厦门市健康人群肠道病毒D68型血清流行病学调查

肠道病毒D68型（Enterovirus D68,EV-D68）是一种可引起急性呼吸道感染并诱发中枢神经系统疾病的小RNA病毒。开展相关血清流行病学调查,有助于了解病毒在人群中的感染水平,为制定有效防控策略提供科学依据。本研究为了解厦门市EV-D68的流行概况与流行病学特征,采用分层随机抽样的方式收集了2016年厦门市健康人群血清标本共515份,应用基于酶联免疫斑点检测技术的中和试验（Enzyme-linked immunospot assay）检测针对EV-D68流行株的血清中和抗体滴度。结果显示,血清样本中EV-D68中和抗体的总体阳性率为81.9%,中和抗体的总体几何平均滴度（Geometric Mean Titer,GMT）为248.0。<1岁组、1～3岁组、4～6岁组、7～19岁组、20～39岁组、40～59岁组和≥60岁组的EV-D68中和抗体阳性率分别为42.2%、49.3%、71.9%、94.2%、98.5%、100%和100%,各年龄组之间差异有统计学意义（P<0.0001）;各年龄组的中和抗体GMT分别为1∶39.8、1∶80.6、1∶133.2、1∶2...     

肠道病毒68型的研究进展

2014年,在美国暴发了肠道病毒68型(enterovirus D68,EV-D68)感染相关的急性呼吸道疾病,引起全球对EV-D68的广泛关注。EV-D68属于小RNA病毒科肠道病毒属,然而其某些生物学特性和流行规律却与典型肠道病毒不同。EV-D68可通过呼吸道传播,重症患者可表现与脊髓灰质炎相似的神经系统症状,且有一定的死亡率。该病原在世界多个国家和地区的流行为世界公共卫生安全提出了挑战。现对EV-D68流行概况、分子流行病学、血清中和抗体、交叉保护等方面的研究进展作一综述。     

肠道病毒68型新型中和试验方法的建立及其初步应用

针对肠道病毒68型(EV-D68)建立一种新型快速、高效的中和试验方法,并初步评价其在EV-D68流行病学研究中的应用价值。以灭活EV-D68病毒免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤技术制备其单克隆抗体;筛选反应性好、特异性强的抗EV-D68单克隆抗体作为检测抗体,基于酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)建立EV-D68高效中和试验方法;进一步比较该方法与传统中和试验方法 Nt-CPE的一致性,并使用该方法对临床血清样本进行检测。共获得10株分泌抗EV-D68单克隆抗体的杂交瘤细胞株,选取一株性能最优的15C5进行生产纯化,鉴定其为IgG3亚型;以15C5为检测抗体,建立了快速检测EV-D68中和抗体的Nt-ELISPOT方法;与Nt-CPE方法比较,Nt-ELISPOT方法将检测时间由5~7d缩短至1d以内,并且两种方法检测结果一致性良好;应用所建立的Nt-ELISPOT方法对厦门地区146份人群血清样本进行检测,显示血清样本EV-D68中和抗体阳性率为98.6%(144/146),提示厦门地区可能存在过EV-D68的流行。本研究基于ELISPOT建立的新型EV-D68中和试验方法快速可靠,适合通量检测,可以应用于EV-D68中和抗体水平的血清学调查,为EV-D68感染的防控工作提供帮助。     

人粒细胞集落刺激因子（hG－CSF）cDNA3′－UTR对其表达的影响

利用人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ３′端非翻译区（３′－ＵＴＲ）中存在的ＤｒａⅠ酶切位点,通过部分酶切与完全酶切,删除３′－ＵＴＲ不同长度,构建了四种ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ瞬时重组表达质粒。转染ＣＯＳ－７细胞后,生物活性测定结果提示,ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ３′－ＵＴＲ对其表达起负调控作用,其关键性序列位于紧接终止密码子ＴＧＡ下游的６５ｂｐ范围内,３′－ＵＴＲ对ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ表达的影响与转录水平的差别有一定关系。     

人肠道病毒71型亚单位疫苗的研制

目的利用原核表达技术制备人肠道病毒71型（EV71）的亚单位融合疫苗,并通过小鼠模型对其保护效果进行评价。方法在大肠杆菌中融合表达EV71的亚单位肽段,随后将肽段免疫雌鼠,对其交配后产下的幼鼠进行病毒感染,通过检测其组织内的病毒拷贝数和病理变化,对疫苗的保护效果进行评价。结果通过肽段融合的方法,得到五种备选疫苗,分别为VacA,VacB,VacC,VacD和VacE,这五种疫苗均具有一定的体外保护能力,并且VacB和VacC与正常人大脑组织无明显交叉反应。动物模型评价结果显示,VacB和VacE能赋予幼鼠抗病毒感染的保护效果。结论利用EV71的小鼠感染模型评价了针对EV71的亚单位联合疫苗,VacB和VacE的保护效果较好,此外,VacB与人脑组织间无明显交叉反应,可以作为潜在的无神经毒性的临床使用疫苗。     

人肠道病毒71型基因重组的研究进展

人肠道病毒71 型(Enterovirus 71,HEV-A71),是手足口病(Hand,footandmouthdisease,HFMD)的常见病因,属于人肠道病毒属中的肠道病毒A型,隶属于微小RNA病毒科.许多研究证明HEV-A71经常发生基因重组并且使得HEV-A71在全球内多次暴发,这对疫苗的研发和疾病的防控是一种新的挑战.本文对HEV-A71不同亚型内、不同型间和多重重组等不同基因重组类型及其毒力、抗原性变化进行了综述.     

人免疫球蛋白中肠道病毒71型中和抗体效价的测定

目的:对人免疫球蛋白和肠道病毒71型和抗体效价进行测定。方法:采用微量细胞病变法,以试验和毒株-01、毒株-02进行检测,对比三种试验检测结果的差异。结果:检测人免疫球蛋白中肠道病毒71型中和抗体效价范围在105~256之间,效价≥239为12批,占总批数的40%,效价≥256为10批,占总批数的33.3%;毒株-01检测效价范围约为224~476,平均滴度为334。3批静注肠道病毒71型平均滴度为1400,高于3个厂家10批人免疫球蛋白含量,(P<0.05)。毒株-02检测效价范围在195~620之间,平均滴度为330,与毒株-01的检测结果差异不明显,不具有统计学意义(P>0.05)。毒株-01和毒株-02检测的17批人免疫球蛋白的肠道病毒71型中和抗体平均滴度为333,效价≥256,可应用于临床重症治疗。结论:经检测,我国各厂家中的人免疫球蛋白中的肠道病毒71型中核抗体效价均为阳性,静注肠道病毒71型免疫球蛋白高于普通人免疫球蛋白的中和效价。     

人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的表达及其结构初步研究

为了解人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的结构,本研究构建了EV-D68 3A蛋白可溶区的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化并对其结构进行了初步研究。首先,采用PCR的方法扩增EV-D68 3A(1~61)基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a-His-SUMO中,转化进入BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达出His-SUMO-3A(1~61)融合蛋白。经Ni-NTA树脂亲和层析初步纯化后得到大量融合蛋白,利用ULP酶酶切去除His-SUMO标签,通过Ni-NTA树脂亲和层析、阴离子交换层析柱、分子筛层析等方法分离标签并进一步纯化目的蛋白。最后通过化学交联反应检测目的蛋白的多聚化状态。结果显示,利用pET28a-His-SUMO-3A(1~61)原核表达载体能够在大肠杆菌中成功表达出大量可溶性的融合蛋白;经过多步纯化方法得到了大量高纯度的目的蛋白,平均每升大肠杆菌可得到约5mg目的蛋白,纯度达95%以上;通过化学交联反应证明了该蛋白的多聚化存在形式。本研究成功建立了EV-D68 3A蛋白可溶区的表达和纯化系统,为进一步获得3A蛋白晶体、研究3A蛋白功能以及设计以3A为靶点的抗病毒药物奠定了基础。     

人免疫球蛋白中肠道病毒71型中和抗体效价的测定

采用经典微量细胞病变法,应用近两年分离自中国手足口病(HFMD)高发区的3株肠道病毒71型(EV71)病毒株,对中国不同血液制品厂家生产的35批人免疫球蛋白制品进行抗-EV71中和效价检测。结果显示,3株不同EV71病毒株间的抗-EV71中和效价差异均在4倍以内,差异无显著的统计学意义(F=2.323,P0.05)。根据这3株毒株检测结果判定,35批人免疫球蛋白的抗-EV71均为阳性,肌肉注射用免疫球蛋白(简称肌丙)的抗-EV71-GMTs(525.9)显著高于静脉注射用免疫球蛋白(简称静丙)的GMTs(252.3,F=66.518,P0.01)。30批静丙的抗-EV71-GMTs中和效价分布在128.0~384.0之间。应开展原料血浆中抗-EV71中和效价的筛选,研制高效价的EV71特异性免疫球蛋白制品,用于HFMD的治疗和预防。     

miR373和miR542-5p调控肠道病毒71型在人横纹肌肉瘤细胞中的复制

研究发现microRNAs(miRNAs)可以参与调控病毒在宿主细胞内感染和复制的过程。为了揭示miRNAs是否参与肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的感染与复制,研究了miRNAs对EV71病毒在宿主细胞内复制的影响。构建miRNAs靶基因筛选系统,在双荧光素酶报告体系的pMIR载体插入病毒基因,如果插入的基因序列能被细胞内的miRNAs靶向调控,报告基因的表达将发生变化。实验发现EV71病毒5′-UTR基因可能是miRNAs的作用靶标。随后利用miRNAs在线分析软件预测并验证可能作用于5′-UTR基因片段的miRNAs。为了研究miRNAs分子对5′-UTR基因的调控作用是否可以体现在EV71病毒的复制过程中,在人横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞中转染miRNAs mimics,利用Western blotting和real-time PCR实验检验EV71病毒的复制和表达情况。实验结果表明,miR373和miR542-5p可以通过作用于EV71病毒5′-UTR基因从而抑制病毒在RD细胞中的复制和表达。细胞内miR373和miR542-5p可以调控EV71在宿主细胞中的复制过程。研究EV71病毒与宿主miRNAs的相互作用机制为进一步阐明EV71病毒感染与复制机理奠定了基础。     

肠道病毒71型感染对细胞内钙离子分布的影响

利用流式细胞技术和激光共聚焦显微镜技术观察EV71感染前后,细胞内钙离子分布变化情况。细胞感染EV71后,细胞内质网内钙离子浓度显著降低,细胞质及线粒体内钙离子浓度显著升高。 EV71的感染能够引起宿主细胞内钙离子的分布变化,这种变化可能会调节病毒与宿主细胞间的一系列相互作用。     

细菌脂多糖对肠道病毒71型感染影响的初步研究

肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)感染常导致婴幼儿手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD),细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)在多种肠道病毒感染过程中起重要作用。本研究旨在探讨细菌LPS对EV71感染的影响。将EV71与LPS共孵育,测定病毒被热处理后残留病毒的活力,以及病毒感染过程中病毒基因拷贝数的变化。结果显示,热处理后病毒活力逐渐丧失,而经LPS处理的病毒活力丧失的速度减缓,且残留病毒活力与LPS浓度呈正相关;LPS处理后的病毒在黏附、侵入、胞内复制及释放过程中基因拷贝数较对照组均降低;免疫印迹分析表明LPS与抗VP1单克隆抗体可竞争性结合EV71,且粪便中的EV71可被抗大肠埃希菌抗体识别。上述结果提示,LPS可增强EV71热稳定性,抑制EV71感染过程,且LPS可能与EV71结合。     

C4亚型人肠道病毒71型的小鼠肌肉适应株对小鼠具有致死毒力

目的人肠道病毒71型（EV71）感染婴幼儿可导致手足口病,偶尔伴随有严重的并发症。建立EV71的小鼠模型是深入研究病毒感染的致病机制、进行疫苗和药物评价的基础。方法将EV71的临床分离株在小鼠骨骼肌中进行系列传代,得到了小鼠的肌肉适应株MP10。使用MP10经腹腔注射感染10日龄ICR小鼠,对感染小鼠的症状、病毒复制和病理进行了监测。结果与临床分离株相比,MP10对人横纹肌瘤细胞（rhabdomyosarcoma cell,RD细胞）的感染力提高,并且对小鼠的毒力增强,MP10感染10日龄小鼠可导致其瘫痪和死亡。病毒主要在骨骼肌中复制,并引发大面积的坏死性肌炎,同时神经组织未观察到病变。病理分析发现：感染小鼠体内与呼吸运动相关的肌肉均发生严重的坏死性肌炎,推测此类肌肉的坏死会影响小鼠的呼吸功能,从而成为导致小鼠死亡的因素之一。结论建立了C4亚型EV71毒株感染10日龄ICR小鼠的模型,该模型可作为研究EV71感染的致病机制、以及疫苗和药物评价的工具。     

纤维顶球改造增强了人5型腺病毒载体对造血细胞的感染

基于人5型腺病毒(Human adenovirus type 5,HAdV-5)的腺病毒载体对造血细胞的基因转导效率低,将病毒fiber基因替换为HAdV-11p的同源基因F11p后,载体对造血细胞的感染效率增强.本研究拟在F11p纤维顶球(knob)结构域添加RGD4C多肽或HIV包膜糖蛋白(gp120)的V3结构域,观察重组HAdV-5对造血细胞感染效率的变化.在前期构建的pKAd5f11p153R-EPG腺病毒质粒基础上,结合限制性酶切和DNA组装技术,在F11p 153 aa后(knob AB loop,153位)、228位(FG loop)以及300位(IJ loop)插入 RGD4C 肽或者 gp120的 V3肽,构建了共6种重组腺病毒载体(F153RGD-EG、F228RGD-EG、F300RGD-EG、F153CV-EG、F228CV-EG和 F300CV-EG),以fiber未改造的HAdV5-EG和改造为F11p的F11p-EG病毒作对照,观察了其对4种造血细胞系U937、K562、Jurkat和HL60以及人原代T细胞的感染效率.结果显示,对于U937细胞,当感染复数(MOI,vp/cell)为100时,HAdV5-EG感染效率最低,为2％;其次为F228CV-EG,感染率为45％;F300RGD-EG、F153CV-EG和F300CV-EG感染率为85％～90％;F153RGD-EG、F228RGD-EG高于阳性对照病毒F11p-EG,三者分别为99％、99％、95％.各病毒对于Jurkat细胞的感染率均较高,但HAdV5-EG明显低于F11p-EG、F153RGD-EG和F228RGD-EG,当MOI为100时分别为75％、93％、93％和96％.感染K562细胞的情况与U937细胞类似.各病毒对于HL60细胞感染效率最低,MOI为500时,F300RGD-EG和F300CV-EG的转导效率为28％和33％,是F11p-EG的10倍.对于人原代T细胞,F153RGD-EG和F228RGD-EG优于F11p-EG,当MOI为1000时,感染率分别为87％、90％和84％.研究结果表明,F11p knob插入RGD4C比单独F11p替换的HAdV-5对造血细胞的感染效率高,同时,本研究还发现HAdV-11p fiber knob的AB、FG或IJ loop可插入外源多肽,为腺病毒嗜向性改造增加了新靶点.     

操作条件对5′-单磷酸胞苷晶体粒度分布的影响

为了研究操作条件对5。单磷酸胞苷（5′-CMP）晶体粒度分布的影响,分别采用不同形式的搅拌桨、搅拌速率以及反应液流加速率,并且运用激光粒度仪和扫描电镜对晶体粒度分布及形貌进行分析观测。结果显示：采用不同形式的搅拌桨形成的剪切力、颗粒聚集以及二次成核现象的差异导致了晶体粒度分布峰值数量不同;分别选取50、100和150r／min的搅拌速率以及1、3和6mL／h的流加速率时,晶体平均粒径在铆式搅拌桨作用下,在120．3—212．1μm范围内递减,而在45°斜角四折叶式搅拌桨作用下递减范围为3．17～150．2μm,且粒度分布更为均匀,为工业生产中的优化控制提供了一定的理论依据。     

肠道病毒A组71型在人脐静脉血管内皮细胞中的增殖及对细胞骨架的影响

目的研究肠道病毒A组71型(Enterovirus group A type 71,EV-A71)在人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中的增殖及对细胞骨架造成的影响,初步探讨其与病毒血症发生的关系。方法采用qRT-PCR技术及免疫荧光技术检测EV-A71在HUVECs中的复制和增殖,用免疫荧光双染色技术观察三种细胞骨架在EV-A71感染后的变化。结果 EV-A71能够有效感染HUVECs,且感染后24 h在细胞内复制达到高峰。病毒感染后微丝骨架完全解聚,微管骨架排列方式发生改变,而中间纤维结构模糊不清;同时检测到微管及中间纤维与病毒抗原共存。结论 EV-A71可以感染HUVECs并在其内有效复制增殖,同时诱导HUVECs三种细胞骨架发生改变,提示细胞骨架可能参与EV-A71感染HUVECs的过程。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)mRNA5′端非翻译区(UTR)对其表达的调控

运用反转录-PCR技术,从黑色素瘤细胞中扩增出t—PA cDNA 5′末端460bp的片段,再经重组获得含完整5′-UTR的t—PA cDNA克隆,在兔网织红细胞裂解物中翻译和COS-7细胞中表达发现,t—PA mRNA 5′—UTR对其表达有明显的抑制作用。将t—PA mRNA 5′—UTR用苜蓿病毒RNA 5′—UTR替换,使t—PA的表达水平提高3-7倍,mRNA翻译起始区二级结构分析结果表明,翻译起始区的二级结构与t-PA的表达水平有关。     

Sabin2型脊髓灰质炎病毒适应人胚肺二倍体细胞不同代次病毒滴度与5′端非编码区变异关系

脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)是一类无包膜单股正链RNA病毒,基因组长约7．5kb。其5′端非编码区由约742个核苷酸长,主要与病毒RNA复制、蛋白翻译起始、病毒颗粒的装配及病毒的细胞适应减毒及神经毒力密切相关。我们研究发现,脊髓灰质炎病毒(Sabin株)在人胚肺二倍体细胞(KME17)上致细胞病变较猴肾细胞慢,病毒产量亦明显低于恒河猴肾细胞培养,国内外也有类似的报道。