甲型H1N1流感病毒HA基因RT-LAMP检测方法的建立与初步应用

目的:建立反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)检测甲型H1N1流感病毒HA基因的方法,并用于检测临床样本.方法:通过在线软件Primer Explorer V4设计H1N1 HA基因的RT-LAMP引物,建立RT-LAMP检测方法,并评价其灵敏度和特异度.结果:与传统RT-PCR方法相比,RT-LAMP检测方法具备更高的灵敏度,达到10个拷贝,并且具有良好的特异性;在76份呼吸道感染儿童的咽拭子标本中检测到2份阳性,与RT-PCR方法检测结果相同.结论:建立的H1N1 RT-LAMP检测方法灵敏特异,简单快速,具备H1N1现场检测应用前景.     

逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用

建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测.该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应.对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green Ⅰ为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试.结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性.此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平.因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法.     

同时检测新甲型H1N1及人季节性H1N1和H3N2流感病毒的单管多重荧光定量PCR方法

本研究设计的一种4重荧光定量RT-PCR检测方法,以A型流感病毒各亚型的血凝素基因(HA)为检测靶标,实现了同时检测新甲型H1N1流感病毒、人季节性H1N1流感病毒和人季节性H3N2流感病毒。本法使用人细胞RNA酶P基因作为内参,以判断标本来源和实施质量控制。利用不同来源和亚型的流感病毒验证了该方法的特异性;利用连续稀释的新甲型H1N1流感病毒HA全基因体外转录物进行灵敏度分析。结果表明该方法灵敏度高,可检测低至20个拷贝的RNA;特异性强,每对引物只检测出对应的病毒,无交叉反应;并且成功地验证性检验了34份新甲型H1N1流感病毒阳性临床标本和20份人季节性H1N1和H3N2流感病毒及人乙型(HB)流感病毒阳性临床标本。因此,该多重荧光定量RT-PCR法是一种可同时检测2009年新甲型流感病毒及季节性流感病毒的有效方法。     

A组轮状病毒可视化RT-LAMP方法的建立

【目的】建立一种利用颜色判定的快速、简单、灵敏度高的检测方法,即可视化的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)方法,并应用于人A组轮状病毒的基因检测。【方法】针对A组轮状病毒VP6基因的6个保守区域设计4条特异性引物,在64 °C恒温条件下进行核酸扩增反应1 h,在扩增前加入染料钙黄绿素(Calcein)作为反应指示剂,以钙黄绿素的颜色变化作为结果判定标准。评价该方法的特异性和灵敏度,并同时利用RT-LAMP和RT-PCR两种方法对90份临床腹泻样本中的病毒核酸进行检测。【结果】RT-LAMP方法特异性较高,灵敏度可以达到103 copies/μL RNA分子水平,比RT-PCR高出100倍。对临床标本的检出率与RT-PCR方法相当。【结论】建立的RT-LAMP法灵敏度较高,特异性强,节省时间,结果可视化,具有野外检测和现场快速检测的潜力。     

利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型

为直接根据颜色变化进行可视化检测H1亚型、N1亚型、N2亚型禽流感病毒(AIV),根据环介导等温扩增技术(LAMP),建立针对H1亚型AIV及特异性鉴定N1、N2亚型的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。根据GenBank中的AIV基因序列,设计了三套分别针对H1亚型AIV-HA基因及N1、N2亚型AIV-NA基因的特异性简并引物,并优化反应条件和体系。结果表明建立的检测方法对其它亚型AIV及禽呼吸道病原体无交叉扩增反应并能特异性地检测N1、N2亚型AIV,灵敏度优于传统的RT-PCR方法。整个反应在常规水浴中50min就可完成,反应结束后不需打开反应管盖,可根据反应液的颜色变化对结果直接进行判定。120份临床样品用建立的RT-LAMP方法检测到14份H1N1亚型AIV、8份H1N2亚型AIV,结果与病毒分离结果相符。本研究建立的三种RT-LAMP可视化检测技术特异、灵敏、快速、操作和结果判定简便,适合在基层进行H1亚型AIV的快速检测及N1、N2亚型AIV的分型。     

山东省甲型H1N1流感病毒病原学及基因特性研究

在2009~2010年监测年度开展甲型H1N1流感病毒学监测并进行病原学分离鉴定,以及对血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)特性分析,研究其基因变异情况。采集了17 126份发热患者的鼻、咽拭子标本,采用逆转录实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)进行核酸检测,其中甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性4004份,总阳性率为23.38%。对阳性标本开展病毒分离,并对分离的甲型H1N1流感病毒的HA、NA基因序列进行测序。利用DNAStar软件对序列进行同源性分析发现与WHO推荐的疫苗株相比,山东省甲型H1N1流感流行株HA、NA基因同源性分别为96.9%~99.3%和99.1%~99.6%;利用Mega 4.0软件进行基因进化分析和氨基酸进化分析发现,与WHO推荐的疫苗株相比,山东省甲型H1N1流感流行株有21个血凝素基因的氨基酸发生替换,其中11个氨基酸位点位于抗原决定簇区,一个糖基化位点发生改变;有16个神经氨酸酶基因的氨基酸发生了替换,一个糖基化位点发生改变;未发生神经氨酸酶蛋白275位H→Y的替换。结果显示山东省甲型H1N1流感暴发流行株HA基因和NA基因均具有高度同源性,HA蛋白和NA蛋白均存在不同程度的氨基酸替换,部分流行株抗原决定簇和糖基化位点发生改变,所有病毒均对达菲类药物敏感。     

甲型H1N1流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术

目的:建立基于TaqMan荧光探针技术的甲型H1N1流感病毒实时定量RT-PCR方法。方法:分析H1N1流感病毒基因特性,根据新发甲型H1N1流感病毒突变基因片段设计检测引物和TaqMan荧光探针,建立荧光定量RT-PCR检测体系,体外转录制备RNA标准品,进行特异性、敏感性、重复性及盲样检测评价实验。结果:可特异性有效检测新发甲型H1N1流感病毒核酸,与H1～H16流感病毒基因无交叉反应;对RNA标准品的检测敏感性达103拷贝/μL;重复性实验中,阳性标准品Ct值变异系数(CV)10%,阴性标准品检测结果均呈阴性;12份盲样检测结果特异性好。结论:该荧光定量RT-PCR方法可作为甲型H1N1流感防控的病原快速诊断技术。     

中国内地首例确诊甲型H1N1流感病例的实验室检测

本实验室针对中国四川省一例输入性疑似甲型H1N1流感病例的临床咽拭子标本进行Real-time PCR和RT-PCR检测,并随后对部分基因片段进行测序,结果表明临床咽拭子标本为甲型H1N1流感病毒阳性,因此该疑似甲型H1N1流感病例成为中国内地首例确诊的甲型H1N1流感病例。     

环介导逆转录等温扩增技术检测中东呼吸综合征冠状病毒基因

建立了基于浊度仪和羟基萘酚蓝(Hydroxy naphthol blue,HNB)颜色变化的简单、快速和灵敏的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)检测方法,应用于中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)的检测。针对MERS-CoV的核衣壳蛋白基因(Nucleocapsid,N)设计6条特异引物,在等温条件下(63℃)进行60min扩增反应。通过实时浊度仪记录扩增曲线和扩增前在反应体系中加入HNB观察颜色变化两种方式进行检测结果判定。本文对不同人类冠状病毒及常见呼吸道病毒进行了特异性验证,对梯度稀释的体外转录MERS-CoV全N基因RNA进行了定量和检测限分析,同时与已发表的实时荧光定量PCR(rRT-PCR)进行比较。结果显示,本研究建立的RT-LAMP方法特异性高,对于每反应管103至106的拷贝数RNA,出峰时间与每反应管N基因RNA拷贝数对数值有稳定的线性关系。基于浊度仪和颜色判定的RT-LAMP检测方法检测限分别为500拷贝和1 000拷贝。因此,该方法有望应用于MERS-CoV感染的快速筛选,具有在基层医疗卫生机构和现场推广和应用的潜力。     

云南省2009～2014年甲型H1N1流感病毒HA及NA基因特征分析

了解云南省2009~2014年甲型H1N1流感病毒的流行趋势,研究HA和NA基因进化特征。对云南省近6年来上报的流感监测病例数据进行病原谱总结,挑选出23株甲型H1N1流感毒株进行HA及NA基因分析。利用MEGA 5.0软件对测序结果构建进化树分析基因同源性。2009~2014年云南省共监测到4次甲型H1N1流感流行高峰,核酸检测结果中甲型H1N1流感占检出总量的28.8%。测序结果显示,HA与NA基因均分为3个类群,检测到一株具有H275Y突变位点的毒株。甲型H1N1流感是导致本省流感流行的重要亚型之一,2009~2014年间分离的毒株主要有Goup1、Gourp7和Gourp6三个支系,绝大部分甲型H1N1流感毒株仍对神经氨酸酶抑制剂敏感。     

甲型H1N1流感病毒快速核酸检测技术的建立

美国、墨西哥等国家相继发生甲型H1N1流感疫情后,即刻引起全球关注。WHO日前宣布目前为流感大流行第五期,预示又一次流感大流行可能逼近。正确检测和鉴定病毒是必须解决的首要问题。我们开展了甲型H1N1流感病毒快速核酸检测技术的研制工作,目前已经建立了甲型H1N1流感病毒核酸RT-PCR检测技术,并将其及时用于临床样本的检测。     

1981～2005年中国H1N1甲型流感病毒血凝素基因的HA1演变特征

为了解1981~2005年我国H1N1甲型流感病毒血凝素基因的HA1演变特征,选取H1N1甲型流感病毒370株,提取病毒RNA,经逆转录和聚合酶链反应扩增HA1并测序,测定的序列用生物信息软件分析,与GenBank中相关序列比较,并对推导的编码氨基酸序列进行基因特性分析。结果表明:HA1氨基酸的变异表现为抗原决定簇4个区均有变异,Sb区和Ca区变化较大;HA1受体结合位点(RBS)的前壁130环的第134位赖氨酸从1991年起在部分毒株HA1序列上开始缺失,以后缺失株逐步增多,自2000年起测定的所有毒株上该氨基酸全部缺失,同时这些缺失株的第137位氨基酸也全部由苏氨酸替换为丝氨酸;糖基化位点从增多到减少,最后稳定在7个;1981~2004年我国H1N1甲型流感病毒血凝素HA1编码的氨基酸在种系发育树上同年代基本呈现集中分布,与时间和地域无关,2005年毒株分成两个分支在时间上有明显差异。     

新发甲型H1N1流感病毒HA分子的变异分析

目的:从分子进化水平上分析流感的起源及发展问题,研究目前爆发的H1N1病毒的HA分子的变异行为.方法:以GenBank公布的甲型流感H1N1病毒血凝素(hemagglutinin,HA)核酸序列和我国及世界范围内近几年来报告的H1N1流感病毒HA的核酸及氨基酸序列为研究对象,利用CLUSTAL 1.83和NetNGlyc 1.0等生物信息学软件对HA核酸和氨基酸序列进行了比对分析;将其糖基化位点、氨基酸序列和抗原决定簇与以往流感病毒进行了比较.同时,还将人源和猪源甲型H1N1流感病毒的HA氨基酸序列进行了序列比对和系统发育分析.结果:最新爆发的甲型H1N1流感病毒的HA除了在60,259,453,512位点高度保守区域与之前爆发的流感病毒一致外,在249位点新出现1个"-NTT-"的糖基化位点.发现所有的甲型病毒的氨基酸序列在8个氨基酸位点均发生改变,而8个氨基酸位点位于6个抗原抗原决定簇上.结论:糖基化位点的增加,氨基酸位点的改变导致抗原决定簇的改变,即抗原性漂移现象,都成为引起其传染性改变的重要原因.     

改良逆转录环介导等温扩增检测技术快速实时检测H9亚型禽流感病毒

利用改良逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术建立一种快速、灵敏的检测方法用于H9亚型禽流感病毒检测。根据H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区序列中的8个区段设计6条特异性引物,在恒温条件下进行核酸扩增反应,并以琼脂糖凝胶电泳和目视检查绿色荧光两种方法对扩增结果进行判定。结果表明,RT-LAMP的最小检测限为100 fg,灵敏度比PT-PCR高100倍,且与H5亚型、H7亚型禽流感病毒,新城疫病毒(NDV)无交叉反应。目视检查绿色荧光与常规琼脂糖凝胶电泳的判定结果一致。整个扩增检测过程在35 min内即可完成。利用临床样本对RT-LAMP法进行验证,结果与RT-PCR一致。由实时浊度分析得到的标准曲线,计算出临床样本中的病毒质粒拷贝数均在2×107-2×104之间。因此,本研究建立的RT-LAMP方法快速、灵敏、特异性强,是H9亚型禽流感病毒的一种高效检测方法。     

一种含不同流感病毒血凝素抗原表位的核酸疫苗

流感病毒表面抗原血凝素( hemagglutinin,HA)是流感核酸疫苗重要的靶抗原,针对HA的保护性中和抗体主要由HA上的五个抗原表位诱导产生.在本文中,我们构建了一种以新甲型H1N1流感病毒HA1为骨架的含2个A/PR/8( H1N1)流感病毒HA抗原表位和3个新甲型H1N1流感病毒HA抗原表位的核酸疫苗,并在B...     

甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单抗杂交瘤细胞株的制备与初步鉴定

目的:建立具有高特异、高效价的甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(HA)单抗的杂交瘤细胞株。方法:以纯化的昆虫杆状病毒表达的甲型H1N1流感病毒HA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法筛选阳性克隆,经ELISA和Western blot分析单抗的特性和特异性。结果:获得6株甲型H1N1流感HA抗原特异单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗原肽库ELISA检测结果表明其中3株(1E12,3F12,1C11)单抗只与甲型H1N1流感HA抗原肽库反应,不与H5N1病毒HA抗原肽库反应;Western blot分析表明,单抗1B3只特异识别甲型H1N1流感HA抗原,而与其他季节性甲流病毒(H1,H3)及人禽流感H5N1病毒不反应。结论:所获杂交瘤细胞株特异性强,效价高,分泌抗体性能稳定,为分析甲型H1N1流感病毒抗原性位点、建立诊断试剂奠定了基础。     

一株2011年出现的季节性甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素基因特性的研究

本文通过比较2011年分离培养的1株季节性甲型H1N1流行性感冒(简称流感)病毒(A/Shanghai/1167/2011(H1N1))与历年季节性甲型H1N1流感病毒的血凝素(HA)基因,追溯该病毒的基因变异与来源,探讨该毒株的出现对流感防控工作的意义.采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增病毒的HA和神经氨酸酶(NA)片段,并进行测序;应用分子生物学软件对获得的序列进行分析,绘制基因进化树;同时,通过血凝抑制试验检测2011年下半年健康人群中该流感病毒的抗体水平.结果显示,A/Shanghai/1167/2011(H1N1)的HA基因序列与世界卫生组织(WHO)2007～2008年季节性甲型H1N1流感病毒疫苗株A/Brisbane/59/2007(H1N1)最接近,同源性达99.2%,与新型甲型H1N1流感病毒A/California/07/2009疫苗株同源性仅为72.4%.其HA基因裂解位点为PSIQSR↓GLF,尚未出现高致病性的分子特征.HA片段共编码557个氨基酸,有9个潜在的糖基化位点,序列与2009年前WHO疫苗株A/NewCaledonia/20/1999(H1N1)、A/SolomonIslands/3/2006(H1N1)和/Brisbane/59/2007(H1N1)相比,分别有15、12和4处不同,这些差异分布在Sa、Sb、Ca1、Ca2、Cb 5个抗原决定簇的氨基酸差异分别有5、5和2处.该毒株在健康人群血清的抗体阳性率为34.33%,几何平均效价(GMT)为10.38.A/Shanghai/1167/2011(H1N1)是2011年出现在上海地区的一个季节性甲型H1N1流感病毒毒株,其抗原变异与既往季节性甲型H1N1流感病毒相比不大,但在以A(H1N1)pdm09为主要流行株的年份检测到散在发生的既往季节性甲型H1N1流感病毒毒株应当引起重视,其在人群中的抗体水平较低,易引起流行,需要提高对类流感人群中此种毒株的持续监测.     

甲型流感病毒流行毒株检测和分型基因芯片的研制

【目的】研制一种可同时对甲型流感病毒H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2等5种流行亚型进行检测和分型的基因芯片。【方法】根据National Center for Biotechnology Information中Influenza Virus Resource数据库,针对H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2等5种亚型甲型流感病毒的HA和NA基因设计46条特异性寡核苷酸探针和1条质控探针,点制成基因芯片。利用通用引物扩增流感病毒HA和NA基因,使用Klenow酶对扩增产物进行荧光标记和片段化,将标记后产物和芯片杂交,清洗、扫描后根据荧光信号判定检测结果。用18株不同种属来源的甲型流感病毒分离毒株和186份咽拭子对芯片特异性、敏感性和临床应用进行初步评价。【结果】所有18株分离毒株均能被芯片准确检测并分型,芯片检测灵敏度能达约1×104个病毒基因拷贝。同时8份咽拭子检测结果为H1N1阳性,4份咽拭子为H3N2阳性。【结论】研究表明该芯片具有较高的特异性和灵敏度,可为甲型流感病毒的监测提供一种有效的方法。