBR322质粒原来的优点外,它能够携带更大的外源DNA片段(40Kb),能够像λ charon 4A一样在体外进行包装,从而提高转化率。     

转座子Tn233(CH)分子量的测定

转座子Tn233(CH)带有str sul抗性基因,最早是在痢疾杆菌的抗药质粒DR233(Tc~r Cm~r Sm~r Su~r)中发现的。现在通过菌株间的配对,将插入了Tn233(CH)转座子的质粒R144drd3::Tn233(CH)转移到E·coli C600/pBR322(Ap~r、Tc~r)细胞中,组成两种质粒共存的菌株。从此菌株中提取出质粒DNA,用转化方法使它转移到E.coli C600菌株,再从所得到的转化子中用复印方法筛选出Tn233(CH)转座到pBR322质粒的转化子E.coli C600/pBR322::Tn233(CH),然后提出此质粒DNA,经限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ与PvuⅡ等酶切后,在琼脂糖凝胶平板与聚丙烯酰胺凝胶柱上进行电泳分析,分别以BamHⅠ与EcoRⅠ双重酶解的λDNA、HindⅢ酶解的T5DNA、HaeⅢ酶解的M13 DNA与HaeⅢ酶解的pBR322 DNA作为泳动的标记,计算出质粒酶解片段的分子量,用此方法算出各片段分子量的总和为15.93×10~6道尔顿,此即为所求的pBR322::Tn233(CH)分子量,将此值减去pBR322的分子置2.87×10~6道尔顿,得到Tn233(CH)的分子量为13.06×10~6道尔顿。电泳结果还表明在Tn233(CH)DNA分子上,BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ与PvuⅡ分别有5、9、1、6、2个切点数。     

用激光微束法将外源基因导人水稻细胞的研究

将外源基因导入植物细胞是植物基因工程的关键步骤之一。用激光微束技术转化动物细胞已经取得了成功,并证明外源基因已整合到细胞染色体上。最近又证明激光微束可穿透植物细胞壁和细胞膜,将pBR322DNA导入植物细胞和细胞器。本实验在利用激光微束技术将外源基因导入水稻培养细胞上进行了探索。 所用外源DNA是pBI121质粒,该质粒带有CaMV35启动子和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因,用     

大肠杆菌噬菌体T4DNA连接酶基因(G30)无性繁殖系的建成和鉴定

通过限制性内切酶EcoRl 或 HindIII部分降解T₄．含胞嘧啶DNA,并把它们连接到运载体pBR 322上,转化大肠杆菌KH 802,获得了5000余株T4。基因无性繁殖系。用标记援救的遗传学试验,从中筛选出2株带有T4．基因30片段的无性繁殖系,其中pAM 3158带有比较完整的基因30。琼脂糖凝胶电泳表明该菌株中的杂合质粒DNA分子量比pBR 322的大,并日经 Hind Iil降解后可见一条新带。     

β-溶血性链球菌的苏氨酸基因在大肠杆菌中的无性繁殖和表达

用限制性内切酶BamHI分别酶解β-溶血性链球菌染色体DNA和pBR322质粒DNA,经T4DNA连接酶连接后转化到受体菌大肠杆菌C600,采用插入钝化法筛选含β-溶血性链球菌DNA片段的Ap~rTc~s无性繁殖系,然后利用受体细胞从营养缺陷型转变为原养型的遗传学功能互补选择方法筛选到含苏氨酸基因的57-5号菌。对57-5号菌进行营养标记和抗药性标记测定,证实它带有苏氨酸基因。通过琼脂糖凝胶电泳分析和电子显微镜观察进一步证实57-5号菌所含的杂种质粒pFD201 DNA是由β-溶血性链球菌DNA和pBR322 DNA重组而成。     

大肠杆菌的一个转座子Tn2981的特性

在复旦大学校园分离到1株带有抗药性质粒pFD13(Sm~RSu~RCm~RTc~RHg~R)的大肠杆菌B7,并在pFD13上发现1个转座子,它带有链霉素(Sm~R)、汞盐(Hg~R)、磺胺嘧啶(Su~R)抗性基因,定名为Tn2981。Tn2981可以从质粒pFD13转座到质粒R144drd3上,也能从质粒转座到大肠杆菌的染色体上。这种转座作用不依赖于宿主细胞reeA的基因产物。经电子显微镜测量质粒pBR322::Tn2981及质粒pBR322的长度,换算后得到Tn2981分子量是12.48×10~6道尔顿,并经限制性内切酶酶切说明它含有6个EeoRI切点。     

Ti质粒T区基因4的分离及其在高等植物中的表达

根癌农杆菌Ti质粒的T区DNA上带有致瘤基因,其基因4编码细胞分裂素合成酶。以pGV 354(pBR 322质粒中插有Ti质粒C 58 T区DNA的HindⅢ15-HindⅢ22大片段)重组质粒出发,我们分离了基因4,并通过基因载体pGV 3850引入了高等植物。结果证明基因4能促使烟草、向日葵,石刁柏等转化组织分化长芽。DNA分子杂交表明,转化的烟草中有正常植物所没有的基因4同源片段存在。     

小鼠的克隆着丝粒(SFA)DNA的鉴定

着丝粒是真核染色体上的重要细胞器,是真核染色体作为基因载体行使其遗传功能的关键结构.着丝粒DNA首先是从酵母中分离克隆并被用以构建酵母人工染色体.鉴于真核有丝分裂机制研究和构建高等动物人工染色体研究的需要,从分离和检定过的小鼠着丝粒DNA库中筛选出了6#着丝粒DNA(SFADNA),并用荧光原位杂交法(FISH)对其进行了在染色体上的定位检定.用缺口平移法和PCR法分别标记了SFA DNA和SFA DNA中的小鼠寡份卫星DNA作为探针,分别与小鼠腹水癌细胞和小鼠L929细胞进行原位杂交;并用荧光抗体显示杂交信号的位置.结果,SFA DNA在两种细胞的中期染色体上的杂交信号都位于亚末端的初级缢痕处,表现为单一粗大的斑块.寡份卫星DNA在两种细胞的中期染色体上的杂交信号亦都位于亚末端的初级缢痕处,但极大多数的斑点均表现为成对的细小斑点.初级缢痕正是染色体着丝粒所在的特征性部位.故以上结果说明定位于该部位的克隆的6#SFA DNA,和其中的小鼠寡份卫星DNA都来源于小鼠着丝粒DNA.     

端粒酶与肿瘤

端粒(telomere)是存在于真核生物线性染色体末端,由串联重复的DNA序列及其相关蛋白所组成的结构。由于能防止染色体的端-端融合、重组和降解,故具有稳定染色体的作用。众所周知,参与真核生物线性DNA复制的DNA聚合酶并不能使染色体DNA完全复制,因而染色体末端的端粒序列在不断分裂的过程中逐渐缩短。当人染色体的末端,又称末端限制片断TPF(terminal restriction fragments),缩短到5—7Kbp时,细胞就会发生衰老,因此,     

青霉素酰化酶操纵子为负调控模型

质粒pBR322用HindⅢ—BarnH Ⅰ双酶切作为载体,从质粒pPAd上克隆含有pac操纵基因的HindⅢ一。BglⅡl．65kb的DNA片段,得到质粒pPA41。质粒pBR322和pPA41转化染色体上含有完整pac操纵子的大肠杆菌D816,进行操纵基因滴定。大肠杆菌D816、D816(pPA4l)．D816(pBR322)在22℃摇瓶发酵96h,NIPAB法测定青霉素酰化酶活性。结果发现,在不加诱导剂时,D816(pPA41)产生的青霉素酰化酶是D816细胞的2．5倍,在加诱导剂时,D816(pPA41)产生的青霉素酰化酶是D816细胞的1．3倍。对照组D816(pBR322)细胞产生的青霉素酰化酶和：D816细胞产生的几乎一致,说明质粒pPA41的竞争滴定作用确是其上克隆的操纵基因引起的。高拷贝的操纵基因(pPA41)和pac操纵子竞争结合调节蛋白,使得pac操纵子表达增加,说明调节蛋白在pac操纵子表达过程中起阻遏作用,调节蛋白为阻遏蛋白,pac操纵子为负调控模型。R．NA—DNA点杂交检测pac基因表达,发现D816(pPA41)细胞转录产生的pac—mRNA量明显高于D816细胞,mRNA量和青霉素酰化酶活性呈现一致的趋势,证实了pac操纵子的负调控发生在转录水平。     

游动双孢菌线型质粒pPR2的全序列测定及分析

[目的]获得游动双孢菌线型质粒pPR2的全序列,并揭示新型的端粒复制蛋白和可能的中间复制位点.[方法]用分段克隆的方法和序列拼接获得pPR2的全序列,利用软件分析端粒DNA的二级结构和可能的端粒复制蛋白,利用链霉菌原生质体转化的方法检测可能的中间复制的位点.[结果]pPR2全长为15520 bp,(G C)含量为68.1%.其端粒末端反向重复序列的长度为329 bp,不能像多数链霉菌的线型质粒那样能形成保守的"折返"的二级结构.pPR2虽然没有参与链霉菌端粒复制的保守的tap/tpg基因,但是pPR2.3c基因编码了一个双结构域蛋白,分别同链霉菌的端粒复制相关蛋白Tap和嗜血杆菌的解旋酶具有相似性.pPR2缺少典型的链霉菌重复序列-复制基因(iteron-rep)区段,将几乎覆盖全长pPR2的两段DNA进行克隆后,不能转化变铅青链霉菌.此外,pPR2基因还编码可能参与线型DNA复制的调控的单链结合蛋白(SSB)和与放线菌质粒接合转移相关的主要蛋白(Tva).[结论]pPR2是链霉菌之外的放线菌中最小的线型质粒,其序列在游动双孢菌属的线型质粒中是首次报道.pPR2可能具有新型的端粒复制的机制,其中pPR2.2c和pPR2.3c编码可能的端粒复制蛋白.     

杂种质粒pTW161和pTW162的构建及其性质

由pBR322和pTW16两种质粒DNA构建成了两种杂种质粒pTW161和pTW162。质粒pTW16来源于一种抗钴的克氏产气菌,带有抗钴的基因。pTW161和pTW162两种杂种质粒的区别仅在于pBR322和pTW16 DNA重组连接的方向不同,两种质粒均为Ap~rCo~r,但pTW162抗钴能力比pTW161弱。     

四种不同细菌质粒转化庆丰链霉菌的研究

利用四种不同质粒(pRR322、pUB110、pKT071和pA01)在10—15％聚乙二醇6000存在时,可以成功地转化到庆丰链霉菌受体;其中转化的pBR322质粒经过20次传代后,仍有如％左右可稳定地存留,而其它三种质粒经2--3次传代后立即消失。用无细胞胞外粗抽提物证实pBR322质粒基因在庆丰链霉菌细胞中得到表达。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳证示转化子胞外抽提物中显著呈现一条分子量为30,000左右的蛋白质带,与已知的pBR322编码的β-内酰胺酶分子量相一致。     

E. Coli PBR322质粒DNA在福氏志贺氏菌中的转化表达

质粒转化到异种细菌细胞是否能够存在、 受体菌细胞能否接收异体DNA物质而进行遗 传性状的表达，是基因工程的重要环节之一。我 们将E. coli pBR322质粒用转化方法，引进福 氏志贺氏2a, 3a菌中，获得成功。