铜绿假单胞菌fur基因缺失突变株的构建及其表型分析

铁摄取调节蛋白(ferric uptake regulator, Fur)是控制铜绿假单胞菌铁代谢和毒力的关键调节因子。许多课题组尝试构建铜绿假单胞菌fur的缺失突变株均失败,因此铜绿假单胞菌的fur一直被认为是必需基因,这导致其生物学功能一直未得到全面的解析。【目的】构建铜绿假单胞菌fur的缺失突变株,并对该突变株的表型进行分析。【方法】以铜绿假单胞菌PAO1为亲本菌株,通过同源重组的方法构建fur缺失突变株,研究该基因对铜绿假单胞菌生长、铁载体生物合成、抗氧胁迫能力、鞭毛形成、生物被膜形成和毒力等的影响。同时,通过遗传分析对fur缺失突变株生长缺陷表型的原因进行探究。【结果】本研究成功构建了铜绿假单胞菌fur基因的缺失突变株,发现缺失突变fur极大地限制了铜绿假单胞菌的生长能力,并降低了该菌对限铁环境的生长适应性,但不影响该菌对高铁环境的生长适应性。铜绿假单胞菌Δfur的这种生长缺陷表型是细胞生长增殖变慢造成的,而不是诱导细胞死亡引起的。然而,其他异源的fur基因能完全互补Δfur的这种生长缺陷表型,暗示铜绿假单胞菌的Fur蛋白在功能上不存在独特性。尽管Fur与毒素-抗毒素系统PacTA存在功能关联性,但是铜绿假单胞菌Δfur的这种生长缺陷表型却与PacT毒素无关。除了影响铜绿假单胞菌的生长表型,缺失突变fur还使铜绿假单胞菌丧失了对铁载体生物合成的抑制作用,导致该菌对H₂O₂更敏感并丧失了鞭毛的形成能力,同时降低了该菌对大蜡螟幼虫的毒力。此外,缺失突变fur还显著提升了铜绿假单胞菌的胞内环二鸟苷酸(cyclic diguanylate, c-di-GMP)水平,从而诱导pelF和pslA基因的表达,进而促进铜绿假单胞菌生物被膜的形成。【结论】fur是可以缺失的非必需基因,在铜绿假单胞菌的正常生长、铁载体生物合成、抗氧胁迫能力、鞭毛形成、生物被膜形成和毒力等方面都发挥着十分重要的作用,这为针对铜绿假单胞菌的疫苗和抗菌药物开发奠定了基础。     

转录调节因子σ~(38)介导铜绿假单胞菌绿脓菌素合成代谢调控

【目的】为了进一步鉴定铜绿假单胞菌转录调控因子σ~(38)对2个拷贝吩嗪合成基因簇(phz A1-G1和phz A2-G2)的具体调控方式并推定介导绿脓菌素合成代谢的可能调控机制。【方法】根据铜绿假单胞菌基因组信息,利用同源重组原理构建rpo S基因缺失突变株Δrpo S以及克隆全长rpo S基因作互补分析;再以单一吩嗪基因簇缺失突变株Δphz1和Δphz2为出发菌株,分别构建rpo S缺失突变株Δrpo Sphz1和rpo S插入突变株Δrpo Sphz2,测定并比较野生株及相关突变株的绿脓菌素合成量,初步推定σ~(38)因子对2个不同吩嗪基因簇表达的调控方式。【结果】在GA培养基中,突变株Δrpo S的绿脓菌素合成量比野生株显著增加;互补分析证实,σ~(38)可使突变株Δrpo S的绿脓菌素降低并接近野生株PAO1水平;与对照株Δphz1相比,突变株Δrpo Sphz1的绿脓菌素合成量因σ~(38)因子缺失而显著减少;而与对照株Δphz2相比,突变株Δrpo Sphz2的绿脓菌素合成量因σ~(38)因子缺失显著增加。【结论】转录调控因子σ~(38)对铜绿假单胞菌绿脓菌素的合成代谢的确具一定的负调控作用;结合已报道的研究结果,初步推定:σ~(38)因子通过负调控吩嗪基因簇phz1,正调控吩嗪基因簇phz2的表达实现对绿脓菌素合成代谢的调控。     

细菌群体感应参与铜绿假单胞菌胞内聚羟基脂肪酸酯合成的调控

群体感应是细菌根据细胞密度变化调控基因表达的一种调节机制。铜绿假单胞菌中QS系统由lasI和rhlI合成的信号分子3OC12-HSL和C4-HSL以及各自的受体蛋白LasR、RhlR组成,它们以级联方式调控多个基因表达。【目的】研究细菌群体感应(QS)对聚羟基脂肪酸酯合成的调控。【方法】利用铜绿假单胞菌PAO1及其QS突变株为材料通过气相色谱、荧光定量PCR在生理和分子水平上研究QS对聚羟基脂肪酸酯合成的调控。【结果】QS信号分子合成抑制剂阿奇霉素处理铜绿假单胞菌PAO1和QS突变株导致胞内PHA积累量显著减少;铜绿假单胞菌PAO1中C4-HSL合成酶基因rhlI缺失突变株PAO210胞内PHA积累量与野生型无差别;而3OC12-HSL合成酶基因lasI缺失突变株PAO55、3OC12-HSL受体合成酶基因lasR缺失突变株PAO56以及lasI/lasR双缺失突变株PAO57胞内PHA含量与野生型相比明显减少;lasI和lasR的突变株体内PHA合成酶基因phaC1的表达量显著降低,信号分子3OC12-HSL回补实验使phaC1的表达量可恢复到野生株水平,但只可部分恢复lasI缺失导致的胞内PHA合成。【结论】由此推测,铜绿假单胞菌群体感应系统中lasI/lasR系统参与胞内聚羟基脂肪酸酯合成的调控。     

rpoS基因插入突变对铜绿假单胞菌两个吩嗪合成基因簇的调控

【目的】为了研究铜绿假单胞菌rpoS基因对吩嗪(Phenazine)合成基因簇phz1和phz2的调控方式与机制。【方法】采用抗庆大霉素基因(gentamycin resistance cassette,aacC1)插入失活的策略构建了rpoS基因突变株PA-SG;同时利用lacZ的翻译融合表达载体pME6015,构建了phz1′-′lacZ和phz2′-′lacZ翻译融合表达载体pMEZ1和pMEZ2。采用电转化法分别将pMEZ1、pMEZ2和pME6015导入铜绿假单胞菌突变株PA-SG和野生株PAO1,用Miller法检测融合β-半乳糖苷酶活性。【结果】在KMB或PPM培养基中,pMEZ1在突变株PA-SG中的表达均增强,为野生株的4-5倍;而pMEZ2在突变株PA-SG中的表达均降低,野生株是突变株的2-3倍。【结论】由此推测,铜绿假单胞菌rpoS基因对两个不同吩嗪合成基因簇的调控作用具有特异性,在一定程度上,rpoS负调控phz1,正调控phz2。     

mucA基因突变的黏液型铜绿假单胞菌PA17与PD0300生物被膜形态观察和耐药性比较

目的研究新的mucA基因缺失突变的黏液型铜绿假单胞菌PA17和经典mucA基因点突变的黏液型铜绿假单胞菌PD0300在生物被膜状态下对临床常用抗菌药物的耐药性变化,探讨mucA基因突变对铜绿假单胞菌生物被膜形态及细菌耐药性的影响。方法改良的平板法建立生物被膜,将含绿色荧光蛋白的pUCP／UV质粒转化两株铜绿假单胞菌,激光共聚焦显微镜下观察生物被膜形态;采用琼脂二倍稀释法测定常用β-内酰胺类,氨基甙类,喹诺酮类抗菌药物对铜绿假单胞菌菌株PA17、PD0300的最低抑菌浓度（MIC）;利用96孔板建立生物被膜测定抗菌药物对第五天成熟生物被膜内细菌的最低杀菌浓度（MBC）。结果新的mucA基因缺失突变的黏液型PA17成熟生物被膜呈薄膜状、经典mucA基因点突变的黏液型PD0300成熟生物被膜呈蘑菇状;在浮游状态下PA17、PD0300对头孢他啶（CAZ）、妥布霉素（TOB）、庆大霉素（GEN）、亚胺培南（IPM）敏感,而对左氧氟沙星（LVX）、环丙沙星（CIP）不敏感,两者具有一致的耐药性;生物被膜状态下两者对抗菌药物敏感性降低20—8000倍;黏液型PD0300成熟生物被膜对抗菌药物敏感性低于黏液型PA17。结论黏液型铜绿假单胞菌在相同条件下能形成不同形态的生物被膜;生物被膜状态下较浮游状态下对常用抗菌药物敏感性明显下降,同时生物被膜形态也影响抗菌药物敏感性。     

铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA2072的生物学分析

【背景】铜绿假单胞菌为革兰氏阴性杆菌,是医院感染的常见条件致病菌之一。广泛存在于细菌中的第二信使分子环鸟苷二磷酸(cyclic-di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)对细菌生理生化功能具有重要的调节作用。铜绿假单胞菌PAO1中存在参与c-di-GMP代谢的基因PA2072。【目的】探讨铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA2072的生物学功能。【方法】运用PCR及分子克隆技术构建PA2072基因及各结构域的自杀载体,运用基因敲除方法获取PA2072基因的3个突变株;利用泳动性(swimming)、蜂群运动(swarming)、蹭行运动(twitching)和生物膜定量实验对细菌进行初步的表型分析,进一步通过刚果红染色法对菌株进行分析。【结果】成功构建PA2072基因敲除突变菌株及回补菌株;生物膜定量结果发现基因PA2072的敲除会影响细菌生物膜的形成,PA2072蛋白的不同结构域对生物膜的合成也起到了重要作用;细菌运动能力检测中发现PA2072相关基因的敲除对细菌运动能力也有一定影响。刚果红平板检测结果显示,与野生型PAO1菌株相比,P...     

靶向破坏铜绿假单胞菌生物被膜的定向蛋白投放技术

【目的】随着合成生物学的发展,通过在细菌体内设计合成复杂、多功能的基因线路进行靶向治疗已经取得巨大进展。虽然这种使用细菌作为治疗传递系统,选择性地在体内释放有效治疗成分的方式具有极大优势,但是如何使细菌在代谢负荷增加较低的情况下有效地分泌功能蛋白并发挥作用依旧是一个难题。【方法】针对这一难题,本研究提供了一种新的策略,即以细菌中广泛存在的蛋白类杀菌素和丝状噬菌体等相关编码基因作为生物模块,通过对铜绿假单胞菌的这些内源生物模块的重新编排和组装,构建了一种能在特定条件下裂解并投放功能蛋白的工程菌。为了评价工程菌中构建的生物模块能否工作,本研究选择胞外多糖水解酶PelA和PslG作为工程菌投放的功能蛋白,以此构建了工程菌PAO1102。通过对铜绿假单胞菌生物被膜的破坏实验、抑制形成实验以及抗生素耐药性实验,检验PAO1102对铜绿假单胞菌生物被膜的破坏和预防效果。【结果】与对照组相比,工程菌PAO1102的处理可以显著破坏已形成的生物被膜并抑制生物被膜的形成,同时还可显著增强生物被膜中的细菌对妥布霉素的敏感性,且这些功能主要通过外界Pf4丝状噬菌体侵染并使工程菌裂解而释放功能蛋白这一途径实现的。【结论】本研究所构建的工程菌可以作为一种微生物工具,用于靶向破坏铜绿假单胞菌生物被膜。在后续的研究中可根据不同的需求,在工程菌中表达不同的功能基因并实现功能蛋白的定向投放,从而执行不同的生物学功能。     

c-di-GMP的磷酸二酯酶PA4781在抗菌肽Merecidin抑制铜绿假单胞菌生物被膜中的作用

【背景】抗菌肽Merecidin可抑制临床菌株铜绿假单胞菌PA03生物被膜。PA4781基因是课题组通过生物信息学分析筛选出的差异表达基因,PA4781作为细菌第二信使分子环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)的磷酸二酯酶具有降解c-di-GMP的作用,其在抗菌肽Merecidin抑制生物被膜中的作用机制尚不清楚。【目的】研究细菌第二信使分子c-di-GMP的磷酸二酯酶PA4781基因在抗菌肽Merecidin抑制铜绿假单胞菌生物被膜中的作用。【方法】利用单碱基突变技术敲除PA4781基因,Sanger测序方法检测敲除的正确性。采用结晶紫染色法观察PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株24 h生物被膜生长情况,以及在抗菌肽Merecidin 24、48、72μmol/L作用下各菌株生物被膜的生长情况。采用对羟基联苯溶液显色法检测在抗菌肽Merecidin 48、72μmol/L作用下,PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株生物被膜藻酸盐的变化情况。【结果】Sanger测序结果显示,用pnCasPABEC系统成功实现了靶点位置的单碱基突变,提前终止了PA4781的转录;结晶紫染色结果显示,培养24h时,在24μmol/L抗菌肽Merecidin作用下PA03菌株、PA4781过表达菌株、PA4781敲除菌株生物被膜形成情况无显著性差异(P0.05),在抗菌肽Merecidin 48、72μmol/L处理下,过表达株与正常株和敲除株有显著性差异(P0.05),生物被膜明显减少,敲除株生物被膜厚度高于PA03组(P0.05)。随着抗菌肽Merecidin浓度升高各组藻酸盐含量下降,其中过表达菌株在抗菌肽Merecidin作用下藻酸盐生成量抑制率最高,可达65%。【结论】抗菌肽Merecidin能够促进细菌第二信使分子磷酸二酯酶PA4781的表达,为抗菌肽Merecidin抑制铜绿假单胞菌生物被膜的作用机制可能通过细菌第二信使分子这一信号途径提供新的研究思路。     

铜绿假单胞菌水解弹性蛋白能力相关基因的筛选与鉴定

【目的】研究铜绿假单胞菌弹性蛋白水解能力相关基因。【方法】应用人工Mu转座技术构建铜绿假单胞菌野生型菌株PA68的转座突变文库,从2000多个突变子中筛选得到4株弹性蛋白水解能力改变的突变子,并通过克隆及测序获得转座子插入位点侧翼的序列。将铜绿假单胞菌弹性蛋白酶结构基因lasB的转录启始区序列整合入载体pDN19lacΩ并将该重组质粒电转化入野生型菌株PA68及4个突变株中,对报告基因在不同菌株中的表达水平进行测定。【结果】发现4个突变株中Mu转座子分别插入lasA、galU、xcpZ和ptsP 4个基因。ptsP基因失活的突变株中,lasB基因的转录水平是野生型菌株的7%,xcpZ和lasA基因的失活使lasB基因的转录水平分别降低为野生株的54%和75%,galU基因的插入失活使lasB基因的转录上升了1倍。【结论】推测ptsP和galU基因很可能直接或间接地调控着弹性蛋白酶的生物合成。     

霍乱弧菌DsbA蛋白通过增强MSHA的表达促进生物被膜的形成

【目的】阐明霍乱弧菌DsbA蛋白(VcDsbA)在生物被膜形成过程中的作用。【方法】采用Overlapping PCR的方法构建VcdsbA基因敲除质粒p MH524;采用同源重组和基因克隆的方法对霍乱弧菌dsbA(vc0034)基因进行敲除和回补;通过结晶紫染色实验,比较野生株(WT)、dsbA突变株(ΔdsbA)和回补菌株(CΔdsbA)的生物被膜形成差异;用荧光素酶基因作为报告基因分析与生物被膜形成相关的甘露糖敏感血凝素纤毛合成蛋白(Mannose-sensitive hemagglutinin,pili biogenesis protein,MSHA)在霍乱弧菌WT、ΔdsbA和CΔdsbA中表达水平的区别。【结果】成功构建霍乱弧菌dsbA基因缺失突变株和回补株;与WT相比,ΔdsbA生物被膜形成能力显著下降,且msh操纵子的表达水平显著降低。【结论】VcDsbA可能通过影响其它调控因子直接或间接增强霍乱弧菌MSHA的生物合成,从而促进霍乱弧菌生物被膜的形成。本文为进一步研究DsbA在霍乱弧菌生物被膜形成中的调控机制奠定了基础。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。     

Time of detection of recessive genes: effects of system of mating and number of examined individuals

Summary Anthers were cultured from two sets of seven lines of hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) with different cytoplasms, the euplasmic nucleus donors, Siete Cerros 66 and Penjamo 62, as well as their six alloplasmic lines derived from wild relative species of the genera Triticum and Aegilops. Significant cytoplasmic and nuclear effects but no cytoplasmic-nuclear interaction were found for embryogenic anther response, with the best performance of Penjamo 62 in Ae. kotschyi cytoplasm. Plant regeneration was not affected significantly by the cytoplasmic background of the lines cultured. The possible genetic implications of the observed cytoplasmic and nuclear influences on the in vitro haploid induction of wheat are discussed.     

The effects of glutamine of the maintenance of embryogenic cultures of Cryptomeria japonica

Summary Embryogenic tissues of sugi (Cryptomeria japonica) were induced on a modified Campbell and Durzan (CD) medium containing 1 μM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 600 mg l⁻¹ glutamine, and subcultured in the medium of the same composition for over 1 yr. This resulted in a mixed culture of embryogenic and non-embryogenic cells. When embryogenic cells were isolated and cultured independently, their capacity to form embryogenic aggregates was lost. Thus, the non-embryogenic cells present within a mixed culture system were essential to the formation of embryogenic aggregates. When embryogenic tissues were isolated and cultured independently on a high glutamine-containing (2400 mg l⁻¹) medium, dry weights and endogenous levels of glutamine increased, and the tissue could generate a large number of embryogenic aggregates. Amino acid analysis of embryogenic and non-embryogenic cells from the maintenance culture indicated a higher level of glutamine was present in the latter. The high endogenous level of glutamine in the non-embryogenic portion of mixed cell masses may be the supplier of glutamine for maintaining the embryogenic property of the tissues.     

Specificity of action of piperidylcholine derivatives as substrates of cholinesterases of various origin

The review deals with study of enzymologic properties of a novel highly specific acetylcholinesterase substrate, N-(β-acetoxyethyl) piperidinium iodomethylate (“piperidylcholine”), and its 30 derivatives that were tested as effectors of cholinesterases of mammals and various species of Pacific squids. It was proven for the first time that responsible for specificity of action was structure of cyclic ammonium grouping of the alcohol part of molecule of the ester substrate. Analysis of specificity is performed based on enzymatic hydrolysis parameters—activity of catalytic center of cholinesterases and bimolecular constant of the reaction rate that are determined at optimal and low substrate concentrations. Among the specially synthesized group of thioester compounds there is revealed one more highly specific acetylcholinesterase substrate—N-(β-acetoxyethyl) piperidinium.