蕙兰CyfaSTK基因的克隆与表达分析

采用同源克隆的方法,从蕙兰（Cymbidium faberi Rolfe）花芽中克隆获得CyfaSTK基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析及基因表达分析。结果显示,该基因全长843 bp,其中开放阅读框（ORF）长705 bp,共编码234个氨基酸和1个终止密码子。同源蛋白序列比对及分子系统发育分析结果表明,CyfaSTK蛋白属于D类MADS-box转录因子STK-like进化系,含有MADS、I、K和C等4个结构域,其C末端转录激活区含有2个保守的基元：AG motifⅠ和AG motifⅡ,此外,还具有一个在天门冬目植物中相对保守的基元MD motif。基因表达的组织特异性分析结果显示：蕙兰CyfaSTK基因在花萼、花瓣、唇瓣、药帽、子房中均有表达,但在叶片中不表达,其中在子房中的表达量与其他组织相比,差异达到极显著水平;CyfaSTK在花芽经过休眠后的萌动期表达量最高,且在开花当天该基因表达量有上升趋势。研究结果表明CyfaSTK基因不仅参与调控蕙兰花器官的发育过程,且对子房及合蕊柱的正常发育具有重要作用。     

草原龙胆MADS-box基因的克隆及表达分析

植物MADS-box 基因家族编码高度保守的转录因子, 参与了包括花发育在内的多种发育进程。为阐释双子叶植物草原龙胆(Eustoma grandiflorum)花器官发育的分子调控机制, 根据MADS-box基因保守序列设计简并引物, 用3'-RACE方法从 草原龙胆中克隆了4个花器官特异表达的MADS-box家族基因。序列和系统进化树分析表明, 这4个基因分别与金鱼草DEF基因、矮牵牛FBP3基因和FBP6基因以及拟南芥SEP3基因具有很高的同源性, 分别属DEF/GLO、AG-like和SEP-l ike亚家族。从而将这4个基因分别命名为EgDEF1、EgGLO1、EgPLE1和EgSEP3-1。推导的氨基酸序列显示, 这些基因编码的蛋白质都包含高度保守的MADS结构域、I结构域和K结构域, 每个基因均有其亚家族特异的C-末端功能域。基因特异性RT-PCR检测结果显示: EgDEF1 在萼片、花瓣、雄蕊及胚珠中高丰度表达, 在心皮中微量表达; 而EgGLO1在花瓣和雄蕊中高丰度表达, 在萼片中微量表达; 在根、茎、叶等营养器官中均未检测到上述2个基因的表达。EgPLE1在雌蕊、心皮和胚珠中特异表达, 但表达的丰度存在差异, 在雄蕊中的表达有所减弱。SEP-like亚家族基因EgSEP3-1在四轮花器官和胚珠中均特异表达,且表达丰度相对一致。     

中国水仙NtAP1基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)幼嫩花芽中分离得到1个与花发育相关的MADS-box基因,将其命名为NtAP1(GenBank登录号为JN704304)。该基因全长1 155bp,含有1个762bp的开放阅读框,编码253个氨基酸。系统进化分析表明,该基因属于AP1-like基因。半定量RT-PCR分析表明,该基因在水仙品种‘金盏银台’和‘玉玲珑’的花瓣、副冠、雄蕊和雌蕊中均有表达,且在雌蕊中的表达量最高。研究认为,该实验分离出的NtAP1基因在‘玉玲珑’重瓣的形成过程中没有发挥重要的作用。     

无核荔枝花发育相关MADS-box基因的克隆及结构分析

目的：克隆与尢核荔枝花发百相关的MADS-box基因。方法：根据多种植物的MADS-box保守区及其C-端序列设计一对简并性引物,利用RT-PCR及3′-RACE的方法分离目的基因。结果：经同源分析,昕克隆到的基因的c-DNA序列包含有完整的MADS-box保守区与半保守的K区,是典型的MADS-box家族基因,命名为LMADSI。结论：成功地克隆到一个与无核荔枝花发育相关的MADS-box基因,以便进一步研究其对无核荔枝花发育的凋控作用。     

菠萝花发育相关基因AcMADS1的克隆与组织表达特性分析

MADS-box转录因子在植物的发育过程特别是控制花器官的诱导与发育中起关键作用。利用同源克隆结合RACE技术, 从菠萝(Ananas comosus)花中分离出1个新的菠萝MADS-box基因, 命名为AcMADS1(GenBank登录号为KC257408)。AcMADS1基因的编码区为726 bp, 编码241个氨基酸, 蛋白质分子量为27.50 kDa, 等电点为9.26。序列比对和系统进化树分析表明, AcMADS1具有保守的MADS-box及半保守的K区, 属于AGL6亚家族MADS-box蛋白。生物信息学分析表明, AcMADS1是亲水碱性蛋白, 二级结构主要以α-螺旋、无规则卷曲和折叠延伸链为蛋白质骨架, 三级结构中蛋白核心结构符合转录因子与DNA结合的常见功能域MADS-box, 而且作为转录因子定位于细胞核中。组织特异性表达分析表明, AcMADS1基因在菠萝果肉以及花器官的雌蕊、花瓣和萼片中均有表达, 但在雄蕊以及营养器官的根、茎和叶中几乎不表达; 且在花器官早期发育过程中大量表达, 后期呈下降趋势。因此推测这个基因可能在菠萝花器官发育和开花诱导过程中起重要作用。     

马银花MADS-box基因家族系统进化与表达分析

杜鹃花属具有极高的物种多样性和观赏价值,其中马银花(Rhododendron ovatum)花型独特,具有低海拔适应性,在我国南方地区有良好的应用前景。基于杜鹃花目代表性植物的基因组信息,探究MADS-box基因家族在杜鹃花目中的进化特点并挖掘马银花的花器官发育关键基因。系统进化分析表明,杜鹃花科3个代表性物种(马银花、映山红(R.simsii)和马缨杜鹃(R.delavayi))中的MADS-box基因家族成员数目较为一致,包括AP1、AP3、PI、AG和SEP等19个亚家族,其中SVP、ANR1、Mα、Mβ和Mγ亚家族成员数量较多。马银花的AG和SEP基因有多个拷贝,而AP3/PI基因的拷贝数目较少,显示出更加保守的进化模式。基因表达分析表明,马银花MADS-box基因的表达模式存在组织特异性。AP1、AP3/PI、AG、SEP和MIKC*分支基因在花器官中特异性表达。综上,该文探讨了马银花MADS-box基因家族进化历史,以及部分MADS-box基因可能具有的功能,可为深入研究马银花的发育和MADS-box基因功能提供参考。     

草原龙胆MADS-box基因的克隆及表达分析

植物MADS-box基因家族编码高度保守的转录因子,参与了包括花发育在内的多种发育进程。为阐释双子叶植物草原龙胆（Eustoma grandiflorum）花器官发育的分子调控机制,根据MADS-box基因保守序列设计简并引物,用3＇-RACE方法从草原龙胆中克隆了4个花器官特异表达的MADS-box家族基因。序列和系统进化树分析表明,这4个基因分别与金鱼草DEF基因、矮牵牛FBP3基因和FBP6基因以及拟南芥SEP3基因具有很高的同源性,分别属DEF/GLO、AG-like和SEP-like亚家族。从而将这4个基因分别命名为EgDEF1、EgGLO1、EgPLE1和EgSEP3-1。推导的氨基酸序列显示,这些基因编码的蛋白质都包含高度保守的MADS结构域、I结构域和K结构域,每个基因均有其亚家族特异的C-末端功能域。基因特异性RT-PCR检测结果显示：EgDEF1在萼片、花瓣、雄蕊及胚珠中高丰度表达,在心皮中微量表达;而EgGLO1在花瓣和雄蕊中高丰度表达,在萼片中微量表达;在根、茎、叶等营养器官中均未检测到上述2个基因的表达。EgPLE1在雌蕊、心皮和胚珠中特异表达,但表达的丰度存在差异,在雄蕊中的表达有所减弱。SEP-like亚家族基因EgSEP3-1在四轮花器官和胚珠中均特异表达,且表达丰度相对一致。     

观赏羽衣甘蓝BoDFR基因的克隆及表达分析

为揭示羽衣甘蓝二氢黄酮醇4 还原酶 (DFR)基因调控花青素合成的功能,该研究对不同叶色羽衣甘蓝的叶片花青素含量进行测定,根据结球甘蓝DFR序列信息,利用 RT PCR 技术克隆羽衣甘蓝BoDFR基因并进行实时荧光定量表达分析。结果表明: BoDFR的cDNA全长为1 158 bp,编码385个氨基酸,其蛋白相对分子质量为42 925.06 Da,预测亚细胞定位为细胞质;蛋白质二级结构分析表明α 螺旋和无规则卷曲为DFR 蛋白的主要二级结构元件。序列比对显示 DFR 蛋白具有 NADPH 结合位点和底物结合位点,属于NADB Rossmann 超基因家族。系统进化分析表明,BoDFR与结球甘蓝(Brassica oleracea var. capitata)DFR亲缘关系最近。花青素含量测定显示,紫叶羽衣甘蓝叶片中花青素含量最高,粉叶羽衣甘蓝含量较高,而白叶羽衣甘蓝叶片中检测不到花青素。实时荧光定量 PCR 分析表明,BoDFR基因表达量与花青素含量高低一致,其中紫叶羽衣甘蓝叶片中BoDFR基因的表达量最高,而白叶羽衣甘蓝心叶中仅微量表达。     

基于转录组测序的羽衣甘蓝叶色相关基因分析

叶色是羽衣甘蓝重要的观赏性状之一。本研究采用Illumina Hi-Seq2500高通量测序技术,对基因型纯合的紫叶和白叶羽衣甘蓝叶片进行转录组测序,筛选差异基因并与GO和KEGG数据库比对进行注释分析,分析羽衣甘蓝叶色形成相关基因。结果显示,获得高质量短读序共104 608 770条,筛选出紫叶相对白叶的差异表达基因1 993个,其中上调表达基因1 094个,下调表达基因899个。根据GO功能分类可分为生物过程、细胞组分和分子功能3大类64功能组。根据KEGG代谢通路分析可以分为171类,在叶色相关的类黄酮生物合成途径中黄酮醇合成酶(FLS)、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)上调以及类胡萝卜素生物合成途径中的类胡萝卜素β-环化酶上调与紫叶形成关系密切。本研究丰富了羽衣甘蓝的转录组信息,获得了一些差异表达基因,为进一步研究羽衣甘蓝叶色形成的遗传机制提供了有价值的信息。     

甜荞FaesAP2基因的克隆与表达分析

本研究采用同源克隆和RACE技术,从甜荞（Fagopyrum esculentum Moench.）品种'西农9976'中分离出调控花器官发育的FaesAP2基因,该基因序列全长1668 bp,包含1个长为1374 bp的完整开放阅读框,共编码457个氨基酸。序列比对以及系统发育分析结果发现,FaesAP2蛋白拥有2个高度保守的AP2（APETALA2）结构域,在第1个AP2结构域前端有1段由10个氨基酸残基组成的高度保守的核定位信号区;系统发育分析显示其与拟南芥（Arabidopsis thaliana（L.） Heynh.） AP2转录因子的亲缘关系较近。基因表达模式分析表明,该基因在甜荞pin型和thrum型花的雄蕊和雌蕊中有明显的表达,但在幼叶和花被片中不表达,且其表达量在2种类型花不同发育时期呈现明显的变化,均在花药迅速膨大期达到最高值,因此推测该基因在甜荞花发育过程中可能参与了花器官发育的调控。     

几种影响羽衣甘蓝小孢子胚状体成苗的因素

羽衣甘蓝成熟小孢子胚转到固体培养基上可直接萌发成苗。成苗率与基因型、培养基成分和培养温度有关。MS+1.0%琼脂+3%蔗糖是适宜的成苗培养基;100MG·L-1活性炭对鱼雷形胚成苗起促进作用;10℃低温培养10D可提高成苗率。     

羽衣甘蓝种子主要品质性状的表现及其相关性

随机挑选148份羽衣甘蓝种质资源和高世代材料,分析了成熟种子的含油量、蛋白质、硫苷和7种主要脂肪酸成分的表现特征及其相关性。结果表明:羽衣甘蓝成熟种子平均含油量为29.48%,平均蛋白质含量为45.13%,含油量和蛋白质总量为74.61%。硫苷含量的变幅最大,变异系数为31.72%。7种主要脂肪酸成分中,油酸和芥酸的含量较高,其次为亚油酸,棕榈酸和硬脂酸的含量较低。除硫苷含量和硬脂酸含量外,其余9个性状的表现均呈单峰正态分布。相关性分析表明,大多数性状间都具有显著或极显著的相关性,这与对甘蓝型、白菜型和芥菜型3种类型油菜的研究结果相一致。在羽衣甘蓝中存在一些优异的种质资源,通过筛选可以在油菜优质育种中加以利用。     

羽衣甘蓝花粉母细胞减数分裂及雄配子体发育观察

采用常规压片法对羽衣甘蓝花粉母细胞减数分裂及雄配子体发育进行了细胞学观察,结果显示:羽衣甘蓝减数分裂类似甘蓝种,细胞质分裂为同时型,四分体以正四面体型或十字交叉型为主;终变期有9个二价体,此时可进行染色体计数;中期Ⅰ和Ⅱ少数细胞中可见赤道板外染色体,后期Ⅰ和Ⅱ存在落后染色体,四分体时期可观察到少量含微核的异常四分体;单核靠边期时花蕾长度约为2.0~2.2 mm,小孢子经过发育最终成为3-细胞型花粉并具3个萌发孔,成熟花粉中败育花粉比率为1.3%.     

激光、高压静电场克服羽衣甘蓝自交不亲和及其分子机制的研究

利用激光、高压静电场对自交不亲和的羽衣甘蓝的花粉进行处理,以期克服其自交不亲和。通过对处理后的花粉的表面结构和蛋白酶活性及其萌发情况的研究,进一步分析激光、高压静电场的生物效应。同时利用分子生物学手段Northern杂交技术,检测了经激光、高压静电场处理的花粉,在授粉后柱头上SLG和SRK基因表达的差异,以探讨激光、高压静电场对生殖反应作用的分子机制。结果表明:通过适宜剂量的激光、高压静电场处理,羽衣甘蓝的花粉萌发率提高,成熟花粉水溶性总蛋白,α-淀粉酶活力,总淀粉酶活力均不同程度的提高,同时自交亲和指数和结籽率提高。从花粉的表面结构的电镜显微观察分析,花粉壁的雕纹受到了伤害,网脊线有轻微断裂,网眼变大。授粉后,取不同时间间隔的柱头样品提取总RNA,利用Northern杂交技术检测SLG和SRK基因的表达量,授粉后24 h激光处理和高压静电场处理与对照比较,SLG和SRK基因的表达量均降低。     

羽衣甘蓝类蛋白质二硫键异构酶PDIL1-2的基因克隆及蛋白表达分析

以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var.acephala）自交不亲和系（S13-bS13-b）为试材,利用RT-PCR和RACE的方法从柱头中分离类蛋白质二硫键异构酶BoPDIL1-2基因。将BoPDIL1-2编码区的序列构建到原核表达载体pET-14b上,并转化到大肠杆菌中进行原核表达与纯化;用纯化后的蛋白免疫小鼠,制备BoPDIL1-2多克隆抗体;通过免疫印迹法检测BoPDIL1-2在不同组织及不同发育阶段柱头的表达情况。氨基酸序列比对分析结果显示,羽衣甘蓝BoPDIL1-2与油菜BnPDIL1-2、拟南芥AtPDIL1-2的一致性分别是97.3%和85.5%。SDS-PAGE结果显示,在分子量58 kD处有BoPDIL1-2蛋白特异性地诱导表达。免疫印迹结果显示BoPDIL1-2在羽衣甘蓝柱头中特异表达,而且在柱头发育早期表达量较低,在开花期柱头表达量较高。     

Comparative analysis of glucosinolate production in hairy roots of green and red kale (Brassica oleracea var. acephala)

Abstract

Glucosinolates (GSLs) are sulfur- and nitrogen-containing secondary metabolites that function in plant defense and provide benefits to human health. In this study, using Agrobacterium rhizogenes R1000, green and red kale hairy roots were established. The expression levels of GSLs biosynthesis genes and their accumulation in both kale hairy roots were analyzed by quantitative real-time PCR and HPLC. The results showed that the expression of most indolic GSLs biosynthesis genes was higher in the hairy roots of green kale than in that of red kale. In contrast, the expression of BoCYP83A1 and BoSUR1 encoding key enzymes aromatic GSL biosynthesis was significantly higher in red kale hairy root. The HPLC analysis identified six GSLs. The levels of 4-methoxyglucobrassicin, glucobrassicin, and 4-hydroxyglucobrassicin were 6.21, 5.98, and 2 times higher, respectively, in green kale than in red kale, whereas the levels of neoglucobrassicin and gluconasturtiin were 16.2 and 3.48 times higher, respectively, in red kale than in green kale. Our study provides insights into the underlying mechanisms of GSLs biosynthesis in kale hairy roots and can be potentially used as “biological factories” for producing bioactive substances such as GSLs.     

农杆菌介导的芥蓝遗传转化体系的建立

采用正交旋转设计方法对影响芥蓝遗传转化体系的因素进行了优化研究,结果表明:影响芥蓝KanR苗率的最主要因素是Kan浓度,而预培养时间和共培养时间是芥蓝遗传转化的主要影响因素。最利于芥蓝遗传转化的操作程序为:将芥蓝无菌苗下胚轴在预培养基上预培养2天后,在LBA4404菌液中感染8min,置于共培养培养基上培养2天,随后把外植体转入含Kan的选择分化培养基上诱导不定芽,28天转瓶一次,当抗性幼苗长至2～3cm时,齐愈伤组织处切下幼苗在生根培养基上诱导不定根,25天左右后等不定根长成即可开瓶炼苗,继而移栽至营养土中,正常管理至开花结果;经PCR、Southern印迹检测,证明CYP86MF基因已经整合至转基因植株染色体中。     

羽衣甘蓝的小孢子胚诱导和植株再生

以羽衣甘蓝10个品种的游离小孢子培养,研究其胚状体及其再生植株诱导方法的结果表明,琼脂糖和活性炭对诱导胚状体发生及发育有促进作用;改良MS培养基中添加0.01%的活性炭可促进植株再生;确定1/2MS NAA 0.1 mg·L-1是优化生根的培养基;小孢子再生植株成活率可达74.6%.     

羽衣甘蓝柱头酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

目的:构建应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝柱头cDNA文库。方法:以羽衣甘蓝S13-bS13-b自交不亲和系为材料,提取柱头的总RNA,用亲和层析法分离纯化mRNA,利用CytoTrapXR建库试剂盒构建羽衣甘蓝柱头cDNA文库。结果:羽衣甘蓝柱头cDNA原始文库的库容量为2.5×105;扩增后文库的库容量约为4×108,重组率为96%,插入片段大小为0.4～3kb,平均长度在0.8kb左右。结论:构建了应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝自交不亲和系柱头的cDNA文库,为探讨芸苔属植物自交不亲和的分子机理奠定了基础。     

Selection for resistance to clubroot (Plasmodiophora brassicae) in marrowstem kale (Brassica oleracea var. acephala L.)

Ninety-six cultivars of Brassica oleracea were screened for clubroot resistance in a seedling test using two populations of Plasmodiophora brassicae. The most resistant cultivars were kales. Sixteen resistant marrowstem kale cultivars of diverse geographical origin were used to start a selection programme for clubroot resistance. Four generations of selection, involving single plants, half-sib and full-sib families, reduced a disease index averaged over six clubroot populations from 41.2 to 12.5. This was lower than the most resistant cultivar in the original population, cv. Mixti 28.8, and as good as a German landrace of cabbage noted for its resistance, Bohmerwaldkohl 10.5. In comparison, the mean of five kale controls, cvs Bittern, Canson, Condor, Kestrel and Merlin, was 61.1 and the value for the most susceptible control, cabbage cv. Septa, was 89.3. In the final assessment, there were no clubroot population x B. oleracea genotype interactions and in the initial assessment of cultivars there were only small interactions which could be removed by an angular transformation of the data. It was concluded that a high level of non-differential resistance had been achieved and that it may prove durable. It was also concluded from a small field trial that this level of resistance would prevent serious yield losses in practice.