猪流行性腹泻病毒分子生物学特征

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是以水泻、呕吐和脱水为特征的一种急性病毒性腹泻.猪流行性腹泻现已成为世界范围内的猪病之一.猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是PED的致病因子,是导致类似猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis,TGE)临床症状的真正病原.迄今为止已发现PEDV与TGEV[1]、PEDV与PCV混合感染猪[2].已有用蛋黄IgY 预防PED效果的报道[3],还有用弱化的PEDV疫苗对仔猪进行免疫的报道[4],但都对其作用机制未作深入探讨.弄清PEDV的分子生物学特征,针对PED进行特异性免疫,必将对PED的诊断、治疗和综合防治产生深远影响.本文仅就PEDV的分子生物学特征作一综述.     

猪流行性腹泻病毒单克隆抗体及其抗原表位的研究进展

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PED virus,PEDV)引起的一种严重危害养猪生产的常见疫病。近年来,由于新的PEDV变异毒株的出现,许多国家的养猪业遭受了巨大的经济损失。PEDV也因此受到更多关注,关于PEDV的研究报道也日渐增多。基于国内外有关PEDV的最新研究进展,本文系统归纳和分析了PEDV结构蛋白和非结构蛋白单克隆抗体以及单克隆抗体识别的特异性抗原表位,以期为开发鉴别诊断方法和表位疫苗等提供信息。     

猪流行性腹泻病毒嵌套式RT-PCR检测方法的建立

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种以呕吐、腹泻和失水为特征的猪肠道传染病.各种年龄的猪都可发病[1],哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率最高可达100%,尤其哺乳仔猪的受害最严重.本病在欧洲许多国家均有报道.上海畜牧兽医研究所等单位证实,我国近年来发生的仔猪腹泻,有很多为PEDV引起.     

猪流行性腹泻病毒非结构蛋白nsp9互作宿主蛋白对病毒复制的影响

猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)导致仔猪和育肥猪发生急性肠道传染病，是危害养猪业最重要的病原体之一。目前发现PEDV能够编码至少16个非结构蛋白，其中nsp9能够结合至单链RNA中，但是其功能机制还不清楚。本研究通过免疫沉淀联合蛋白质谱分析，筛选出潜在的与PEDV nsp9宿主互作蛋白。通过进一步免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)和激光共聚焦技术确认了nsp9与热休克蛋白HSPA8、Toll相互作用蛋白Tollip、热休克蛋白HSPA9、线粒体外膜蛋白TOMM70互作。其中，过表达HSPA8使nsp9的表达量先上调而后下调，并促进PEDV的增殖；过表达Tollip使nsp9的表达量显著上调，并抑制PEDV的增殖；过表达TOMM70使nsp9的表达量显著下调，但对PEDV的增殖无明显影响；过表达HSPA9对nsp9的表达以及PEDV的增殖均无明显影响。该研究为探索nsp9互作蛋白在PEDV感染过程中的功能提供了重要信息。     

猪流行性腹泻病毒nsp1蛋白对Ⅰ型干扰素应答的影响

猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 能抑制宿主Ⅰ型干扰素及其诱导的细胞抗病毒免疫应答,但是PEDV抑制Ⅰ型干扰素应答的分子机制尚不明了,尤其是PEDV非结构蛋白 (Nonstructural proteins,nsps) 在Ⅰ型干扰素应答中的调控作用研究不多。为研究PEDV非结构蛋白1 (nsp1) 对细胞Ⅰ型干扰素应答的影响,构建了真核表达载体pCAGGS-nsp1,采用Western blotting和间接免疫荧光试验确定nsp1在细胞中的表达。通过报告基因法、ELISA以及病毒复制抑制试验评估nsp1对Ⅰ型IFN的影响。结果显示,nsp1在转染细胞和病毒感染细胞中均高效表达;双荧光报告基因试验结果表明,nsp1能显著抑制IFN-β启动子活性,且具有剂量依赖性。ELISA结果显示,nsp1能显著抑制IFN-β蛋白的表达。水泡性口炎病毒 (VSV) 复制抑制试验结果显示,nsp1明显抑制poly(I:C)介导的Ⅰ型IFN的抗病毒作用。结果提示,nsp1作为PEDV的保守蛋白,具有拮抗Ⅰ型干扰素启动子活性和应答的功能,为揭示PEDV逃逸宿主天然免疫应答的机制和研发新型高效抗PEDV疫苗奠定基础。     

ORF3蛋白促进猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上的增殖

【背景】猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪而引起的一种急性肠道传染病,常导致病猪水样腹泻、呕吐、脱水。自2010年起,其大规模的暴发给养猪业造成巨大的经济损失。由于对PEDV免疫机理及侵入机制知之甚少,至今仍缺乏有效的PED防治措施。【目的】研究orf3对PEDV体外增殖的影响。【方法】利用基于RNA同源重组的PEDV反向遗传学操作技术拯救一系列携带不同orf3基因及orf3基因缺失的重组PEDV;将获得的重组PEDV以MOI 0.1感染Vero细胞,分别于感染的第8、16、24、32、40、48 h测定其TCID_(50)并绘制病毒生长曲线;分别在感染25 h和36 h利用全自动细胞计数分析仪对6孔板内的细胞进行计数,并于感染后的第12、24、36、48 h用CCK-8试剂盒对其细胞活力进行测定。【结果】RT-PCR结果及细胞病变观察证明成功拯救到了携带不同orf3基因或orf3基因缺失的重组PEDV;进一步的免疫组化分析结果证实PEDV的ORF3蛋白可以在Vero细胞中合成。SPSS软件分析表明携带orf3基因的重组PEDV的滴度(TCID_(50))显著高于缺失orf3基因的重组PEDV的滴度;带有orf3基因的重组PEDV感染Vero细胞25 h和36 h时的活细胞数显著高于缺失orf3基因的重组病毒感染相同时间时的活细胞数;而且重组PEDV感染Vero细胞24 h后,带有orf3基因的重组PEDV的细胞活性显著高于缺失orf3基因的重组病毒。【结论】ORF3蛋白对于PEDV在Vero细胞中的增殖具有促进作用,该作用是通过延缓或减少感染细胞的死亡实现的。本研究为揭示PEDV orf3基因的功能和PEDV复制机制的研究提供理论基础。     

猪流行性腹泻病毒(PEDV)与抗病毒天然免疫

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起猪流行性腹泻病等肠道疾病的一种动物冠状病毒.PEDV与宿主系统相互作用,特别是其对宿主抗病毒天然免疫调节作用和机制是目前动物冠状病毒研究的基础科学问题之一.基于作者近几年来对人类重要冠状病毒对宿主抗病毒天然免疫系统调节作用的研究,本文对PEDV基因组与编码蛋白主要功能以及PEDV调节宿主抗病毒天然免疫反应及其可能机制的进展和现状进行了分析.与人类冠状病毒相似,PEDV编码的木瓜样蛋白酶(papain like protease,PLP)是一个多功能蛋白酶,除了蛋白酶活性外,还具有去泛素化酶(DUB)活性和宿主干扰素拮抗活性,是PEDV编码的一种新型病毒来源DUB和宿主干扰素拮抗蛋白.这些研究为阐明PEDV对宿主抗病毒天然免疫反应调节作用和其致病机制提供了重要的理论依据,为研制新型PEDV免疫防治措施提供了重要理论基础.     

猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白40–91 aa是其细胞质定位的关键结构域

ORF3蛋白是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)基因组编码的唯一的辅助蛋白,与病毒毒力相关。为确定PEDV ORF3细胞质定位信号,文中构建了系列PEDV DR13wt ORF3蛋白全长或截短肽重组表达载体,转染Vero细胞并利用激光共聚焦显微镜分析与EGFP融合表达的全长ORF3蛋白和其系列截短肽在细胞内的分布。结果表明,全长ORF3蛋白或所有包含2个跨膜域的40–91 aa基序的ORF3截短肽均只定位于细胞质中,而不包含40–91aa基序的ORF3截短肽分布于整个细胞中(细胞质和细胞核均有分布)。这表明40–91 aa是猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白细胞质定位的关键结构域。PEDVORF3蛋白细胞质定位结构域的明确为进一步研究其细胞内转运和生物学功能提供了参考。     

猪流行性腹泻病毒反向遗传操作技术及其应用

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪(特别是新生仔猪)急性、高度传染性消化道疾病的主要病原之一;2010年底以来,猪流行性腹泻(PED)的再次暴发给我国乃至全球养猪业造成了巨大经济损失。最近,研究者已先后建立了基于靶向RNA重组技术、细菌人工染色体(BAC)载体系统和体外连接技术的PEDV反向遗传学操作技术,为PEDV编码的蛋白质的功能、致病机制以及新型疫苗的研发开辟了新的思路。本文对PEDV反向遗传操作技术的研究进展及其在PEDV胰酶依赖性、S蛋白和ORF3蛋白的功能以及新一代疫苗研制等方面的应用现状进行了综述与展望。     

猪流行性腹泻病毒免疫及疫苗研制

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是严重危害我国和世界养猪业的重要动物疫病,其致病原为猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),属冠状病毒科α冠状病毒属。文中综述分为5个部分。前两部分在介绍该病病原及其流行病学的基础上先概括了初生仔猪的被动免疫途径和初乳的重要功效。第三部分总结了母猪孕期免疫的特点,讨论了"肠道-乳腺-sIgA轴"理论及其可能的作用机理,提出了一系列PEDV免疫防控中应重点关注的理论技术问题。最后两部分分别总结了PEDV疫苗的研发现状并对PEDV免疫防控的未来发展作了展望。     

猪流行性腹泻病毒与宿主抗病毒天然免疫抑制

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)能引起猪腹泻等肠道疾病,属于α属冠状病毒,它的爆发给很多国家养猪业造成了严重的经济损失。2010年以来,PEDV感染在中国出现大规模爆发,一种突变型PEDV也于2013年在美国出现并迅速传播。 RNA病毒能够通过Toll样受体通路3（TLR3）和RIG-I样受体通路（RLR）诱导I型干扰素的产生。但以往的研究表明,PEDV感染能抑制I型干扰素的合成。近年来有关PEDV调节宿主天然免疫应答的研究取得了很大进展。PEDV主要通过编码作为干扰素拮抗剂的病毒蛋白以及隐藏病毒自身病原相关分子模式（PAMP）等两种方式逃逸宿主天然免疫应答。目前已报道,PEDV非结构蛋白1可通过降解CBP阻碍干扰素调节因子3(IRF-3)组装成增强子复合体;木瓜蛋白酶样蛋白酶可通过其去泛素化酶活性阻断天然免疫信号通路传递;3C样蛋白酶可通过剪切NEMO发挥干扰素拮抗剂活性;核衣壳蛋白通过结合TBK1抑制I型干扰素产生。PEDV也可通过合成加帽酶隐藏其病原相关分子dsRNA来避免激活天然免疫通路。PEDV抗病毒天然免疫机制阐明为研究PEDV感染免疫和致病机制提供了重要的理论依据,为研发抗PEDV新型疫苗和药物提供了基础。     

猪流行性腹泻病毒逃逸宿主天然免疫的研究进展

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种肠道α冠状病毒,靶向猪小肠上皮细胞,使得小肠上皮组织被破坏,肠道充血,肿胀,引起猪群水样腹泻,导致育肥猪厌食和体型消瘦。其中哺乳仔猪死亡率高。2010年后,随着新的PEDV变异毒株出现,PED再一次在全球暴发,特别是亚洲国家,造成了严重的经济损失。机体的先天免疫并不能完全抵抗PEDV对机体的侵害,因此了解PEDV通过影响干扰素(Interferon,IFN)的产生来逃逸先天性免疫的途径十分必要,同时也为治疗PEDV感染以及研发PEDV疫苗提供了思路。     

猪流行性腹泻病毒经其附属蛋白抑制细胞凋亡

【背景】orf3位于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) s基因与e基因之间,是目前发现的PEDV唯一一个附属基因,编码附属蛋白(ORF3蛋白)。我们前期研究初步发现ORF3蛋白对PEDV诱导的细胞凋亡有影响。【目的】研究ORF3蛋白在PEDV侵染复制过程中的毒力作用机制。【方法】实验用3种PEDV:rDR13att-?ORF3 (orf3基因全部敲除)、DR13-ORF3att (携带有C端截短orf3)、rDR13att-ORF3wt(携带全长orf3基因)感染Vero细胞,观察病变情况,再用活细胞成像仪、流式细胞仪、 DNA断裂的原位末端标记法[terminaldeoxynucleotidyltransferase(TDT)-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL]等方法检测不同感染时间点的细胞凋亡情况,然后用蛋白质印迹方法分析PEDV感染宿主细胞中主要凋亡相关蛋白(如Caspase-3)的活化或裂解,最后进行转录组测序研究病毒感染细胞中差异基因的表达情况,再用荧光定量PCR验证转录组结果。【结果】rDR13att-?ORF3引起较多的细胞病变,活细胞成像仪的动态观察结果显示,3种病毒侵染的细胞凋亡水平随着时间的延长均高于正常阴性细胞,但敲除orf3的病毒感染细胞后细胞凋亡率比其他两种病毒更高;敲除orf3病毒感染细胞凋亡率显著高于其他两种病毒;病毒rDR13att-?ORF3感染细胞后TUNEL阳性细胞数比DR13-ORF3att和rDR13att-ORF3wt更多;表达ORF3蛋白的重组PEDV可以抑制Caspase-3的活化;ORF3蛋白对受感染细胞Heat shock 70 kD protein 1B (HSP70)基因转录有促进作用,荧光定量PCR结果表明rDR13att-ORF3wt感染细胞的HSP70表达量高于rDR13att-?ORF3感染细胞。【结论】PEDV通过ORF3蛋白抑制细胞凋亡,而且这种作用可能是通过抑制Caspase-3的活化或增加HSP70的产生来完成的。     

猪流行性腹泻病毒nsp1对Ⅰ型干扰素应答的影响

猪流行性腹泻病毒(PEDV)能抑制宿主Ⅰ型干扰素及其诱导的细胞抗病毒免疫应答,但是PEDV抑制Ⅰ型干扰素应答的分子机制尚不明了,尤其是PEDV非结构蛋白(Nonstructural proteins,nsps)在Ⅰ型干扰素应答中的调控作用研究不多。为研究PEDV非结构蛋白1(nsp1)对细胞Ⅰ型干扰素应答的影响,构建了真核表达载体p CAGGS-nsp1,采用Western blotting和间接免疫荧光试验确定nsp1在细胞中的表达。通过报告基因法、ELISA以及病毒复制抑制试验评估nsp1对Ⅰ型IFN的影响。结果显示,nsp1在转染细胞和病毒感染细胞中均高效表达。双荧光报告基因试验结果表明,nsp1能显著抑制IFN-β启动子活性,且具有剂量依赖性。ELISA结果显示,nsp1能显著抑制IFN-β蛋白的表达。水泡性口炎病毒(VSV)复制抑制试验结果显示,nsp1明显抑制poly(I:C)介导的Ⅰ型IFN的抗病毒作用。结果提示,nsp1作为PEDV的保守蛋白,具有拮抗Ⅰ型干扰素启动子活性和应答的功能,为揭示PEDV逃逸宿主天然免疫应答的机制和研发新型高效抗PEDV疫苗奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒功能性受体的鉴定

为研究猪氨基肽酶(Porcine Aminopeptidase N,pAPN)是否作为猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的细胞感染受体,通过转染技术,使PEDV非容许性细胞MDCK表达pAPN,并用PEDV感染转染细胞。结果发现转染的MDCK细胞可以感染PEDV,并且该病毒可以在转染细胞中连续传代。免疫荧光法鉴定存在病毒抗原。进一步实验证实,抗pAPN血清可以抑制PEDV感染转染的MDCK细胞。这些结果展示转染的MDCK细胞、pAPN表达及PEDV病毒复制之间存在直接联系,证明pAPN是PEDV的细胞感染受体之一。     

2010～2012年华中地区猪流行性腹泻病毒分子特征和遗传进化分析

2010年底开始,猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)在中国境内出现严重暴发。为探讨该病突然再次暴发的原因,对2010年10月至2012年6月于华中地区11个地市收集的12株猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus,PEDV)S、M和ORF3基因进行RT-PCR扩增、克隆及测序,并对其序列变化、遗传进化关系、抗原位点、糖基化位点和多肽极性进行分析。结果显示,12株PEDV流行毒株S、M和ORF3基因部分核苷酸及氨基酸的改变使其关键序列明显不同于以往毒株,其中有11株流行毒株的S基因比现用疫苗毒株CV777多9个核苷酸,而且在其S1区N′端存在大量的氨基酸突变。遗传进化分析显示,12株PEDV华中地区毒株与2007～2009年韩国毒株、2007～2008年泰国毒株、2009～2010年越南毒株、2011年日本毒株及2010～2012年中国其它地区流行毒株亲缘关系均较密切,而与欧洲株(CV 777、Br1/87)、中国现用疫苗株(CV777)及2003～2007年中国分离株(LJB/03、JS-2004-2、DX、QH、LZC)亲缘关系均较远。与现用疫苗株(CV777)相比,流行毒株S蛋白的抗原位点、糖基化位点和跨膜螺旋均有明显改变,提示PEDV在近年呈现快速变异和进化的趋势,因而可能需要选择更有效的疫苗株来控制PEDV的暴发。     

与猪流行性腹泻病毒M蛋白互作的宿主蛋白的鉴定

【背景】猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)膜蛋白(M)在病毒粒子的组装、膜融合和病毒复制等方面具有重要的作用,但M蛋白与宿主细胞的互作机制尚不清楚。【目的】利用免疫沉淀技术和液质联用技术筛选细胞内与PEDVM蛋白相互作用的蛋白,为揭示M蛋白在病毒增殖过程中发挥的功能提供研究基础。【方法】将MOI=0.1的PEDV DR13疫苗株接种于长成单层的Vero细胞,感染36 h后,收集细胞并进行裂解。利用抗M的单克隆抗体沉淀与M相互作用蛋白复合物,通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行鉴定并利用细胞功能富集分析(Gene ontology,GO)对感染组鉴定到的细胞蛋白进行分析,确定两个细胞内源性蛋白为候选蛋白,进行免疫共沉淀(Co-IP)验证和共定位分析。【结果】基于鉴定蛋白的肽段数的方法分析显示,感染组与对照组相比,鉴定了218个与M蛋白相互作用的细胞内源性蛋白,分别与蛋白质合成、代谢、细胞信号通路转导等密切相关,选择细胞分裂周期蛋白42 (Cell division cycle 42,CDC42)、真核翻译起始因子3亚基L蛋白(eIF3L)为候选蛋白进行Co-IP(Co-immunoprecipitation)验证和共定位分析,结果证实CDC42、eIF3L蛋白分别与M蛋白在细胞内存在相互作用。【结论】鉴定出PEDV M蛋白能够与宿主细胞CDC42和eIF3L蛋白相互作用,并鉴定出其他可能与M蛋白发生相互作用的宿主蛋白60个,为开展PEDV与宿主细胞蛋白相互作用研究提供了重要理论依据。     

猪流行性腹泻病毒S基因片段的克隆及原核表达

为研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus PEDV)S基因片段的原核表达产物是否具有抗原性,分析S基因抗原位点后,用PCR技术扩增S蛋白主要抗原区的核酸序列,经克隆后将目的片段连接到原核表达载体pET-28a(+)中,成功构建了重组质粒pET-28a-PEDV-Sp,其重组菌于37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导表达4 h后进行SDS-PAGE分析,在分子质量约为29 kDa处出现一新蛋白带,与预期相符。质谱鉴定表明,已成功表达了目的蛋白。纯化后的重组蛋白免疫兔制备多克隆抗体,抗体效价检测结果显示该蛋白具有良好的抗原性。该研究为猪流行性腹泻基因工程疫苗的研制奠定基础。     

HMCES蛋白促进猪流行性腹泻病毒在Vero细胞中的复制

【目的】鉴定能够调控猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)复制的关键宿主蛋白。【方法】利用LC-MS/MS技术结合串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)，分析PEDV感染Vero细胞36 h后和未感染组的蛋白组学差异。鉴定筛选了114个显著差异表达蛋白，其中宿主胚胎干细胞特异性5-羟甲基胞嘧啶结合蛋白(5-hydroxymethylcytosine binding,ES cell-specific protein,HMCES)显著上调。进一步构建HMCES真核表达质粒，通过蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR检测过表达HMCES对PEDV复制的影响；合成针对HMCES基因的特异性si RNA，利用Western blotting和RT-q PCR检测si RNA对HMCES表达的干扰效果及HMCES被干扰后对PEDV复制的影响。【结果】过表达HMCES能显著促进PEDV在Vero细胞中复制，并且复制水平随着HMCES的剂量递增呈现剂量依赖式增加；si RNA-341下调内源性HMCES表达进而抑制PEDV复制。【结论】H...     

PEDV S蛋白B细胞抗原表位的筛选和鉴定

以猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S基因的免疫优势区S1(1～2367bp)为靶基因,利用基于gⅢ表达外源多肽的fd丝状噬菌体展示系统,构建S1基因噬菌体展示肽库,以纯化病毒制备的兔抗PEDV多克隆血清为靶蛋白,对S1基因噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选,结果获得3个高亲和力的序列,分别命名为S1P1(248～280位氨基酸)、S1P2(442～499位氨基酸)和S1P3(697～742位氨基酸).ELISA和蛋白质印迹结果显示,S1P1、S1P2和S1P3短肽都能被兔抗PEDV多克隆血清识别,其中S1P3反应性最强.为了进一步揭示S1P1、S1P2和S1P3短肽的抗原性,制备了3个短肽GST融合蛋白和它们串连后GST融合蛋白的单因子血清,间接免疫荧光试验(IFA)结果证实,抗S1P2-GST、S1P3-GST和S1P123-GST融合蛋白的单因子血清能够识别Vero细胞培养物中天然的PEDV.