DNA测序技术概述

DNA测序技术作为现代生命科学研究的核心技术之一,自上世纪70年代中期DNA发明以来发展迅速。我们简要综述现有的几代DNA测序技术的原理及其发展历程,并对未来可能出现的第三代测序进行预测。     

DNA测序技术的进展和挑战

基因是人类的遗传信息的载体,其遗传和表达影响人类的繁衍及各种生命活动;个体基因组DNA序列突变往往会导致疾病的发生,获取个体的基因组DNA序列将有助于疾病的诊断.DNA测序技术潜在的医学应用前景使其近几年有了飞速的发展.本文将介绍各代DNA测序技术已经取得的进展,目前尚待克服的挑战及可能的解决办法,并着重分析最新的单分子测序技术的发展潜能及临床应用前景.     

DNA测序技术比较

自从1953年,J.D.Watson和F.H.C.Crick发现DNA的双螺旋模型之后,DNA测序技术随着科学的进步得到了迅猛发展.1977年Sanger[1]发明DNA双脱氧末端终止测序技术,Maxam与Gilbert[2]发明利用化学降解法进行测序的技术,2种测序技术被誉为DNA测序技术的始祖.随后,在第1代DNA测序技术的基础上,相继出现了第2代测序技术、基因芯片技术以及第3代测序技术.总结并展望了每一代测序技术及基因芯片技术的诞生、原理及应用前景,为利用测序技术研究基因表达提供理论基础和实验依据.     

DNA测序技术的发展历史与最新进展

DNA测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术。从1977年第一代测序技术的出现,经过30多年的发展,DNA测序技术取得重大进展,以高通量为特点的第二代测序技术逐步成熟并商业化,以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经出现。介绍每一代测序技术的特点,并重点介绍了第二代测序技术及其应用。展望新的测序技术对于未来生物学研究及人们自身健康与人类疾病等方面研究的影响。     

杂交测序——DNA测序新策略

杂交测序──ＤＮＡ测序新策略陈尚武,马涧泉（中山医科大学生化教研室,广州５１００８９）关键词ＤＮＡ,测序,杂交人类基因组计划要求改进ＤＮＡ测序方法,促进了测序技术的发展,一种全新的测序方法──杂交测序（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂｙｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ...     

DNA测序技术的专利计量研究

DNA测序技术是现代生命科学研究的重要技术之一。本文对Derwent数据库中收录的,与DNA测序技术领域相关的专利申请数据进行了研究,分别从专利申请量及年度变化、生命周期、专利权人和专利发明人、专利的国际专利分类及德温特分类号等角度深入分析了DNA测序技术专利的整体产出情况、重点技术领域和主要申请机构的专利战略布局情况。通过研究发现DNA测序技术近年来发展迅速,但是主要推动者是经济发达国家。     

DNA 测序技术领域的相关政府投入分析

DNA测序技术是遗传工程的核心技术之一,发展快速和低成本的基因测序技术成为研究焦点。美国、欧盟等发达国家和地区大力支持DNA测序技术的创新研究,并投入了大量的科研经费。在美国,国家卫生研究院(NIH)下属的国家人类基因组研究院(NHGRI)、美国能源部(DOE)以及美国科学基金委(NSF)等机构是进行DNA测序技术相关项目经费分配的主要政府部门。DNA测序作为生命科学研究的关键技术也是欧盟框架计划资助的重要内容之一,其以多个欧洲国家间合作以及产学研合作的形式开展。中国在DNA测序技术领域也开展了一些研究。     

双链DNA模板循环测序的研究

采用末端标记引物进行双链ＤＮＡ循环测序是实验室快速,准确获得双链ＤＮＡ模板序列的有效方法。实验结果表明：该测序法不仅能消除由于模板不纯所导致的引物的非特异性结合等因素而产生的非特异条带,而且能降低ＰＣＲ产物测序的背景问题。     

采用无需扩增的测序技术改变基因组解读成本过高的现状——新的DNA测序方法

廉价DNA测序技术的开发以美旧风险企业为中心推进。为实现个人基因组测序成本降至1000美元的一标，必须要有崭新的概念。在2006年3月欧美研究人员和企业云集的日本药学会年会上，该领域激烈的开发竞争已初露端倪。[编者按]     

应用ABI PRISMTM310测序仪进行快速且经济的DNA测序

目的 使DNA测序更快速且经济。方法 根据测序模板的不同采取相应的测序方法。视具体情况调整测序反应条件,改进仪器的操作方法,减少测序反应体系及合理使用试剂,结果 对测序模板,测序条件和仪器操作的优化,可缩短测序时间,充分利用试剂,可降低测序成本。结论 在保证测序质量的前提下,不仅快速而且经济。     

DNA测序中常见影响因素的研究

对测序中的模板、引物、测序反应条件及测序反应纯化方法和仪器操作等进行研究。结果显示测序模板的纯度影响测序的质量 ,浓度对测序的长度有影响。引物设计时除符合一般设计原则外 ,Tm值最好在5 0℃～ 6 0℃之间 ,且无成串的G、C。改变变性、退火、延伸的时间和温度对特殊DNA模板的序列测定有较好的效果。测序反应产物的纯化有几种方法 ,以 70 %乙醇沉淀法最经济、方便。因此模板的纯度和浓度对测序成功与否起决定作用。最佳反应条件可降低成本 ,提高测序成功率 ,乙醇沉淀法是首选的测序反应产物纯化方法。仪器操作熟练、正确与否也会影响测序结果。     

古DNA单链测序文库的建立与检测北大核心CSCD

2005年问世的第二代测序技术在古DNA领域的应用,突破了第一代测序技术在绝灭或死亡生物全基因组获取手段上的局限。借助古基因组信息,研究者能够从更为系统的实时分子证据角度,解读诸如人类起源、大型绝灭哺乳动物迁移演化、动植物家养驯化以及早期人类社会生活模式等古生物学、遗传学与演化生物学问题。引入第二代测序技术之后,传统的古DNA研究方法及流程得以改变,剔除了原有的实验流程中耗时的分子克隆步骤,引入了与第二代测序技术紧密相关的古DNA单链测序文库构建环节。古DNA单链测序文库的构建,是将古DNA双链模板变性成单链后,通过向单链古DNA两端添加人工DNA片段,将古DNA分子转变成能被测序仪识别的文库分子。针对古DNA分子微量、高度片段化以及普遍存在碱基损伤的特点,古DNA单链测序文库,能够高效获取古DNA材料中的遗传信息。本文系统介绍古DNA单链测序文库建立流程,以及对文库质量进行检测的方法,为研究者运用第二代测序技术测定绝灭或死亡生物全基因组提供方法借鉴。     

新一代测序技术的研究进展

大规模DNA测序技术是揭秘人类和其它生物遗传密码的重要技术,在分子生物学和基础医学领域有广泛应用。第二代测序技术的出现使DNA测序的通量大幅提高,测序的成本大幅下降,原来只有在大型测序中心才能完成的测序任务现在已经可以在更多的实验室展开。但是,早期的第二代测序技术仍然存在诸如文库构建过程复杂、测序成本依然较高等缺点。为了克服上述缺点,近三年发展了几种新的第二代和第三代测序技术,这些技术不仅继承了早期第二代测序技术通量高的优点,而且在文库构建等方面取得了重要突破,进一步简化了测序操作,降低了测序成本,缩短了测序时间。本文就几种最新的大规模测序技术的原理、特点与发展趋势进行简要介绍。     

扩增子测序技术应用于乳腺癌循环游离DNA无创性检测的研究

目的:应用扩增子测序方法检测乳腺癌循环游离DNA肿瘤相关突变。方法:军事医学科学院附属医院的10例HER2阳性晚期乳腺癌患者血样入组,应用扩增子测序技术检测血细胞和血浆中的循环游离DNA(cfDNA),筛选出肿瘤相关基因突变,即循环肿瘤DNA(ctDNA)。结果:检测10例晚期乳腺癌患者外周循环血50个基因,共检出11个突变基因,其中PIK3CA、ERBB4的阳性检出率均达到100%,AKT、TP53的阳性检出率为90%。结论:检测覆盖度及深度均良好,结果提示11个基因的热点突变区域出现单核苷酸的多态性基因突变,突变基因与PI3K-AKT-m TOR通路、Ras-Raf-MEK-ERK通路明显相关。扩增子测序技术和筛选方法可以用于乳腺癌ctDNA的无创性检测。     

下一代测序技术:技术回顾与展望

在过去的30年中,作为最重要的生物医学研究手段之一,DNA测序技术的数据产出能力呈指数增长,而且这一技术本身也演变成为一个面向工程学和物理学的新技术领域.本文分析了下一代测序仪的技术特点,并对其未来的发展以及应用进行了前瞻性的展望.预期在刚刚出现的技术中,有些技术假以时日能够发展成熟,实现1000美元基因组和100美元基因组的目标.同时建议中国科学家在这场对科学研究以及社会医疗保健体系都将产生深远影响的运动中发挥积极的作用.     

利用DNA池和测序技术快速筛查SNPs及估算基因频率

选取产蛋性能具有明显差异的4个鸡品种(莱航鸡、阳山鸡、丝羽乌骨鸡和隐性白洛克鸡)构建品种DNA池,采用测序的方法研究鸡催乳素基因5′侧翼调控区远端序列(1028bp)的多态性,快速筛查到8个可能与产蛋性能相关的SNPs(C-2402T、T-2192C、C-2161G、C-2134G、C-2062G、G-2040A、A-1944G和C-1884A)。进一步利用测序图中SNP等位基因峰高的比值估算各鸡品种等位基因的频率,其中C-2402T、C-2161G、C-1884A和C-2062G、G-2040A位点等位基因频率的估算结果分别被PCR-RFLP、PCR-SSCP所验证,说明测序峰高比值估算等位基因频率的方法具有一定的可行性。     

DNA提取对微生物多样性测序分析的影响

运用高通量测序技术分析复杂样品中微生物种群的变化情况,已经成为目前微生物研究领域的热点问题之一。而微生物的样品准备,如DNA提取和16S可变区的扩增等,对于测序完成后的数据分析以及微生物原始群落组成的影响是至关重要的。采用国产试剂盒(天根土壤微生物基因组提取试剂盒)和进口试剂盒(MOBIO土壤微生物基因组提取试剂盒)分别对土壤样品和羊瘤胃食糜样品进行DNA提取。然后选取总DNA起始量为25ng,对16S V3可变区进行PCR扩增和文库构建,最后通过数据分析比较不同试剂盒提取的DNA对微生物多样性变化的影响,包括OTU数目、稀释曲线、微生物数量及物种种类等。研究发现,在相同DNA模板量和PCR条件下,进口试剂盒提取的DNA能够获得更多的微生物种类。