扩增大段靶DNA的PCR方法

扩增大段靶ＤＮＡ的ＰＣＲ方法陈尚武,王章（中山大学生命科学学院,广州）ＰＣＲ和分子克隆是扩增遗传物质的常用技术。热稳定Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡ聚合酶的应用以及ＰＣＲ技术所固有的迅速、简便、廉价等优点,使ＤＮＡ片段的ＰＣＲ扩增成...     

长片段PCR技术

长片段ＰＣＲ技术刘建伟,徐湘民（第一军医大学分子生物学研究所,广州５１０５１５）关键词长片段ＰＣＲＰＣＲ技术是１９８３年由Ｍｕｌｌｉｓ首创的一种通过体外酶促扩增反应快速获取特定ＤＮＡ序列的方法,已在分子生物学、分子遗传学、医学和法医学等领域得到广泛应...     

黑麦染色体的显微分离与PCR扩增

利用改良的染色体显微分离技术,分离了黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）一个完整细胞的１８条染色体（１４Ａ＋４Ｂ）,用人工合成的寡核苷酸为引物,进行单一引物法（ｓｉｎｇｌｅｕｎｉｑｕｅｐｒｉｍｅｒＰＣＲ,ＳＵＰＰＣＲ）扩增,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明,ＰＣＲ扩增产物与黑麦基因组ＤＮＡ同源。     

PCR产物的RFLP分析在黄芪亚族（豆科）系统学研究中的应用初探

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）将豆科黄芪亚族７属９种及甘草亚族１属１种植物叶绿体基因组中ｎｄｈＦ和ｐｓｂＡ基因中一段约３．１ｋｂ的ＤＮＡ扩增出来,并摸索出一最佳的ＰＣＲ条件,使得此条带得以特异性扩增,可直接用于限制性内切酶水解。通过对此扩增片段的限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）的初步分析,认为利用ＰＣＲ扩增出的ＤＮＡ进行ＲＦＬＰ分析来探讨植物的系统进化问题在中国现行条件下大有潜力,其方法简单易行,结果     

利用PCR仪进行DNA克隆反应的半自动操作

利用ＰＣＲ仪进行ＤＮＡ克隆反应的半自动操作柏邵春刘万清贺林（中国科学院上海生命科学研究中心,上海２０００３１）Ｓｅｍｉ－ａｕｔｏｍａｔｅｄＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇＲｅａｃｔｉｏｎｓＵｓｉｎｇＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＢＡＩＳｈａｏｃｈｕｎＬＩＵＷａ...     

AFLP分子标记及其在植物育种上的应用

扩增酶切片段多态性（ＡｍｐｌｉｆｉｅｄＲｓｔｒｉｃｉｔｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ,简称ＡＦＬＰ）是由Ｚａｂｅａｕ等１９９２年发明的一项新的ＤＮＡ指纹技术,它结合了ＲＦＬＰ和ＰＣＲ技术的特点,具有ＲＦＬＰ技术的可靠性和ＰＣＲ技术高效性,其基本原理是对基因组ＤＮＡ酶切片段的选择性扩增,ＡＦＬＰ扩增片段的谱带数取决于采用的内切酶及引物３′端选择碱基的种类数目和所研究基因组的复杂性,实验     

用PCR方法从基因组DNA中扩增人睫状神经营养因子基因

用ＰＣＲ方法从基因组ＤＮＡ中扩增人睫状神经营养因子基因杜方勇,甘思德,范明,刘淑红（北京军事医学科学院基础医学研究所１００８５０）ＰＣＲ方法具有操作方便、对模板要求不高、能快速高效地从原材料中得到微克水平的基因片段等优点,但用它从基因组ＤＮＡ扩增长片...     

HBV－DNA的PCR二步法扩增及其快速检测

ＨＢＶ－ＤＮＡ的ＰＣＲ二步法扩增及其快速检测方勤,吴云涛,蔡宜权（中国科学院武汉病毒研究所,武汉４３００７１）关键词ＨＢＶ－ＤＮＡ,二步温控ＰＣＲ,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,生物素寡聚核苷酸杂交乙型肝炎是危害人类健康的主要疾病之一,其病原常用的检测方法多...     

甜菜多粘菌基因组片段的克隆及PCR检测

根据资料报导设计引物,扩增Ｐｏｌｙｍｙｘａ　ｂｅｔａｅ的基因组片段,将其克隆在ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）质粒载体上,并通过双酶切、ＰＣＲ扩增和部分序列测定,证明克隆片段为Ｐ．ｂｅｔａｅ基因组片段。用扩增Ｐ．ｂｅｔａｅ基因组片段的引物对由Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ侵染小麦和Ｏ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ侵染豇豆根系抽提的总ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增,均未获得任何ＤＮＡ产物,进一步证实了上述结果。对移入病土２、３．５天的甜菜苗单株根系进行ＤＮＡ粗提,移入病土３．５天的甜菜苗ＰＣＲ检测其已被Ｐ．ｂｅｔａｅ侵染,对确定Ｐ．ｂｅｔａｅ的早期侵染有重要意义。     

PCR和生物素探针对HFRSV的检测和分型的探讨

分析比较肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）７６／１１８株和Ｒ＿（２２）株的核苷酸序列,根据引物设计原则及检测分型的目的,设计并合成了３对引物。１对引物取于两毒株间的高同源区段,作为共同引物和外引物;另两对引物取于两毒株间的低同源区段,分别作为野鼠型引物、家鼠型引物和内引物。建立了ＤＮＡ聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＮｅｓｔＰＣＲ方法,并用ＮｃｓｔＰＣＲ合成了两种型特异的生物素探针。ＰＣＲ检测７６／１１８、Ａ＿９、陈、Ｒ＿２、Ｒ＿２２５个毒株,用外引物时均扩增出１条约３００ｂｐ的条带;用内引物的野鼠型引物时,除Ｒ＿（２２）株之外,其余４株均扩增出１条约７０ｂｐ的条带。斑点杂交试验证实了ＰＣＲ检测分型的准确性。ＮｅｓｔＰＣＲ和生物素探针斑点杂交试验可以测出１－１０ｂｇ的目的ｃＤＮＡ。     

检测单碱基错配-PCR方法的发展

ＰＣＲ已用于ＤＮＡ诊断。连接酶链反应（ＬｉｇａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ．ＬＣＲ）做为ＰＣＲ方法的补充得到进一步发展。应用热稳定ＤＮＡ连接酶,既能扩增ＤＮＡ,同时也能区分单碱基的替换。当碱基完全互补时,这个连接酶能对两个紧密相邻的寡核苷酸进行共价连接,若连接处发生了一个碱基突变,便不能使两个寡核苷酸有效连接,从而不能扩增产物,应用相应的方法便能区别     

大鼠脑神经元特异性烯醇化酶基因的cDNA克隆及序列分析

用ＲＴ－ＰＣＲ方法快速克隆了Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑神经元特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）的ｃＤＮＡ,将此包括编码全长ＮＳＥ４３３个氨基醚的ＤＮＡ片段重组入ｐＵＣ质粒,并用ＰＣＲ方法测定了全部顺序,经重复实验,发现Ｗｉｓｔａｒ大鼠与Ｆｏｒｓｓ－Ｐｅｔｔｅｒ报导的ＳＤ大鼠ＮＳＥ基因顺序,有两外单碱基的差别,其中一个涉及氨基酸的改变。同时还对ＲＮＡ的提取及长片段ＤＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ扩增进行了方法学的探讨。     

超高忠实性PCR用DNA聚合酶

ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法已在生物工程领域得到了广泛的应用,而ＰＣＲ法的推广完全得益于Ｔａｑ耐热性ＤＮＡ聚合酶。近年来,ＰＣＲ法的应用除生物工程领域外,已应用至工业、农业、医学、制药等与人们生活息息相关的各个领域。随着ＰＣＲ法的不断推广,人们对ＤＮＡ聚合酶的忠实性（Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）要求越来越高,一般来说,ＴａｑＤＮＡ聚合酶在进行ＰＣＲ延伸反应过程中的错配率为０．５％左右。ＴａＫａＲａ公司独自研制成功的ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡ聚合酶是一种来源于Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓ…     

粘虫核型多角体病毒919bp片段的PCR双链直接序列测定

本文发展了ＰＣＲ克隆和亚克隆技术制备ＤＮＡ测序模板。首先,我们用ｐＵＣ／Ｍ１３系列质粒的通用正反向引物ＰＣＲ扩增出质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＤＮＡ的多克隆位点及其侧翼序列,用ＥｃｏＲＶ和ＸｈｏＩ消化成为左右两个引物多克隆臂,与粘虫核型多角体病毒（ＬｓＮＰＶ）的ＥｃｏＲＶ和ＸｈｏＩ约４００ｂｐ和５００ｂｐ片段分别连接,经ＰＣＲ扩增,得到两端具有上述正反向引物结合位点的测序模板,用ｄｄＮＴＰ链终止法／ＰＣＲ扩增／银染色,从片段两端测定了全部９１９ｂｐ序列,这种ｄｄＮＴＰ／ＰＣＲ／银染测序法简化了操作,大大缩短了测序模板的制备时间,易于实现自动化操作。     

甜菜多粘菌基因组片段的克隆4及PCR检测

根据资料报导设计引物，扩增Ｐｏｌｙｍｙｘａ ｂｅｔａｅ的基因组片段，钭其克隆在ＰＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）质粒载体上，并通过双酶切、ＰＣＲ扩增和部分序列测定，证明克隆片段为Ｐ．ｂｅｔａｅ基因组片段。用扩增Ｐ．ｂｅｔａｅ基因组片段的引物 Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ侵染小麦和Ｏ．ｔｒａｓｓｉｃａｅ侵染豇豆根系抽提的总ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，均未获得任何ＤＮＡ产物，进一步证实了上述结果。对移人病士２、３．５天的甜菜苗     

一种简单、快速、有效的PCR产物克隆方法

一种简单、快速、有效的ＰＣＲ产物克隆方法李红卫,涂长春,金扩世,章金刚（长春农牧大学兽医研究所,长春１３００６２）关键词ＰＣＲ,克隆我们实验室在用ＰＣＲ法扩增和克隆病毒ｃＤＮＡ片段过程中,摸索了一种既不需设计酶切位点,也不需要纯化ＰＣＲ产物及特殊载体...     

可溶性白细胞介素6受体基因在链霉菌的克隆表达研究

以分离提取的ＨｅＬａ细胞总ＲＮＡ为模板,通过ＲＴ－ＰＣＲ反应扩增得到了１０１７ｂｐ的人可溶性白细胞介素６受体（ｓＩＬ－６Ｒ）ｃＤＮＡ片段,将扩增片段克隆到ｐＵＣ１９质粒中进行序列测定。结果证明该片的序列与文献报道的ｓＩＬ－６ＲｃＤＮＡ的序列完全一致,将ｓＩＬ－６ＲｃＤＮＡ与链霉素信号肽ｍｅｌＣｌ的编码序列融合后得到的融合基因ｍｅｌ／ｓＩＬ－６Ｒ克隆到链霉菌质粒ｐＬＪ４５９中,构建成重组表达质粒ｐＬ     

菰物种专化DNA序列的克隆及其在检测菰DNA导入水稻中的应用

根据两个植物抗病基因Ｎ和ＲＰＳ２中核酸结合位点（ＮＢＳ）和富亮氨酸重复区（ＬＲＲ）中的保守序列设计了一对特异引物,用ＰＣＲ从具有水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）改良所需要的许多优良性状的水稻近缘野生种菰（Ｚｉｚａｎｉａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ（Ｇｒｉｓｅｂ．）Ｔｕｒｃｚ．ｅｘ Ｓｔａｐｆ）的基因组ＤＮＡ中扩增同源片段。ＰＣＲ产物经克隆后,分别以菰和水稻的基因组ＤＮＡ为探针,通过点杂交对所得克隆进     

用RFLP和PCR—RFLP技术研究东北虎和华南虎线粒体DNA多态性

采用ｍｔＤＮＡＲＦＬＰ和ＰＣＲＲＦＬＰ技术研究了东北虎和华南虎的ｍｔＤＮＡ的多态性。在ｍｔＤＮＡＲＦＬＰ研究中,分离纯化了东北虎和华南虎肝、肾和心脏组织的ｍｔＤＮＡ,用２０种识别６碱基对的限制性内切酶消化,结果只有１种限制性内切酶（ＸｂａⅠ）检测到多态性片段,其余１９种限制性内切酶消化产生的限制性格局在东北虎和华南虎完全一致。在ＰＣＲＲＦＬＰ研究中,用ＰＣＲ技术分别扩增了东北虎和华南虎ｍｔＤＮＡ的控制区（ｃｏｎｔｒｏｌｒｅｇｉｏｎ）,用８种识别４碱基对的限制性内切酶分别对扩增产物进行消化,结果只有１种限制性内切酶（ＲｓａⅠ）检测到多态性片段。ｍｔＤＮＡＲＦＬＰ及ＰＣＲＲＦＬＰ的结果均提示东北虎和华南虎之间的遗传距离极小。这可能与下列因素有关：两者分布区间无天然隔离屏障;具有强扩散能力;近几百年才被相互隔离。     

杉木叶绿体和线粒体遗传的研究

利用ＰＣＲ技术分别以亲本杉木（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａｌａｎｃｅｏｌａｔａ（Ｌａｍｂ．）Ｈｏｏｋ．）、柳杉（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｆｏｒｔｕｎｅｉＨｏｏｉｂｒｅｎｋ）和杉木×柳杉杂种的总ＤＮＡ为模板,扩增了叶绿体ｔｒｎＬｔｒｎＦ和线粒体ＣｏｘⅢ基因片段,比较了这些扩增片段的限制性内切酶ＡｌｕⅠ,ＤｄｅⅠ,ＨｉｎｆⅠ,ＭｓｅⅠ和ＲｓａⅠ的酶切片段多态性,结果表明：Ｆ１代的叶绿体ＤＮＡ为母系遗传,而线粒体ＤＮＡ为父系遗传。杉木线粒体ＤＮＡ父系遗传方式与杉科其他植物一致,而叶绿体ＤＮＡ母系遗传则为在松柏类植物中首次发现。