带有木糖还原酶基因和木糖醇酶基因的重组酿酒酵母的构建

采用双载体系统,将携带有瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的表达质粒ｐＡＪ４０１－ｘｄｈ１转化已带有树干毕赤氏酵母木糖还原酶基因的重组酿酒酵母Ｈ４７５,构建了同时带有毕赤氏酵母木糖还原酶基因和瑞氏木霉木产基因的重组酿酒酵母ＨＸ１,研究了重组酿酒酵母ＨＸ１对木听转化利用情况。     

带有木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的重组酿酒酵母的构建

采用双载体系统,将携带有瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的表达质粒pAJ401－Xdh1转化已带有树干毕赤氏酵母木糖还原酶基因的重组酿酒酵母H475,构建了同时带有毕赤氏酵母木糖还原酶基因和瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的重组酿酒酵母HX1。研究了重组酿酒酵母HX1对木糖的转化利用情况。     

URA3基因影响青蒿酸酿酒酵母工程菌中试发酵产量

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经被广泛应用于工程酿酒酵母的基因插入、基因替换和基因敲除,通过使用选择标记进行基因编辑具有简单高效的特点。前期利用CRISPR/Cas9系统敲除青蒿酸生产菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 1211半乳糖代谢负调控基因GAL80,获得菌株S. cerevisiae 1211-2,在不添加半乳糖诱导的情况下,青蒿酸摇瓶发酵产量达到了740 mg/L。但在50 L中试发酵实验中,S. cerevisiae 1211-2很难利用对青蒿酸积累起到决定性作用的碳源-乙醇,青蒿酸的产量仅为亲本菌株S.cerevisiae 1211的20%–25%。我们推测因遗传操作所需的筛选标记URA3突变,影响了其生长及青蒿酸产量。随后我们使用重组质粒pML104-KanMx4-u连同90 bp供体DNA成功恢复了URA3基因,获得了工程菌株S. cerevisiae 1211-3。S. cerevisiae 1211-3能够在葡萄糖和乙醇分批补料的发酵罐中正常生长,其青蒿酸产量超过20g/L,与亲本菌株产量相当。研究不但获得了不加半乳糖诱导的青...     

代谢木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母的构建

为使酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YS58代谢木糖产乙醇,采用PCR方法克隆得到树干毕赤酵母（Pichia stipitis）木糖醇脱氢酶基因xy12,并将该基因和克隆得到的休哈塔假丝酵母（Candida shehatae）缺终止子的木糖还原酶基因xyl1一起连接到酵母表达载体pYES2的强启动子GAL下,得到融合表达载体pYES2-P12。通过醋酸锂转化的方法将pY-ES2-P12转入S.cerevisiae YS58中,得到S.cerevisiae YS58-12。利用所构建的重组酿酒酵母进行术糖发酵实验,结果表明该重组酵母能发酵木糖,使木糖利用率得到进一步提高,最高达到81．3％,而且能代谢木糖产生乙醇。     

酿酒酵母木糖发酵酒精途径工程的研究进展

途径工程(Pathway engineering),被称为第三代基因工程,改变代谢流向,开辟新的代谢途径是途径工程的主要目的。利用途径工程理念,对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）代谢途径进行理性设计,以拓展这一传统酒精生产菌的底物范围,使其充分利用可再生纤维质水解物中的各种糖分,是酿酒酵母酒精途径工程的研究热点之一。这里介绍了近年来酿酒酵母以木糖为底物的酒精途径工程的研究进展。     

基因组编辑对酿酒酵母DNA的损伤作用及修复响应

【目的】为了研究基因组编辑工具CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1所产生的DNA双链断裂(DNA doublestrandbreak,DSB)对酿酒酵母DNA的损伤作用及修复响应情况,对比化学物质甲基磺酸甲酯(methyl methanesulfonate,MMS)对酿酒酵母基因组DNA的损伤和修复,阐明编辑细胞在细胞水平和转录水平上的变化。【方法】起始细胞分为两种情况,包括未进行细胞周期同步化和被α-因子同步化细胞周期至G0/G1期。检测CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1处理后编辑细胞的生长情况。利用流式细胞术检测编辑细胞的细胞周期延滞的情况。利用荧光定量PCR检测编辑细胞和MMS处理细胞后DNA损伤响应关键基因转录表达水平的变化情况。【结果】起始细胞无论是未同步化还是同步化,其生长均受到基因组编辑抑制,细胞存活率降低,细胞周期被滞留在G2/M期,而MMS处理导致细胞周期S期的滞留。此外,随编辑时间的延长,突变率增加,细胞存活率降低。CRISPR/Cpf1编辑细胞的突变率和存活率均低于CRISPR/Cas9,由此可见,CRISPR/Cpf1对细胞的损伤强度高于CRISPR/Cas9。两种编辑均诱导酵母DNA损伤响应关键基因RNR3及HUG1转录水平显著上调,并且CRISPR/Cpf1介导的上调幅度大于CRISPR/Cas9,但两者均低于MMS的处理。【结论】本研究解析了CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1介导的基因组编辑在细胞水平和转录水平上对DNA损伤作用及修复响应,初步揭示了酿酒酵母应对不同类型的DSB损伤时响应程度的差异,为提高基因组编辑工具的编辑能力和评估基因编辑安全性提供了重要依据。     

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae重组菌株木糖醇发酵的初步研究

木糖还原酶催化木糖为木糖醇的反应,是木糖代谢的第一步。将木糖还原酶的原因ＸＹＬ１引入酿酒酵母中,构建得到儿表达ＸＹＬ１基因的重组酿酒酵母菌株ＨＹＥＸ２,该重组菌株的木糖还原酶比活力为７．４７Ｕ／ｍｇ。研究表明,该菌株获得转化木糖产生木糖醇的能力,当辅助碳源葡萄糖的浓度为２％,并在发酵３０ｈ左右添加木糖,木糖醇的转化率可达到０．９７ｇ／ｇ。     

木糖异构酶在酿酒酵母细胞表面的展示

将来源于嗜热细菌Thermus thermophilus的木糖异构酶基因xylA,与酿酒酵母(Sac-charomyces cerevisiae)a-凝集素表面展示载体pYD1的Aga2p亚基C端序列融合。编码融合蛋白的基因序列前接上半乳糖诱导型启动子。用LiAc完整细胞法转化酿酒酵母EBY100。含重组质粒的菌株EBY100/pYD-xylA经半乳糖诱导表达外源融合蛋白,免疫荧光显微镜结果显示外源蛋白被锚定在细胞壁上,木糖异构酶活性测定结果表明,细胞壁上酶活测定值为1.52U,木糖异构酶在酿酒酵母细胞壁上得到活性表达。     

CRISPR/Cas9介导的高产谷胱甘肽原养型酵母工程菌的构建

谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是具有多种生理功能的非蛋白质类巯基化合物,已广泛应用于药品、食品等行业,且市场需求量逐年增加。遗传工程育种是提高细胞内GSH含量的重要策略,但在遗传操作过程中使用到的营养缺陷型遗传标记可能会影响菌株的正常生长,且不利于高密度发酵的进行。为回复工程菌株的营养缺陷型,利用g RNA转录表达框和靶基因同源DNA片段直接共转化酵母细胞,由细胞内表达的Ⅱ型CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-Cas9)介导的基因组编辑技术将营养缺陷型GSH工程菌株W303-1b/FGP回复为原养型菌株。结果显示,与营养缺陷型菌株相比,原养型菌株生长周期缩短,且可以利用简单的合成培养基进行培养,方便菌株的大规模培养。     

一种基因工程改造的NADH高亲和力木糖还原酶突变基因可促进酿酒酵母发酵木糖生成乙醇

在导入表达毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶(xylose reductase,XR)和木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)基因的重组酿酒酵母中,木糖还原酶活性主要依赖辅酶NADPH,木糖醇脱氢酶活性依赖辅酶 NAD+,两者的辅助因子不同导致细胞内电子氧化还原的不平衡,是造成木糖醇积累,影响木糖代谢和乙醇产量的主要原因之一.将经过基因工程改造获得的NADH高亲和力的木糖还原酶突变基因m1,与毕赤酵母木糖醇脱氢酶(PsXDH)基因xyl2共转染酿酒酵母AH109,以转染毕赤酵母木糖还原酶(PsXR)基因xyl1和xyl2重组质粒的酵母细胞为对照菌株,在SC/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基中进行筛选,获得的阳性转化子分别命名为AH-M-XDH和AH-XR-XDH.重组酵母在限制氧通气条件下对木糖和葡萄糖进行共发酵摇瓶培养,HPLC检测发酵底物的消耗和代谢产物的产出情况.结果显示,与对照菌株AH-XR-XDH相比,AH-M-XDH的木糖利用率明显提高,乙醇得率增加了16%,木糖醇产生下降了41.4%.结果证实,通过基因工程改造的木糖代谢关键酶,可用于酿酒酵母发酵木糖生产乙醇,其能通过改善酿酒酵母细胞内氧化还原失衡的问题,提高木糖利用率和乙醇产率.     

运用CRISPR/Cas9技术构建表达10rolGLP-1的降糖酵母

为研发一种用于治疗2型糖尿病的新型生物药物,本研究运用实验室前期构建的10rolglp-1基因和CRISPR/Cas9基因组编辑技术创建了重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌株。构建了向导RNA(guide RNA,gRNA)表达载体pyES2-gRNA、供体载体pNK1-L-PGK-10rolGLP-1-R和Cas9表达载体pGADT7-Cas9,将这些表达载体共转化酿酒酵母INVSc1菌株,通过同源重组途径敲入PGK-10rolGLP-1表达单元,最终得到具有降血糖功能、高表达10rolGLP-1的酿酒酵母。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹,筛选出2种稳定表达10rolGLP-1的酿酒酵母重组菌株。降血糖实验结果表明,重组降血糖酿酒酵母对糖尿病小鼠模型具有显著的降血糖作用,其血糖下降平缓,可避免引起低血糖风险。体重变化和多尿等其他症状也明显改善,表明本研究构建的口服降血糖酿酒酵母有望成为一种简单有效、经济实用的糖尿病生物药物。     

代谢工程改造酿酒酵母合成植物萜类D-柠檬烯的策略

植物萜类化合物是以异戊二烯为结构单位的一大类植物天然的次生代谢产物。D-柠檬烯属于单萜类化合物,由于它具有抑菌、增香、抗癌、止咳、平喘等多种功能,已被广泛应用于食品、香料、医疗等行业。目前D-柠檬烯的工业生产主要是从植物的果皮或者果肉中提取的,但提取方法存在着分离纯化复杂、产率低、能耗大等缺点。而本世纪初合成生物学技术的兴起,为微生物异源合成天然活性化合物带来了全新的理念与工具,打破了物种间的界限,使微生物异源合成D-柠檬烯成为现实。构建定向、高效的异源合成D-柠檬烯的微生物细胞工厂,实现微生物发酵法替换传统的植物提取法,具有重要的经济与社会效益。本文主要回顾了近几年利用代谢工程改造酿酒酵母异源合成萜类化合物取得的成就,阐述了以酿酒酵母作为底盘微生物,利用代谢工程和合成生物学的手段构建高产D-柠檬烯的合成策略。     

Isolation of cobalt hyper-resistant mutants of Saccharomyces cerevisiae by in vivo evolutionary engineering approach

Cobalt is an important element with magnetic properties used in various industrial applications, but is also needed for biological activity. Very little is known about the cellular response of living systems to cobalt stress. Towards investigating this mechanism, we isolated individual Saccharomyces cerevisiae cells resistant to high cobalt concentrations up to 8 mmol l⁻¹, by employing four different ‘in vivo’ evolutionary engineering strategies: selection under constant or gradually increasing stress levels, and selection under continuous or pulse exposure to cobalt stress. Selection under continuous exposure to gradually increasing cobalt stress levels yielded the most resistant cell population to cobalt. However, the resistance was highly heterogeneous within the mutant populations ranging from 3- to 3700-fold survival rate of isolated individuals to 8 mmol l⁻¹ CoCl₂ in the most resistant population. Moreover, cobalt-resistant individual colonies were associated with 2–4-times lower intracellular cobalt contents as compared to wild-type, and with cross-resistance to metals such as nickel, zinc, manganese, but not to copper and chromium ions. Contrary to mutants evolved under continuous exposure to cobalt, those isolated by pulse exposure strategy also exhibited resistance to heat shock and hydrogen peroxide stress. Taken together, this study reinforced the fact that evolutionary engineering is useful in selecting strains with very specific phenotypes, and further illustrated the importance of the strategy chosen to isolate the best evolved strain.     

Man8GlcNAc2糖基化的酿酒酵母菌株的构建

酿酒酵母糖蛋白的N-糖基化经过高尔基体的修饰后形成聚合度约150-200的甘露寡糖,高尔基体N-糖基化的糖基转移酶Mnn1p和Och1p在甘露寡糖的形成过程中起关键作用。通过同源重组置换敲除了酵母中的MNN1和OCH1基因阻断高尔基体N-糖基化修饰,分离纯化了mnn1 och1突变株中的N-糖蛋白,糖酰胺酶PNGaseF酶解释放的N-糖链经过2-氨基吡啶衍生后,利用HPLC和MALDITOF/MS结合的方法分析了突变株糖蛋白上的N-糖链。结果显示mnn1 och1突变株中的糖蛋白的N-糖链为结构单一的糖链,分子量为1794.66,推测为Man₈GlcNAc₂。     

代谢工程改造酿酒酵母提高法尼醇产量

[目的]法尼醇(FOH,C15H26O)是一种具有芳香气味的非环状倍半萜醇,被广泛应用于化妆品和医学药物的工业化生产,也可作为航空燃料的理想替代品.具有食品级安全性的酿酒酵母细胞能够合成内源性法尼醇,但其产量很低,无法满足工业生产的需要.因此,需要采用代谢工程手段,改造法尼醇合成途径,以有效提高法尼醇在酿酒酵母中的产量...     

木糖醇脱氢酶基因高拷贝表达载体构建及在酿酒酵母中的表达

木糖醇脱氢酶（xylitol dehydrogenase, XDH）可以氧化木糖醇生成木酮糖,处于木糖代谢的节点位置。利用PCR方法克隆得到了休哈塔假丝酵母（Candida shehatae） 20335的木糖醇脱氢酶基因、质粒pKT0150的ADH1终止子序列和G418抗性基因（KanR）,以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W5特定的2.2 kb的rDNA片段。以酿酒酵母整合载体p406ADH1为骨架,利用基因工程手段构建一个多拷贝整合表达载体pLX-AGRX。将重组载体pLX-AGRX线性化转入到酿酒酵母W5后,通过高浓度G418筛选和PCR双重鉴定,证实重组载体pLX-AGRX已整合到酿酒酵母W5基因组上,测定木糖醇脱氢酶酶活可达65.957 4 U/mg。     

酿酒酵母L610利用菊糖生产乙醇发酵条件的研究

以1株能够直接利用菊糖产乙醇的酿酒酵母L610为出发菌株,对其利用菊糖生产乙醇的发酵条件进行了一系列研究。结果表明,L610最适乙醇发酵温度为37℃,且40℃高温发酵对其产乙醇能力无显著影响;L610对酸性发酵环境有良好的耐受性,当发酵液p H值降至3.5时,其糖醇转化率及乙醇产量仍保持较高水平;以0.025~0.10 vvm的通气量通气12 h有利于L610发酵菊糖产乙醇;L610对350 g/L的高浓度菊糖有良好的转化率,乙醇浓度和生产强度分别达到129 g/L和1.35 g/(L·h);当直接以300 g/L菊芋粗粉为唯一底物进行发酵时,L610发酵产乙醇浓度达到89.6 g/L,为理论产量的78.1%。本研究所取得的成果为酿酒酵母一步法发酵菊芋生产乙醇的工业化发展提供参考。