EGFP—pBABE逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）的EGFP—pBABE逆转录病毒载体并对其表达进行鉴定。方法从pEGFP—N3质粒上切下EGFP片段,连接到pBABE载体,构建EGFP—pBABE重组质粒;将该重组质粒转染到Fr67细胞后,荧光显微镜下观察EGFP的表达;收集逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞后荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果成功构建EGFP—pBABE重组质粒。该质粒转染PT67细胞24h后,荧光显微镜下可观察到EGFP的表达;用该重组质粒包装的逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞36h后,在荧光显微镜下可观察到明显的EGFP表达。结论成功构建表达EGFP的EGFP—pBABE逆转录病毒载体,为进一步利用该载体制备逆转录病毒并观测逆转录病毒感染细胞的效率奠定了良好的实验基础。     

逆转录病毒载体在基因工程疫苗方面的应用

逆转录病毒载体是根据逆转录病毒的特性设计出的一种病毒表达载体,以其能够整合到宿主细胞染色体上并能稳定表达目的基因而被视为基因运载最有效的工具。目前广泛应用于基因治疗、外源基因表达、基因工程疫苗等方面。主要综述了逆转录病毒载体在基因工程疫苗方面的应用现状及前景,为该载体在生物医学领域方面的应用提供有价值的参考。     

靶向WNT5A基因的shRNA逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建人WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体.方法:根据人WNT5A基因mRNA序列设计并合成两条互补的DNA单链寡核苷酸,将退火后形成的双链连接于pSUPER Retro RNAi质粒,构建WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体,经脂质体介导入GPG293细胞,包装成逆转录病毒.用该逆转录病毒感染人鼻咽癌细胞,Western blot法和RT-PCR检测细胞WNT5A的表达.结果:目的序列成功连接于载体并包装成逆转录病毒,免疫印迹检测和RT-PCR检测结果表明构建的WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体能显著抑制鼻咽癌细胞WNT5A的表达.结论:成功构建人WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体.     

稳定干扰核糖体蛋白RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株的建立

目的建立稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株。方法设计并合成靶向人RPS7基因的shRNA寡核苷酸片段,克隆到逆转录病毒载体pSIREN中,构建重组质粒pSIREN-RPS7-shRNA,转染293T细胞,将包装产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌HeLa细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞克隆,用real-timePCR和Western印迹检测细胞中RPS7mRNA和蛋白表达水平。结果获得了经测序鉴定正确的重组逆转录病毒质粒,逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出的稳定细胞中,RPS7mRNA和蛋白水平均显著低于干扰对照细胞。结论成功构建了靶向人RPS7基因的shRNA逆转录病毒载体,建立了稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株．为进一步研究RPS7在宫颈癌中的生物学功能和作用机制提供了可靠的细胞模型。     

白细胞介素6重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建特异性过表达大鼠IL-6基因的重组逆转录病毒载体,并在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾HEK293细胞中检测IL-6的表达。方法以大鼠骨髓间充质干细胞mRNA为模板,经PCR获得目的基因IL-6,将其定向克隆到逆转录病毒载体pSEB-3H中,构建重组逆转录病毒质粒pSEB—IL-6,经脂质体分别转染到PC12细胞和HEK293细胞中,应用Real—timePCR和ELISA的方法在mRNA和蛋白质水平检测IL-6的表达变化。继而用HEK293细胞中包装获得的含有pSEB—IL-6的病毒颗粒进一步感染PC12细胞,Real—timePCR检测,IL-6mRNA的表达水平变化。结果PCR电泳及酶切鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒载体中,其基因序列与Genbank报道一致;Real—timePCR和ELISA结果均显示,逆转录病毒质粒pSEB—IL-6转染PC12细胞和HEK293细胞后,IL-6的表达水平较对照组显著上调;经pSEB—IL-6逆转录病毒颗粒感染的PC12细胞中,IL-6mRNA表达水平较对照组提高4倍。结论成功构建了特异性表达大鼠儿-6基因的重组逆转录病毒载体pSEB—IL-6,并获得了具有感染能力的逆转录病毒颗粒,感染真核细胞后可高表达IL-6,为进一步研究IL-6的功能及其在多种疾病中的免疫调节机制提供重要的分子手段。     

促DNA修复多效蛋白诱导因子pprI逆转录病毒载体系统的构建及其鉴定

目的:为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的稳定遗传与表达,构建重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI。方法:将目的基因pprI亚克隆经过双酶切后定向连接到pLXIN质粒上,构建逆转录病毒重组质粒pLXIN-pprI。将pLXIN-pprI转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,氨苄青霉素筛选后抽提获得重组质粒pLXIN-pprI,双酶切及DNA测序鉴定。结果:酶切鉴定及测序结果显示结果与预期相符,pprI基因成功插入pLXIN逆转录病毒载体中。结论:重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI构建成功,为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的重组与表达奠定了基础。     

反义前C／C基因转移表达抗乙型肝炎病毒作用的研究

为了观察逆转录病毒载体包装细胞系统介导反义基因转移表达的抗乙型肝炎病毒（HBV）作用,将HBVayw前C／C基因（preC／C）片段反向插入逆转录病毒载体质粒。将重组体转染逆转录病毒包装细胞PA317后,获得重组逆转录病毒。用重组逆转录病毒感染2．2．15细胞后发现,感染后第3天,细胞培养上清HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）表达量即明显减少,抑制作用于感染后第5天达到高峰,其中对HBsAg表达的抑制率为27．0％,对HBeAg表达的抑制率为59.5％。反义基因重组逆转录病毒感染2.2．15细胞对HBV抗原表达的抑制作用至少可以持续到转导后的第11天。空载及正义基因重组逆转录病毒感染对2．215细胞HBV抗原表达无明显抑制作用。此外,反义基因重组逆转录病毒感染对2.2.15细胞HBVDNA复制也有抑制作用．无细胞毒性。     

LMO3逆转录病毒表达载体的构建及其对SK-N-AS细胞增殖的影响

目的构建包含LM03（LIM-only3,LM03）全长基因的逆转录病毒表达载体,感染人神经母细胞瘤SK-N-AS,检测LM03对SK-N-AS细胞增殖的影响。方法将质粒pEGFP-Cl-一LM03经EcoRI和BamHI双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建重组逆转录病毒表达载体pLXSN-LMO3,导人包装细胞pA317,获得逆转录病毒颗粒,感染SK-N-AS细胞,用RT-PCR及Western印迹鉴定,检测LM03感染后细胞的增殖及细胞周期分布情况。结果获得了能正确表达LM03基因的重组逆转录病毒表达载体pLX-SN-LMO3;LM03基因被逆转录病毒成功导入SK-N-AS细胞后,与对照组细胞相比,LM03感染组G1／G1期细胞减少,S期细胞增加,感染48h后,LM03感染组细胞的增殖能力显著高于空载体对照组及SK-N．AS组（P〈0．05）。结论成功构建了LM03基因的逆转录病毒表达载体,LMO3可以通过促进SK-N-AS细胞由G0／G1期进入S期,从而促进细胞的增殖。     

Pmscv-Ubc9逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的：构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法：聚合酶链反应（PCR）扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果：限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论：携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。     

Pmscv-Ubc9 逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的:构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果:限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论:携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。     

14-3-3σ 干扰逆转录病毒载体的构建及其稳定转染HaCat 细胞系的建立

目的:构建14-3-3σ干扰逆转录病毒载体,建立稳定转染的HaCat细胞系。方法:人工合成14-3-3σ基因干扰序列并定向插入到pSuper-retro-neo-EGFP质粒,并在STBL3菌内进行质粒扩增,刷选阳性克隆,酶切测序鉴定,转染293FT细胞进行病毒包装、扩增、纯化、获取逆转录病毒载体,将逆转录病毒载体感染HaCat细胞后Western免疫印迹法、Real-timePCR法检测14-3-3σ的表达情况。结果:连接重组后经酶切和测序筛选出pSuper-retro-neo-EGFP-si14-3-3σ;干扰质粒稳定转染的HaCat细胞系在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光,Western免疫印迹法和Real-timePCR法表明14-3-3σ表达明显抑制。结论:成功构建了14-3-3σ干扰的逆转录病毒载体,并构建了其稳定转染的HaCat细胞系。     

14-3-3σ干扰逆转录病毒载体的构建及其稳定转染HaCat细胞系的建立

目的：构建14-3-3σ干扰逆转录病毒载体,建立稳定转染的HaCat细胞系。方法：人工合成14-3-3σ基因干扰序列并定向插入到pSuper-retro-neo-EGFP质粒,并在STBL3菌内进行质粒扩增,刷选阳性克隆,酶切测序鉴定,转染293FT细胞进行病毒包装、扩增、纯化、获取逆转录病毒载体,将逆转录病毒载体感染HaCat细胞后Western免疫印迹法、Real-timePCR法检测14-3-3σ的表达情况。结果：连接重组后经酶切和测序筛选出pSuper-retro-neo-EGFP-si14-3-3σ;干扰质粒稳定转染的HaCat细胞系在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光,Western免疫印迹法和Real-timePCR法表明14-3-3σ表达明显抑制。结论：成功构建了14-3-3σ干扰的逆转录病毒载体,并构建了其稳定转染的HaCat细胞系。     

自我失活型逆转录病毒载体在衰老基因转录调控中的应用

以自我失活型逆转录病毒载体pSIR为基础,构建了含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的载体pSIR-EGFP和含有870bp p16启动子载体pSIR-EGFP-870.将两种病毒载体转染至包装细胞包装成病毒颗粒.病毒感染2BS靶细胞,病毒5′LTR在逆转录过程中自我灭活.通过该系统观察到p16启动子在2BS细胞衰老过程中,转录活性明显增强.结果表明,自我失活型逆转录病毒载体能很好地用于衰老基因转录调控的研究.     

MAR介导的逆转录病毒包装细胞系的建立

根据GenBank登录的序列号,使用primer5.0进行引物设计,提取人的外周血基因组DNA为模板,PCR方法扩增出人β-珠蛋白MAR序列,将MAR序列插入到逆转录病毒表达载体pLXSN,构建MAR序列介导的逆转录病毒载体。酶切和测序鉴定后,阳离子聚合物转染PA317细胞,G418筛选出阳性细胞克隆,提取病毒液上清,测定逆转录病毒颗粒滴度,逆转录病毒颗粒的最高滴度为1.6×106CFU/mL,成功建立了MAR介导的逆转录病毒包装细胞系。     

自我失活型逆转录病毒载体在衰老基因转录调控中的应用

以自我失活型逆转录病毒载体pSIR为基础，构建了含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的载体pSIR-EGFP和含有870bp p16启动子载体pSIR-EGFP-870.将两种病毒载体转染至包装细胞包装成病毒颗粒.病毒感染2BS靶细胞，病毒5′LTR在逆转录过程中自我灭活.通过该系统观察到p16启动子在2BS细胞衰老过程中，转录活性明显增强.结果表明，自我失活型逆转录病毒载体能很好地用于衰老基因转录调控的研究.     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒配基因的真核表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFVE2基因在PK-15细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的PK-15细胞腹腔免疫Balb/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。     

逆转录病毒表达系统及其在外源蛋白高效表达中的应用

逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白高效表达系统,它由逆转录病毒载体,包膜蛋白载体和包装细胞系构成,在基因治疗和生物制药领域都有很大的应用潜力。逆转录病毒和宿主细胞基因组的重组倾向于发生在转录活性区;口炎疱疹病毒-G蛋白 (vesicular stomatitis virus G, VSV-G)能有效扩大逆转录病毒感染宿主细胞的范围、提高逆转录病毒的感染效率;用高滴度的重组病毒感染细胞,经过简单的筛选即可获得高表达细胞株。本文对逆转录病毒表达系统的组成、感染的特点和机制及其应用前景作了概述。     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因的真核表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(Classical swine fever virus , CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro 中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在PK-15细胞膜上成功表达.将表达E2蛋白的PK-15细胞腹腔免疫Balb/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体.     

基因治疗所用的逆转录病毒载体系统

基因治疗所用的逆转录病毒载体系统徐铿,陈诗书（上海第二医科大学生物化学教研组,２０００２５）关键词基因治疗,逆转录病毒载体,包装细胞八十年代初发展的以逆转录病毒为基础的基因转移系统对今天基因治疗的实现起了关键性的作用。目前近５０个基因治疗计划绝大部分...     

用慢病毒载体制备转基因动物的研究进展

慢病毒是逆转录病毒的一种 ,具有逆转录病毒的基本结构 ,但也有不同于逆转录病毒的组份和特性 ,作为基因治疗载体发展起来 ,最近已用于转基因动物制备。慢病毒像其它逆转录病毒一样 ,其基因组经逆转录后能整合在宿主DNA上 ;由于病毒载体经改构后 ,不在宿主细胞增殖 ,不会导致寄主细胞的死亡 ,被它感染的或转化的动物细胞能够连续传代 ;这种载体的最大优势是能感染静止细胞和不产生嵌合体动物。详细介绍了慢病毒载体构建原理、近年慢病毒载体在转基因动物制备方法和应用研究的新进展。