siRNA干扰HSV-1 UL30 DNA聚合酶基因的研究

目的：筛选高效沉默HSV-1UL30基因的siRNA,研究siRNA沉默UL30基因后对HSV-1繁殖的影响。方法：设计并化学合成12对靶向UL30基因的siRNA,与pEGFP-N1-Fi融合表达质粒共转染VERO细胞,流式细胞术筛选高效抑制Fi-EGFP融合蛋白的siRNA,实时荧光定量PCR检测siRNA对感染细胞内UL30mRNA表达的抑制效果,CPE法和空斑减数实验评价siRNA对HSV-1繁殖的抑制效果。结果：共转染实验筛选出高效抑制Fi-EGFP融合蛋白的siRNA4、siRNA10及siRNA8,这3对siRNA均能显著降低感染细胞内UL30mRNA的表达水平及病变细胞释放到培养上清的子代病毒滴度,siRNA4和siRNA10在感染后36h对HSV-1的繁殖有明显的抑制效果,其病斑分别比对照组减少61.17%、51.46%（P〈0.05）,siRNA4、siRNA10及siRNA8组最终形成的空斑直径分别比对照组减小29.94%、23.49%、21.69%（P〈0.01）。结论：筛选到高效抑制UL30的3对siRNAs,siRNA4及siRNA10在病斑形成早期对HSV-1的繁殖有明显的抑制效果,说明siRNA4、siRNA10及siRNA8均能延缓病斑的扩大和病斑数目的增长,对病毒的繁殖有一定的抑制效果。     

UL27、UL29基因shRNA表达载体的构建及对HSV-2的干扰效应研究

探讨Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 2,HSV-2)UL27、UL29基因联合靶向siRNA对HSV-2复制的影响。构建UL27、UL29基因的siRNA的重组表达载体并转染293细胞,通过实时荧光定量PCR技术和蛋白质印迹方法检测UL27、UL29基因的表达,终点滴定法检测细胞上清液中的各组病毒滴度,MTT法检测细胞的存活率。结果显示:(1)成功构建短发夹RNA(shRNA)重组表达载体。(2)转染后48 h,与空白组(空载体)相比,UL27 shRNA75组对UL27基因mRNA的抑制率为75.17%(P0.05),UL29 shRNA1461组对UL29基因mRNA抑制率为66.08%,具有显著性差异(P0.05)。UL27 shRNA75联合UL29 shRNA1461联合干扰组对UL27基因抑制率约为91.28%,UL29基因表达抑制率约为80.40%,与空白组比较具有显著性差异(P0.05)。(3)终点滴定法结果显示单干扰组和联合干扰组可不同程度降低上清液中的病毒感染滴度,与空白组比较差异性显著(P0.01)。(4)Western blot检测目的基因蛋白,单干扰组与联合干扰组可不同程度降低目的基因蛋白的表达,其中UL27shRNA75+UL29 shRNA1461联合干扰组能显著抑制相应的蛋白表达水平,蛋白表达量明显减少,与单干扰组相比具有显著差异(P0.05)。(5)经MTT法检测,UL27 shRNA75、UL29 shRNA1461、UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461联合干扰组的细胞存活率明显提高,差异有显著意义(P0.05)。构建的pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL29重组表达载体,能在体外细胞水平上不同程度的干扰HSV-2 UL27、UL29基因表达,UL27、UL29联合干扰效率更高,抑制HSV-2在HEK293细胞中复制。     

HSV-1感染细胞中HTRP基因的克隆及表达纯化

在对单纯疱疹病毒1型（HSV－1）感染KMB－17细胞后的早期基因反应的研究中,从HSV－1感染后细胞特异性cDNA文库中筛选出一个1381bp基因一HTRP,基因测序分析表明为与HSV－1感染相关基因（GenBank登录号：AF450482）,含有完整的ORF框架,cds全长924bp,编码308个氨基酸。构建了pGEX-HTRP表达质粒,在大肠杆菌B21加获得了较高的表达,采用Glutathione Sepharose4B进行亲和纯化后获得较高纯度的HTRP蛋白。用该蛋白免疫小鼠后制备的特异抗血清,在蛋白印迹实验中表现出抗体的特异性。     

HSV-1UL-12基因的克隆、表达及产物复性

目的:克隆及表达单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)UL12基因,对其表达产物HSV-1碱性核酸酶(AN)进行复性,为建立抗HSV-1药物的分子筛选模型奠定了基础,对于寻找抗病毒药物具有重要意义.方法:从HSV-1感染的Vero细胞中提取HSV-1基因组DNA,通过PCR克隆出UL12基因并对其测序;然后将HSV-1 UL12基因先克隆至pMD19-T载体,再亚克隆到pET32a表达载体上,并将重组载体转化到E.coli Rosetta菌中进行表达;最后用梯度盐酸胍对表达出的包涵体进行复性.结果:成功构建了pET32a-UL12重组载体,经序列比对,与GenBank上公布的HSV-1国际标准毒株17株的UL12基因序列的同源性达到了99.2%.在E.coli Rosetta菌中以包涵体的形式表达,经复性得到有活性的HSV-1碱性核酸酶(AN).AN同时具有核酸外切酶和核酸内切酶的活性,与核酸作用60min时酶活性最高.结论:重组载体pET32a-UL12经表达、复性可获得有活性的HSV-1 AN.     

小鼠IL-6基因的克隆及表达载体的构建

采用常规的分子生物学技术,从小鼠骨髓细胞中克隆了含信号肽序列的IL-6,并构建了表达载体,序列分析表明所克隆的IL-6序列与文献报道的一致,构建的表达载体经鉴定正确。     

SARS-CoV S蛋白基因的克隆及其与VSV-G融合表达载体的构建

为了解重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS—CoV)表面S蛋白的受体结合功能域及其在宿主细胞上的作用受体,应用PCR技术从SARS—CoV cDNA中克隆到S蛋白的全长基因,并构建了S蛋白与疱疹性口腔炎病毒胞膜蛋白(VSV—G)融合表达载体pVSV—G‘-SG,进而为制备含有SARS—CoVS蛋白膜外区的逆转录病毒假毒粒奠定了实验基础。     

木糖异构酶基因xylA的克隆及其表达载体的构建

木糖异构酶基因xylA是一种正向选择标记基因,在植物基因工程中使用该标记可以获得安全的转基因植物.构建了以xylA基因为选择标记的植物表达载体.从大肠杆菌Top10中扩增出xylA基因,插入到质粒pCAMBIA2301的Xho Ⅰ位点,通过酶切和PCR检测插入片段的正确性,得到载体pCAMBIA2301-xylA,将pBI121载体上的‘35S-GUS-Nos'表达框插入到pCAMBIA2301-xylA的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ位点.得到中间载体pCAMBIA2301-xylA-GUS,用Sac Ⅰ和Sma Ⅰ切下克隆载体上的CBF1基因替代pCAMBIA2301-xylA-GUS中的GUS片段,用电转化法将获得的表达载体转化到农杆菌中,为将来获得安全的转基因抗寒植株奠定基础.     

MBP-gldABC融合蛋白基因的原核表达载体的构建

目的：构建可高效生产甘油脱水酶的大肠杆菌工程菌,方法：将编码甘油脱水酶的三个基因gldA、gldB、gldC,分别克隆至克隆载体pMD18-T和pSIM-T中,经测序正确后,再亚克隆至表达融合蛋白的高效表达载体pMAL-c2X上,构建成表达质粒pMAL-gldABC,并转化大肠杆菌E.coli DH5α。结果：成功地将甘油脱水酶基因gldABC以同向串联方式克隆到大肠杆菌融合表达载体pMAL-c2X中,结论：得到了含gldABC基因的MBP融合蛋白表达载体,为研究甘油脱水酶基因（gldABC）的在原核表达载体中的串联表达奠定了基础。     

HIV—1辅受体配体的融合表达载体的构建及表达

应用PCR扩增RANTES－KDEL基因,鉴定后与真核表达载体pCMV-S/K连接,构建成HIV－1辅受体的配体,趋化因子RANTES和SDF－1的融合表达载体pCMV-R-K-S-K,酶切鉴定和测序证明成功构建了pCMV-R-K-S-K融合表达载体。脂质体介导pCMV-R-K-S-K转染HeLa细胞,间接免疫荧光证实了RANTES和SDF－1可高效表达于HeLa细胞。细胞表明构建的pCMV-R-K-S-K融合表达载体能在HeLa细胞中高效表达,可用于下一步的HIV－1感染实验。     

rhGM—CSF／LIF融合蛋白基因的克隆及表达

利用基因重组技术,人工构建了一个编码五肽Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｓ的基因接头,将ＧＭ－ＣＳＦ和ＬＩＦ的ｃＤＮＡ相连而构成融合基因,将融合基因载入原核表达载体ｐＢＶ２２０后转化大肠杆菌,经热诱导后进行Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹反应鉴定证实获得ｒｈＧＭ－ＣＳＦ／ＬＩＦ融合蛋白（简称ｒｈｇＭ－ＬＩＦ）活性测定表明重组的融合蛋白具有两因子双重活性。     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的克隆人类泛素水解酶22（ubiquitin—specific processing enzyme22,USP22）基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体。方法利用RT—PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP—N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布。结果测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEG—FP—USP22构建无误,质粒转染后有80％左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布。结论成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。     

MSTN基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建能沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,并鉴定它沉默肌母细胞MSTN基因的效率。方法合成3对发夹小干扰RNA模板寡核苷酸链,退火后插入pSileneer载体．构建成可沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,通过酶切和测序鉴定构建的小干扰RNA表达载体。将小干扰RNA表达载体转染肌母细胞,用实时荧光定量RT—PCR和Western印迹检测转染的肌母细胞myostatin的表达水平。结果酶切和测序证实3个小干扰RNA表达载体构建正确,实时荧光定量RT—PCR显示所构建的3个小干扰RNA表达载体对肌母细胞MSTN基因的干扰率分别为43．6％、47．7％和81．6％,它们的干扰效果被Western印迹所证实。结论干扰率为81．6％的小干扰RNA表达载体为构建成功的小干扰RNA表达载体,。岜可用作MSTN基因的功能研究和肌病治疗的分子研究。     

单纯疱疹病毒2gD-Hsp70融合蛋白基因的构建及表达

构建并原核表达Hsp70-HSV2gD融合蛋白。将Hsp70和HSV-2gD蛋白基因分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,构建成重组质粒pGEX-4T-Hsp70-gD,并测序鉴定。重组质粒pGEX-4T-Hsp70-gD转化大肠杆菌DH5α后,IPTG诱导表达并进行SDS-PAGE分析。表达产物纯化后做Westernblot检测。将其肌注免疫BALB/c小鼠,检测融合蛋白对免疫小鼠脾淋巴细胞增殖、γ-干扰素产生以及血清中gDIgG水平的影响。表达产物的SDS-PAGE分析发现,在相对分子量为118kD处有外源蛋白表达,与预期蛋白带一致。用GST柱得到了纯化的Hsp70-HSV2gD融合蛋白。Westernblot证实,表达产物具有良好的活性。GST-Hsp70-gD组蛋白疫苗免疫的小鼠,其脾淋巴细胞刺激指数和脾淋巴细胞培养上清中γ-干扰素的水平高于其它组(P<0.05)。血清单纯疱疹病毒-2gD蛋白的抗体水平高于其它组(P<0.05)。     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因,ｐｌ６基因为目的基因,将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游,构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６,并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

流感病毒ns1基因的克隆及其原核表达载体的构建

为了解H5N1亚型流感病毒株的ns1基因特性及其规模制备NS1蛋白,首先将病毒在鸡胚中传代,从收获的尿囊液中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增流感病毒全长ns基因。测序显示H5N1亚型流感病毒NS1cDNA全长678bp,编码225个氨基酸。BLAST分析表明,Qa/ST/852/01(H5N1)病毒株ns1基因与近年来从华南地区分离的禽H5N1毒株的ns1基因有很高的同源性。之后采用PCR方法扩增ns1基因的cDNA片段,将其克隆到pGEX-4T-3载体中,与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)基因融合,构建重组质粒pGEX-4T-3/NS1cDNA,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达。SDS-PAGE和凝胶扫描分析,GST-NS1融合蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,并且以可溶形式存在,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的28.5%,表达产物经亲和层析纯化后蛋白质纯度达96%以上。经免疫印记证实重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别。该表达载体的构建为获得大量NS1蛋白进行功能研究及抗体制备提供了基础。     

番茄LeEIL1基因的克隆分析及表达载体构建

采用RT-PCR方法从番茄果实cDNA中成功克隆了番茄LeEIL1基因,并测序验证序列正确;经数据库检索等生物信息学分析方法,对番茄LeEIL1蛋白质与拟南芥、烟草、水稻、香石竹等的EIN3/EILs蛋白质序列进行了同源性分析,初步确定了番茄LeEIL1上的DNA结合功能域及其结合激活位点.并构建了LeEIL1的酵母表达工程茵pPIC9k-EIL1/KM71,为该基因的功能研究奠定了基础.     

花生白藜芦醇合酶基因cDNA的克隆及植物表达载体的构建

为得到含有白藜芦醇合酶cDNA(RS cDNA)并能表达白藜芦醇(Res)的转基因植物,以花生为材料,从其根部提取基因组DNA,并以其为模板,利用引物悬挂延伸PCR法扩增得到大小约1200bp的片段,将这个片段连接到克隆载体PBS-T上进行测序,测序结果证明,此片段就是花生的RS cDNA。将此片段再正向插入到植物表达载体PBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间,对重组子进行筛选与鉴定,证明花生的RS cDNA已经正确插入PBI121中,成功的构建了植物表达载体PBI121L。     

水稻高叶绿素含量基因DET1 cDNA的克隆、生物信息学分析及超表达载体的构建

提高水稻叶片中叶绿素含量可以提高光合作用效率。以水稻高叶绿素含量突变体为材料,在前期精细定位的基础上,克隆了高叶绿素含量基因DET1（DE-ETIOLATED 1）cDNA。测序结果显示：DET1基因全长cDNA为1536 bp,由11个外显子组成,编码512个氨基酸。与野生型珍汕97B相比,DET1基因在第7个外显子上有T-C的转换,该转换引入了一个EcoR I酶切位点,并导致第328位的亮氨酸（L）改变为丝氨酸（S）,且突变位点处于高度保守区域内。DET1基因的氨基酸序列与玉米等其它高等植物的氨基酸序列同源性高达62%以上。利用生物信息学方法对DET1基因的序列、进化树、理化性质及亲疏水性等进行分析,并构建了水稻超表达载体pCUPHN-DET1,为水稻高叶绿素含量突变基因DET1的功能验证奠定基础。