敲除trim47基因斑马鱼脑和脾的比较转录组学分析

用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼(Danio Rerio)的trim47, 收集TRIM47–/–(trim47基因敲除)和WT(野生型)斑马鱼的大脑和脾脏进行RNA-seq分析, 以鉴定差异表达基因(DEGs)。总共确定了271个DEGs, 经过简要分析, 将这些DEGs注释为KEGG途径和GO富集分析, 与WT组相比, TRIM47-/-组的脑中DEGs集中在细胞黏附和谷氨酸能突触信号传导途径中。在脾脏中, 与野生型组相比, TRIM47-/-组的DEGs在补体和凝血级联信号通路中发生了变化。使用qRT-PCR验证了脑和脾中与补体途径相关的基因, 与转录组数据一致。这些结果表明, Trim47在脾脏和大脑中起着重要的生物学作用, 尤其是通过补体途径参与先天免疫功能。体内感染实验表明, trim47基因敲除可提高斑马鱼中鲤春病毒血症病毒(SVCV)的感染率。总之, 这些发现为TRIM成员在先天免疫中的功能提供了新线索。     

胸腺上皮细胞特异性敲除GSK-3β基因小鼠模型的鉴定及免疫学特征观察

目的 构建并鉴定胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells, TECs)特异性敲除GSK-3β基因小鼠模型,评价其免疫学特征。方法 采用小鼠胚胎干细胞(ES细胞,embryonic stem cells)打靶基因敲除技术,得到F0代的GSK-3β^flox/flox(GSK-3β^f/f)小鼠;再采用Cre-LoxP系统进行小鼠的繁殖;PCR鉴定,筛选出基因型为GSK-3β^f/fFoxN1-Cre^+/-(GSK-3β^-/-)小鼠,即为在TECs特异性敲除GSK-3β基因的小鼠。观察基因敲除鼠的一般生物学特征、繁殖能力和子代存活率。应用HE染色、流式细胞术及免疫荧光技术,比较基因敲除鼠和野生型小鼠免疫器官结构、胸腺、脾及外周血中免疫细胞比例及增殖能力差异。结果 成功构建TECs特异性敲除GSK-3β基因小鼠模型。与野生型(wild type, WT)小鼠相比,GSK-3β^-/-小鼠一般生物学特征无明显差异,子代存活率> 90%;衰老进程中...     

基于CRSIPR/Cas9技术构建凝血因子8基因敲除小鼠模型及表型验证

基于CRISPR/Cas9技术构建凝血因子8(F8)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。针对F8基因外显子1非编码区和外显子26下游序列设计sgRNA靶位点,体外转录获得sgRNA,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F₀代阳性敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得F8基因敲除纯合子小鼠(F8^-/-小鼠);通过逆转录PCR(RT-PCR)检测主要组织中F8基因在mRNA水平的表达情况,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血浆中F8基因在蛋白水平的表达情况;通过活化部分凝血活酶时间检测(APTT)和纤维蛋白原含量(FIB)测定实验检测F8基因敲除后小鼠凝血功能情况。PCR及测序结果表明F8基因在小鼠基因组中被成功敲除;RT-PCR 和ELISA检测结果显示,F8^-/-小鼠中F8在mRNA和蛋白水平上表达均显著低于野生型小鼠(WT小鼠)(P<0.000 1,P<0.01);APTT、FIB和滴血实验检测结果显示,F8^-/-小鼠血浆凝固时间显著高于WT小鼠(P<0....     

利用CRISPR/Cas9系统构建FGF21基因敲除小鼠模型

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)是细胞间的多功能信号分子,调节生物体的多种生理功能。FGF21作为一种重要的调控因子,对毛囊发育及生长周期具有重要作用。为研究FGF21基因对毛囊发育及生长周期的影响及作用机制,本研究通过构建靶向敲除FGF21基因的载体,体外将Cas9 mRNA和gRNA显微注射到FVB小鼠受精卵中,在小鼠FGF21基因的第1外显子上造成移码突变,从而获得FGF21基因敲除(knock out, KO)小鼠。通过测序鉴定F₀代小鼠基因型,共获得3只FGF21等位基因敲除小鼠(Fgf21 ^-/-);qRT-PCR和Western blotting结果表明,在Fgf21 ^-/-小鼠中未检测到FGF21 mRNA表达和FGF21蛋白表达;经脱毛再生及皮肤组织H&E染色发现,与野生型(wild type, WT)小鼠相比,Fgf21 ^-/-小鼠体重降低、器官组织未出现异常变化、毛发生长速度减慢、毛囊的直径和毛发的密度均减小。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了Fgf21 ^-/-小鼠模型,为后续研究FGF21基因在毛囊发育及生长周期中的功能提供了更好的动物模型。     

斑马鱼中kdm4aa基因对低温耐受能力的影响

为了研究赖氨酸特异性去甲基化酶4aa(lysine demethylase 4aa, kdm4aa)在斑马鱼(Danio rerio)低温耐受能力中的作用,本研究通过实时定量PCR检测kdm4aa^-/-斑马鱼中kdm4其他家族成员的表达水平和低温处理后野生型(wild type, WT)斑马鱼中kdm4aa基因的表达水平;通过斑马鱼行为轨迹跟踪系统检测低温下kdm4aa^-/-幼鱼的运动能力;采用逐级降温方法检测kdm4aa^-/-斑马鱼低温耐受能力;通过DCFH-DA荧光探针、 ATP检测试剂盒、 Western blot检测低温下kdm4aa^-/-斑马鱼中活性氧(reactive oxygen species, ROS)、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)、磷酸化组蛋白H2A.X(gamma histone H2A.X,γH2A.X)和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)水平。...     

Toll样受体4(TLR4)基因剔除小鼠构建及初步表型分析

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建Toll样受体4(TLR4)基因敲除小鼠模型,并观察突变小鼠对革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)刺激响应的变化。方法 针对TLR4基因外显子2设计并合成1对sgRNA片段,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法,建立TLR4基因敲除小鼠,通过繁育获得基因敲除纯合子小鼠(TLR4^-/-小鼠);通过LPS刺激,分析TLR4^-/-小鼠对炎症应激的反应情况,并在分子和病理水平上和野生型对照(WT)进行比较。结果 PCR及测序检测表明TLR4基因外显子2在小鼠基因中被成功敲除;给予LPS刺激后,IL1β、IL6、MyD88、iNOS及TNFa等炎症因子的表达在野生型小鼠的心、肝和肺组织中显著上调,而在TLR4^-/-小鼠中则几乎没有变化;血生化指标显示LPS刺激后WT小鼠血清中的尿素(Urea)和肌酐(Cre)水平显著升高,而TLR4^-/-小鼠刺激前后无显著变化,病理分析同样发现TLR4^-/-小鼠能够抵抗LPS对肾组织的损伤。结论 利用CRISPR/Cas9技术成功构建了TLR4基因剔除小鼠模型,TLR4的缺失能够降低IL1β、IL6、MyD88、iNOS及TNFa炎症因子对LPS刺激的响应,抑制LPS引起的炎症反应及对组织的损伤。     

含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-1)对猪伪狂犬病毒复制的影响

猪伪狂犬病是伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种烈性接触性传染病,其感染宿主会触发机体先天免疫应答,引起I型干扰素(Type I interferon,IFN-1)和炎性细胞因子等细胞因子的产生,为研究可诱导产生炎性细胞因子的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase 1,caspase-1)的基因敲除对PRV复制的影响,本试验利用近年来发展迅速的一项规律性短重复回文序列簇/Cas9核酸酶(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated system 9,CRISPR/Cas9)基因定点修饰技术构建猪肾上皮细胞(Porcine kidney epithelial cells,PK15)caspase-1基因稳定敲除细胞系,并通过T7核酸酶检测敲除效率;细胞毒性(Cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒检测PK15敲除caspase-1增殖影响;采用流式细胞术检测PRV-GFP感染PK15以及PK15-caspase-1^-/-的增殖差异;实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)检测PRV-gB、TK及白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IFN-β、干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes 20,ISG20)mRNA的表达;Western Blot检测PRV-gB蛋白表达;滴度测定检测子代病毒滴度。结果表明,2对特异性单链引导RNA(Single guide RNA,sgRNA)均能对caspase-1进行基因编辑,但经T7核酸酶酶切进行基因编辑效率分析结果表明sgRNA2的基因编辑效率较高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明caspase-1基因敲除对PK15以及PK15-caspase-1^-/-细胞活力无影响(P>0.05);流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-caspase-1^-/-中的增殖显著低于PK15细胞(P<0.05);定量RT-PCR结果表明PRV-gB、TK基因在PK15-caspase-1^-/-的mRNA表达显著低于PK15细胞(gB:P<0.05,TK:P<0.05),而IFN-β、ISG20基因在PK15-caspase-1^-/-的mRNA表达显著高于PK15细胞(gB:P<0.05,TK:P<0.05);Western Blot结果表明,PRV的gB蛋白在PK15-caspase-1^-/-的表达显著低于PK15细胞(P<0.05);滴度测定结果表明,敲除caspase-1能够抑制PRV子代病毒的增殖。以上结果均表明caspase-1基因敲除可抑制PRV在PK15细胞中复制。     

Synaptotagmin 1基因敲除对小鼠行为的影响*

目的: 研究Synaptotagmin 1基因敲除(Syt1^+/-)对小鼠情绪行为的影响并初步探讨其可能机制。方法: 选取8周龄雄性Syt1^+/-小鼠及同窝野生型(WT)小鼠各5只,采用免疫荧光染色方法观察小鼠前额叶皮层、海马、杏仁核、伏隔核、纹状体和腹侧被盖区等6个脑区中Syt1的表达;选用8周龄雄性Syt1^+/-小鼠9只,以及WT小鼠10只为对照,通过旷场实验、高架十字迷宫实验和强迫游泳实验检测比较成年Syt1^+/-小鼠和WT小鼠的焦虑样行为;另选用8周龄雄性Syt1^+/-小鼠及WT小鼠各5只,检测小鼠前额叶皮层、海马和杏仁核的谷氨酸含量。结果: 与WT小鼠相比,Syt1^+/-小鼠在前额叶皮层、海马、杏仁核、伏隔核、纹状体和腹侧被盖区Syt1阳性细胞数目显著减少(P＜0.01);Syt1^+/-小鼠在旷场中总移动距离显著减少(P＜0.01),并更偏爱在外周区域活动(P＜0.01),对中心区域的探索欲望显著下降(P＜0.01);Syt1^+/-小鼠更偏好待在封闭安全环境中(P＜0.01),开臂探索次数(P＜0.05)和在其中运动的时间显著减少(P＜0.01);Syt1^+/-小鼠在强迫游泳实验中不动时间明显增加(P＜0.01);同时,Syt1^+/-小鼠杏仁核中谷氨酸的含量显著增加(P＜0.01)。结论: Syt1基因敲除可以引起小鼠显著的焦虑样行为,推测与杏仁核中谷氨酸含量增加有关。     

生酮饮食通过上调肝脏和棕色脂肪组织PPARα提高小鼠耐低温能力

本文旨在探究短期生酮饮食对小鼠耐低温能力的影响及过氧化物酶体增殖物激活受体α (peroxisome proliferatoractivated receptor α, PPARα)在其中的作用及机制。将C57BL/6J小鼠分为正常饮食(WT+ND)组与生酮饮食(WT+KD)组,室温下分别用正常或生酮饮食饲料喂养2 d后,将其置于4°C环境中12 h,检测小鼠在低温条件下核心温度、血糖、血压的变化,并用Western blot检测PPARα和线粒体解偶联蛋白1 (uncoupling protein 1, UCP1)蛋白表达水平。将PPARα敲除小鼠分为正常饮食(PPARα^-/-+ND)组与生酮饮食(PPARα^-/-+KD)组,室温下分别用正常或生酮饮食饲料喂养2 d后,将其置于4°C环境中12 h,同样进行上述指标检测。结果显示,在室温下,与WT+ND组相比,WT+KD组小鼠肝脏及棕色脂肪组织中PPARα和UCP1蛋白水平均显著上调。在低温条件下,与WT+ND相比,WT+KD组小鼠核心温度及血糖升高,平均动脉压降低;生酮饮食可上调WT+KD...     

甲基转移酶set9缺失的斑马鱼低氧耐受能力增强

为了研究鱼类的甲基转移酶set9 [SET domain containing (lysine methyltransferase) 9,也称作set7/setd7]在低氧耐受中的功能,以斑马鱼(Danio rerio)作为模式生物,利用CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9)基因编辑技术,在斑马鱼set9基因的第一个外显子上设计了Cas9的靶位点,对其进行基因敲除,获得了缺失8个碱基的set9基因敲除的斑马鱼品系。对受精后3d的斑马鱼幼鱼和3月龄的斑马鱼成鱼进行低氧胁迫处理,比较了野生型及set9基因敲除的斑马鱼的低氧耐受能力;并对低氧胁迫处理后的3月龄的野生型及set9基因敲除的斑马鱼成鱼的脑组织取材、固定并进行TUNEL染色。结果显示:set9基因敲除的斑马鱼与野生型相比,其低氧耐受能力显著增强,脑组织中的细胞凋亡水平显著减少。研究为进一步揭示鱼类甲基转移酶set9在低氧耐受中的功能和分子机制提供了线索,并为培育耐低氧鱼类新...     

绝经后脂质代谢紊乱诱导小鼠抑郁症状的形成

目的 初步探讨绝经后脂质代谢紊乱是否参与抑郁症状的形成。方法 24只LDLR^-/-和16只WT C57BL/6J雌鼠，分为5组(n=8),分别为：WT+普通饮食组(WT)、WT+高脂饮食组(WT-H)、LDLR^-/-去卵巢+普通饮食组(LDLR^-/-)、LDLR^-/-去卵巢+高脂饮食组(LDLR^-/--H)、LDLR^-/-去卵巢+高脂饮食+辛伐他汀组(XF),连续喂养3个月。LDLR^-/-雌鼠双侧卵巢摘除联合高脂饮食建立绝经后脂质代谢紊乱模型。检测小鼠体重、脑总胆固醇(TC)及海马ERα、ERβ水平、抑郁行为、脑内5-HT水平；对脑TC水平和抑郁相关指标进行相关性分析。结果 (1)LDLR^-/--H组可复制绝经后脂质代谢紊乱特征，表现为小鼠体重显著增加、脑TC水平显著升高、海马ERβ表达明显下降；(2)LDLR^-/--H组小鼠水平和垂直运动均显著降低，TST静止时间显著增加，脑5-HT水平显...     

BbRho5对球孢白僵菌生长速率的作用研究

为阐明BbRho5对球孢白僵菌生防潜能的作用,构建了Bbrho5单基因敲除菌株ΔBbrho5,以野生型菌株WT作为对照,在不同培养基上测定菌落生长速率,并测定了菌株对多菌灵胁迫耐受性及对大蜡螟幼虫体壁侵染能力。进一步获取和分析了ΔBbrho5和WT细胞内基因转录组数据。结果表明,BbRho5蛋白功能缺陷显著抑制球孢白僵菌菌丝生长速率,同时微弱影响其多菌灵胁迫抗逆性及生防能力。相较于WT,ΔBbrho5中具有770个差异表达基因(DEGs),其中上调基因395个,下调基因375个。GO分析显示,ΔBbrho5 VS WT中DEGs主要富集于氧化还原酶活力(oxidoreductase activity)和单加氧酶活力(monooxygenase activity)功能。KEGG通路富集结果显示,DEGs主要富集于氮代谢及多种氨基酸代谢通路。在氮代谢通路中富集到7个功能基因,其中有5个上调,2个下调,说明敲除菌株可能采用增强氮源利用及谷氨酸合成以应对Bbrho5缺陷引起的生长迟缓。以上研究结果揭示了球孢白僵菌中小GTP酶BbRho5对球孢白僵菌生长速率具有重要影响,且氮代谢和氨基酸代谢可能为其重要的响应代谢通路。     

Ash2l-1/Ash2l-2在小鼠胚胎干细胞中的表达特异性及互补效应

H3K4me3是一种重要的表观遗传修饰,主要由MLL(mixed lineage leukemia)甲基转移酶复合体催化,对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)自我更新能力的维持具有重要作用。ASH2L是MLL复合体中一个重要的核心亚单位,参与调控mESCs中染色质的开放状态。ASH2L在mESCs中有2个异构体：ASH2L-1(80 kDa)和ASH2L-2(65 kDa),且以ASH2L-2的表达为主;而在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)中,只有ASH2L-1表达。目前,Ash2l-1和Ash2l-2在mESCs中的作用尚不清楚。本文利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,建立了Ash2l-1 ^-/-和Ash2l-2 ^-/-mESCs。通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色和qRT-PCR发现,Ash2l-1 ^-/-和Ash2l-2 ^-/-mESCs在碱性磷酸酶、多能性调控转录因子(Oct4、Nanog、Sox2和Klf4)的表达与野生型对照无显著差异。通过拟胚体分化实验,发现Ash2l-1 ^-/-mESCs诱导的拟胚体在Snai2(外胚层标记基因)和Gata4(内胚层标记基因)的表达上显著低于野生型mESCs诱导的拟胚体(P<0.01)。通过Western blotting,发现Ash2l-1 ^-/-mESCs中ASH2L-2的表达显著上调(P<0.01),Ash2l-2 ^-/-mESCs中ASH2L-1的表达显著上调(P<0.01),而Ash2l-1 ^-/-和Ash2l-2 ^-/-mESCs中,基因组H3K4me3的表达与野生型对照并无显著差异。这表明Ash2l-1和Ash2l-2之间存在补偿效应。利用JASPAR和KEGG预测分析发现,Ash2l-1和Ash2l-2启动子区分别具有3个和16个潜在的多能性转录因子结合位点,这些转录因子可能介导实现Ash2l-1和Ash2l-2之间的补偿效应。以上结果表明,Ash2l-1和Ash2l-2之间的补偿效应可能参与mESCs多能性的维持和基因组H3K4me3的调控。     

BbRho5对球孢白僵菌生长速率的作用研究

为阐明BbRho5对球孢白僵菌生防潜能的作用,构建了Bbrho5单基因敲除菌株ΔBbrho5,以野生型菌株WT作为对照,在不同培养基上测定菌落生长速率,并测定了菌株对多菌灵胁迫耐受性及对大蜡螟幼虫体壁侵染能力。进一步获取和分析了ΔBbrho5和WT细胞内基因转录组数据。结果表明,BbRho5蛋白功能缺陷显著抑制球孢白僵菌菌丝生长速率,同时微弱影响其多菌灵胁迫抗逆性及生防能力。相较于WT,ΔBbrho5中具有770个差异表达基因(DEGs),其中上调基因395个,下调基因375个。GO分析显示,ΔBbrho5 VS WT中DEGs主要富集于氧化还原酶活力(oxidoreductase activity)和单加氧酶活力(monooxygenase activity)功能。KEGG通路富集结果显示,DEGs主要富集于氮代谢及多种氨基酸代谢通路。在氮代谢通路中富集到7个功能基因,其中有5个上调,2个下调,说明敲除菌株可能采用增强氮源利用及谷氨酸合成以应对Bbrho5缺陷引起的生长迟缓。以上研究结果揭示了球孢白僵菌中小GTP酶BbRho5对球孢白僵菌生长速率具有重要影响,且氮代谢和氨基酸代谢可能为其重要的响应代谢通路。     

Chemerin敲除在有氧运动改善高脂喂养小鼠非酒精性脂肪肝中的作用及机制

该文利用两种chemerin敲除小鼠研究脂肪因子chemerin在基础和运动状态对高脂喂养小鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)的影响及其机制。通过cre-loxp系统构建脂肪chemerin敲除adipochemerin^–/–小鼠和全身性chemerin敲除chemerin^–/–小鼠。将雄性野生型(WT)、adipo-chemerin^–/–和chemerin^–/–小鼠进行12周饮食干预,分为普通饮食(ND)和高脂饮食(HFD)组。此外,将高脂喂养6周的上述三组小鼠进行6周中等强度的跑台运动干预,即WT+E、adipo-chemerin^–/–+E和chemerin^–/–+E组。检测小鼠体质量、肝质量,血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量、血脂四项、肝组织病理学形态,以及多个肝脏的脂肪代谢调控蛋白和关键酶的蛋白水平。结果显示,(1)与ND相比,HFD的WT小鼠肝质量增加,血脂异常,血清ALT、AST含量升高,肝脏出现大、黄、油特征,表现出NAFLD表...     

利用CRISPR/Cas9技术构建流感病毒高产细胞系MDCK-Tpl2-/-

Tpl2是调节I型(IFNα/β)和II型(IFNγ) IFN的关键调控因子,对病毒感染期间产生有效免疫应答至关重要。为了建立支持流感病毒高效繁殖的新型MDCK细胞系,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tpl2基因敲除的MDCK细胞,绘制其细胞生长曲线;根据《中国药典》第三部,对细胞进行形态检查、内外源因子和致瘤性检测;流感病毒接种细胞(MOI=0. 1),测定12h、24h、48h、72h细胞培养上清的血凝滴度及72h TCID50滴度。结果:靶基因组测序结果显示,获得一株稳定敲除Tpl2的MDCK细胞(MDCK-Tpl2^-/-);其与亲本细胞生长速率无显著差异,均为贴壁、上皮样细胞形态;细胞内细菌、真菌、支原体、病毒及致瘤性检测均为阴性;病毒接种后12h、24h、48h、72h,MDCK-Tpl2^-/-细胞培养上清的血凝效价提高了1. 78～2. 5倍。病毒接种后72h,MDCK-Tpl2^-/-细胞培养上清病毒的TCID50滴度提高了2. 8倍。结果表明,利用Tpl2缺陷型MDCK细胞系可以提高流感病毒产量,为提升疫苗质量奠定基础。     

六周有氧运动改善动脉粥样硬化小鼠骨骼肌氧化损伤和促进肌肉因子生成

动脉粥样硬化累及外周动脉能引起骨骼肌病变，其中氧化损伤是骨骼肌病变的重要表现，并且动脉粥样硬化也会减少有益肌肉因子的生成分泌。肌肉因子鸢尾素(irisin)、肌肉素(musclin)和BAIBA被认为参与改善动脉粥样硬化。然而，目前尚不明确动脉粥样硬化诱导骨骼肌病变的分子机制，以及有氧运动训练对其骨骼肌氧化损伤和肌肉因子生成的影响。本研究采用高脂饮食(HFD)喂食载脂蛋白E基因敲除(ApoE^-/-)小鼠12周，以建立动脉粥样硬化模型，然后观察动脉粥样硬化小鼠骨骼肌中的氧化损伤、Nrf2抗氧化信号通路以及肌肉因子鸢尾素、musclin和BAIBA生成的变化，并通过6周有氧运动观察对动脉粥样硬化小鼠骨骼肌氧化损伤的改善作用，以及鸢尾素、肌肉素和BAIBA生成的影响。ApoE^-/-小鼠在HFD喂养12周时，采用多普勒超声评估动脉粥样硬化病变，与标准饮食喂养的野生型(WT)小鼠相比，ApoE^-/-小鼠主动脉内-中膜厚度(P<0.01)、峰值血流速度(P<0.05)和阻力指数(P<0.05)显著增加，血浆甘油三酯...     

Caspase-1/-11通过剪切GSDMD参与LPS诱导的脓毒症急性肾损伤

肾小管上皮细胞死亡是急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)的重要原因。本文旨在研究由Gasdermin D (GSDMD)介导的细胞焦亡是否参与脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的脓毒症AKI，并探讨caspase-1、caspase-11焦亡通路在其中的作用。将小鼠分为4组：野生型(WT)组、野生型-LPS (WT-LPS)组、GSDMD基因敲除型(KO)组和GSDMD基因敲除型-LPS (KOLPS)组，通过腹腔注射LPS (40 mg/kg)构建脓毒症AKI模型，取血液样品测定血清肌酐、尿素氮的浓度；取小鼠肾组织标本进行HE染色，观察肾组织病理学变化；用Western blot检测焦亡通路相关蛋白的表达量。结果显示，与WT组相比，WT-LPS组血清肌酐、尿素氮的浓度明显升高(P <0.01)；与WT-LPS组相比，KO-LPS组血清肌酐和尿素氮显著降低(P <0.01)。HE染色结果显示，GSDMD敲除后LPS诱导的肾小管扩张得到缓解。和WT组相比，WT-LPS组白介素1β (interleukin-1β, IL-1β...     

CRISPR/Cas9编辑绒山羊FGF5基因细胞株的建立

拟利用CRISPR/Cas9技术建立编辑FGF5基因的绒山羊细胞株。在FGF5基因的第一外显子设计靶点并合成gRNA靶点引物,构建2个编辑FGF5基因的Cas/gRNA真核表达质粒载体。电穿孔法转染绒山羊成纤维细胞后T7核酸内切酶（T7E1）检测载体活性,选择活性最高的载体转染细胞,单细胞接种并扩繁,提取基因组DNA,PCR及测序鉴定。经测序分析共获得20个FGF5基因敲除细胞株（包括FGF5^+/-和FGF5^-/-）,总突变率为14.81%。双敲除突变细胞株可作为供体细胞进行重构胚构建,为创造高产绒性状的FGF5基因编辑绒山羊奠定基础。     

利用SSH方法筛选与鉴定AC3基因缺失小鼠主要嗅觉表皮内的差异表达基因

腺苷酸环化酶3(Adenylate cyclase 3, AC3)基因在小鼠主要嗅觉表皮(Main olfactory epithelium, MOE)内的嗅觉信号传导中起着重要作用, AC3缺失是否会导致MOE内与之相关的基因发生差异表达, 尚待确定。文章利用抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization, SSH)方法, 以AC3敲除(AC3^-/-)及其同窝出生的野生型(AC3^+/+)小鼠MOE为材料, 构建了正向和反向两个消减文库, 采用斑点杂交对消减文库进行初步筛选, 对筛选出的差异表达基因进行序列测定及生物信息学分析, 并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对其进行验证。斑点杂交筛选获得了386个差异表达克隆, 随机选取其中的80个进行DNA序列测定, 经序列比对后发现有62个在GenBank上获得了与之相匹配的基因信息, 其中24个上调差异表达克隆对应于kcnk3、mapk7、megf11等基因, 38个下调差异表达克隆对应于tmem88b、c-mip、skp1a、mlycd等基因。利用Gene Ontology(GO)方法对这些差异表达基因进行蛋白功能注释, 发现它们主要集中在分子结合、细胞周期、生物和细胞过程等功能方面。选取其中上调基因kcnk3和下调基因c-mip、mlycd、tmem88b及trappc5进行qRT-PCR验证。结果表明, 在AC3^-/-小鼠MOE内kcnk3的表达量显著上调, 是对照组小鼠的1.27倍, 而c-mip、mlycd、tmem88b和trappc5的表达量显著下调, 为对照组小鼠的20%、7%、32%和29%。这些基因的功能与K⁺通道、细胞发育与分化、脂肪代谢和膜蛋白转运等密切相关。推测它们可能与AC3基因共同作用, 调节小鼠MOE内的嗅觉信号传导信息。