稳定表达Cas9蛋白的SW620细胞株构建

摘要 目的：建立稳定表达Cas9蛋白的SW620人结肠癌细胞系的单克隆细胞株,提高基因编辑效率,为利用基于CRISPR/Cas9技术的高通量筛选结肠癌相关致病基因提供细胞工具。方法：用Cas9慢病毒侵染SW620细胞系,用致死剂量的puro筛选5-7天,通过有限稀释法获得单克隆细胞株。提取单克隆细胞基因组进行Sanger测序,筛选出含有Cas9基因序列的单克隆细胞株。利用基于SSA修复荧光素酶的报告系统检测单克隆细胞株中Cas9的编辑活性,并通过细胞增殖实验检测Cas9蛋白的表达是否影响细胞增殖。结果：获得了两个表达Cas9蛋白的SW620单克隆细胞株,并通过Sanger测序验证了Cas9序列;荧光素酶报告系统检测显示单克隆细胞株的Cas9蛋白有较高的编辑活性;细胞增殖实验显示Cas9蛋白的表达对SW620增殖活性影响不大。结论：本研究利用慢病毒感染的方式,构建了稳定表达Cas9蛋白的SW620单克隆细胞株,为后续大规模筛选与人结肠癌相关的基因突变提供了细胞工具。     

慢病毒载体的构建及其介导的绿色荧光蛋白在胰岛β细胞中的表达

目的 获得能够在大鼠胰岛β细胞中高效表达的慢病毒载体。方法 以PCR的方法扩增绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）片段,并将其通过穿梭质粒装入pLenti6／V5表达质粒,然后用脂质体转染试剂将plenti6／V5 GFP、pLP1、pLP2以及pLP／VSVG转染入293FT细胞,获得的病毒用人纤维瘤细胞系的HTl080细胞进行滴定。然后用一定滴度的慢病毒转导大鼠胰岛β细胞系INS-1,观察转导效率。结果 通过限制性内切酶和琼脂糖凝胶电泳方法,观察到所克隆入pLenti6／V5表达质粒的GFP片段大小正好与PCR扩增出的片段一致。经测序验证,序列与NCBI网站上GFP序列完全一致。转染结果显示,经293FT细胞所产生的慢病毒,转导效率达到80％以上。而在1×10^6／ml病毒颗粒的情况下,AAV—GFP病毒几乎不能转导β细胞。结论 与同一滴度的AAV—GFP病毒相比,胰岛β细胞的转导效率有非常显著的差异。即慢病毒载体表达系统在对胰岛β细胞转导的能力上,明显优于重组腺辅病毒表达系统。表明慢病毒载体在糖尿病基因治疗中,特别是对胰岛β细胞的转基因工作中,有着良好的应用前景。     

人干细胞因子受体c-Kit稳定表达细胞株的构建

 干细胞因子 (SCF)是一种重要的造血因子 ,其受体c Kit具有酪氨酸激酶活性 .SCF c Kit介导的细胞内信号转导在造血、肥大细胞的生成及其功能、以及生殖细胞和黑色素细胞的发育中起着关键的作用 .通过构建人c kitcDNA的pcDNA3.1真核表达载体 ,转染不表达人c kit的小鼠髓系祖细胞FDC P1.经Zeocin抗性筛选 ,PCR、RT PCR、Western印迹分析、流式细胞仪分析等方法检测到人c kit基因的稳定整合和表达 ,并分布于细胞表面 ,证明获得了稳定表达人c Kit受体的细胞株 .用MTT法检测重组细胞株增殖特性 ,表明重组人SCF可刺激其增殖 .为进一步研究人c Kit受体介导的细胞内信号转导及检测重组人干细胞因子生物学活性提供了有效的细胞模型     

在表达HCV Core蛋白的肝癌细胞中建立Notch1低表达稳定转染细胞株

目的筛选并包装Notch1基因shRNA低表达的慢病毒,感染稳定表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心蛋白(core)的肝癌细胞,在此基础上建立低表达Notch1基因的SMMC7721-Core稳定转染细胞株。方法设计针对Notch1基因mRNA的干扰序列,并将其连接入载体质粒,转染HEK293T细胞,构建带有Notch1基因的慢病毒表达载体,感染稳定表达HCV Core蛋白的人肝癌细胞株SMMC7721-Core,采用定量聚合酶链反应(quantitative PCR,qPCR)和免疫印迹法(Western blot)检测干扰效果。结果构建了带有干扰Notch1基因的慢病毒表达载体,感染SMMC7721-Core细胞后筛选获得稳转细胞株,qPCR测得Notch1 mRNA低表达,Western blot检测到Notch1蛋白低表达。结论成功构建了Notch1低表达SMMC7721-Core人肝癌稳定转染细胞株,为进一步开展对HCV Core蛋白诱导肝癌过程中Notch1所起作用的研究提供了依据。     

降低TGFβ1表达后对大鼠糖尿病症状改变的研究

目的：探讨降低TGFβ1的表达后,对大鼠糖尿病模型病症的改变情况,为研究TGFβ1与糖尿病发病之间提供实验数据。方法：采用腹腔注射链脲佐菌素,建立糖尿病大鼠模型,慢病毒包装TGFβ1-shRNA干扰载体,优选后皮下注射大鼠模型,以慢病毒空载shRNA注射大鼠模型作对照;检测1-5周左右两组大鼠体重和血糖变化;摘取大鼠胰腺,HE染色光学镜下观察组织形态学改变情况。结果：用RNAi沉默TGFβ1表达后,与对照组相比,干扰组大鼠体重下降较缓,血糖持续下降;HE染色可见干扰组大鼠胰岛形态较空载组稍好,分泌细胞数量稍多。结论：TGFβ1对糖尿病的发病和进展起促进作用,当抑制TGFβ1表达后,可延缓糖尿病的进展。     

降低TGFβ1 表达后对大鼠糖尿病症状改变的研究

目的：探讨降低TGFβ1 的表达后,对大鼠糖尿病模型病症的改变情况,为研究TGFβ1 与糖尿病发病之间提供实验数据。方法：采用腹腔注射链脲佐菌素,建立糖尿病大鼠模型,慢病毒包装TGFβ1-shRNA干扰载体,优选后皮下注射大鼠模型,以慢病毒空载shRNA注射大鼠模型作对照;检测1-5 周左右两组大鼠体重和血糖变化;摘取大鼠胰腺,HE 染色光学镜下观察组织形态学改变情况。结果：用RNAi沉默TGFβ1 表达后,与对照组相比,干扰组大鼠体重下降较缓,血糖持续下降;HE 染色可见干扰组大鼠 胰岛形态较空载组稍好,分泌细胞数量稍多。结论：TGFβ1 对糖尿病的发病和进展起促进作用,当抑制TGF茁1 表达后,可延缓糖 尿病的进展。     

构建稳定表达RFP及嘌呤霉素抗性的K562细胞株

目的构建稳定表达红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）和嘌呤霉素（puromycin）抗性的K562．PM．RFP细胞株,便于慢性粒细胞性白血病研究中K562细胞的观察和筛选。方法采用PCR法获得RFP片段,将其插入到慢病毒pGC-FU-3FLAG-IRES—Puromycin载体中获得pGC—PM—RFP重组质粒,经脂质体转染到293T细胞中获得慢病毒LV—PM—RFP,有限稀释法检测慢病毒在293T细胞中的转染效率,用包装获得的慢病毒感染K562细胞,经嘌呤霉素筛选获得RFP阳性的K562-PM—RFP细胞株。结果PCR及测序结果证实目的基因RFP正确克隆至慢病毒质粒中,经慢病毒LV—PM-RFP感染的K562细胞能在嘌呤霉素抗性培养基中存活,并稳定表达RFP。结论成功构建了慢病毒重组质粒pGC—PM-RFP,并获得了携带RFP及嘌呤霉素抗性基因的K562-PM—RFP细胞株。     

大鼠海马神经细胞VDAC1基因shRNA慢病毒表达载体的构建及干扰效果评价

目的:构建线粒体电压依赖性阴离子通道(VDAC1)短发卡样RNA重组慢病毒(LV)载体,沉默海马神经细胞VDAC1基因表达,观察所构建的慢病毒载体对海马神经细胞的干扰效果。方法:根据基因库提供的大鼠VDAC1基因的核苷酸序列(序列号为：AB039662.1),设计合成3条LV3-VDAC1-shRNA及1条无义的阴性表达载体;将构建好的慢病毒载体转染到海马神经细胞,按照不同的转染条件对细胞分为空载组、对照(NC)组、病毒组,分别在病毒感染复数(MOI)值在100和10的条件下进行转染;采用荧光定量PCR和Western blot的方法分别检测VDAC1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。结果:与空载组相比,慢病毒感染组的扩增倍数均大于1,VDAC1基因在mRNA水平与蛋白水平表达均明显升高(P<0.05);与对照组相比,病毒感染复数(MOI)=10与MOI=100之间没有显著差异(P>0.05);PCR结果与Western blot结果综合来看,VDAC1转录水平表达越高,蛋白水平表达越低,呈现反向关联的状态。结论:三种慢病毒对海马神经细胞都有干扰效果,VDAC1基因的mR...     

Rhox5基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的:构建同源异性框基因Rhox5的真核表达质粒,转染NIH3T3细胞,建立稳定过表达Rhox5的细胞系。方法:PCR方法扩增Rhox5的全长cDNA序列,PCR产物双酶切后和人工合成的HA抗原表位标签共同克隆至pcDNA3.1(-)哺乳动物细胞表达载体中,构建pcDNA-Rhox5-HA融合表达质粒。脂质体法将经过测序成功的pcDNA-Rhox5-HA融合质粒和pcDNA3.1空载体分别转染NIH3T3细胞,潮霉素B筛选后建立阴性对照pcDNA3.1 in NIH3T3和稳定过表达Rhox5的Rhox5-HA in NIH3T3细胞系。RT-PCR和western blotting方法检测Rhox5-HA在稳定转染细胞系中的表达情况。结果:成功构建了pcDNA-Rhox5-Myc重组质粒,获得稳定过表达Rhox5的NIH3T3细胞系。RT-PCR和Western blotting结果表明,构建的稳定细胞系中成功表达Rhox5-HA融合蛋白。结论:Rhox5基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达为进一步体外研究Rhox5蛋白单独的功能及其与其他分子间功能性相互作用奠定了实验基础。     

p16真核表达载体的构建及其稳定表达的NIH3T3细胞株的建立

目的　构建pCR○R3 1 p16真核表达质粒 ,并建立其稳定表达的NIH3T3细胞株。方法　将人的p16cDNA亚克隆至pCR○R3 1,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌 ,筛选阳性克隆 ,进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定及DNA测序 ,将已鉴定的pCR○R3 1 p16经脂质体介导转染至NIH3T3细胞中。结果　重组质粒双酶切后 ,出现约 80 0bp片段 ,提示p16cDNA片断已插入pCR○R3 1多克隆位点内 ,DNA测序显示p16cDNA按照正确方向和阅读框插入表达载体pCR○R3 1。通过pCR○R3 1 p16转染NIH3T3细胞 ,获得 10个G4 18抗性克隆 ,其中 2个为RT PCR阳性。结论　成功构建pCR○R3 1 p16真核表达载体并建立了其稳定表达的NIH3T3细胞株。为建立p16转基因鼠奠定基础。     

稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系的建立及鉴定

目的构建人c-jun氨基末端激酶3（c-jun N—terminal kinase 3,JNK3）真核表达载体,并在人神经母细胞瘤细胞（SHSY5Y）中稳定表达以探讨JNK3对细胞凋亡的影响。方法以pDBleu—JNK3为模板,PCR扩增人JNK3基因全长,目的片段亚克隆至真核表达载体pEGFP—C3,酶切及测序鉴定。Lipofeetamine^TM 2000转染SHSY5Y细胞,并通过G418选择性培养建立稳定表达JNK3的SHSY5Y细胞系,荧光垃微镜下观察细胞中JNK3表达,RT—PCR、Western印迹检测JNK3表达。结果成功构建了pEGFP—C3-JNK3真核表达载体,并建立了稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系,与对照组相比,其人JNK3基因表达明显升高。结论稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系的建立,为进一步研究人JNK3的功能及其与细胞凋亡的关系提供了重要的细胞模型和实验基础。     

稳定表达重组小鼠FAPα蛋白细胞株的构建

采用RT-PCR方法从BALB/c胚鼠成纤维细胞克隆FAPα基因,将其连接至表达栽体pTd-FL-N,转化Stbl3感受态.筛选重组质粒,经酶切、PCR检测及测序鉴定,证实表达质粒构建正确.将表达载体转染HEK293细胞,经G418筛选单克隆阳性细胞,采用Western blot技术证实稳定表达FAPα细胞株构建成功.通过流式细胞术确定FAPa蛋白可定位表达于细胞膜上.     

稳定表达Syncytin的EL4细胞系的建立及鉴定

Syncytin是人类内源性逆转录病毒W家族的囊膜蛋白。近期研究发现Syncytin与白血病密切相关。为研究Syncytin的生物学功能,我们克隆了人syncytin,并连接到pIRES2-EGFP质粒上,转化该质粒至感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆进行PCR、酶切电泳和DNA测序鉴定,成功构建了表达syncytin基因的真核表达载体。利用罗氏转染试剂转染重组质粒至EL4细胞,并通过G418选择性培养基筛选,在荧光显微镜下观察细胞中Syncytin表达,用RT-PCR、Western blot检测Syncytin表达水平,结果显示我们成功构建了稳定表达人Syncytin的EL4细胞系。稳定表达人Syncytin的EL4细胞系的建立,为进一步研究人Syncytin功能及其与白血病免疫逃逸的关系提供了重要的细胞模型和实验基础。     

睾丸特异蛋白GGN1稳定表达细胞株的建立

GGN1是1种功能未知的睾丸特异表达蛋白,它是睾丸特异性基因Ggn的表达产物。Ggn基因的原初转录产物有多种剪接方式,并最终翻译产生3种蛋白,GGN1就是其中的1种。研究发现Ggn的表达与精子的生成过程紧密相关。GGN1还可以与多种蛋白相互作用,其中包括FANCL,GGNBP1,GGNBP2和OAZ3。为了能够在体外更方便的研究Ggn及其相关基因的功能,通过脂质体转染和G418加压法筛选获得了能稳定表达pEGFP-N2／GGN1的CHO—K1细胞株。     

狂犬病病毒糖蛋白哺乳动物细胞稳定表达细胞系建立

试验首先根据GenBank上所发表的狂犬病病毒CVS-24株糖蛋白基因序列,设计并合成一对特异性引物,通过反转录 聚合酶链式反应（RT-PCR）,获得糖蛋白全长cDNA,连接在pMD18-T载体上,测序证明克隆的正确性后,将其插入真核表达载体pIRES1neo,构建了糖蛋白单一表达载体pICG,表达质粒通过脂质体转染BHK-21细胞,在G418抗性压力下出现细胞克隆,通过PCR检测,确定启动子与糖蛋白基因在细胞基因组中共同整合。借助Western blot检测,证明所表达的糖蛋白与狂犬病抗血清有特异的反应性。采用间接ELISA法,筛选出3株高效表达糖蛋白的细胞株,分别命名为ICG1、ICG2、ICG3。     

稳定表达鼠源PLEKHA1细胞系的建立及其对细胞迁移的影响

目的：构建稳定表达鼠源PLEKHA1的RAW264.7小鼠巨噬细胞系,探讨PLEKHA1过表达对巨噬细胞迁移的影响。方法：根据小鼠PLEKHA1基因序列设计引物,克隆其编码区序列,酶切后插入pCDH载体,在293FT细胞中进行病毒的包装,用获得的高滴度慢病毒感染RAW264.7细胞,建立能稳定高效表达PLEKHA1的RAW264.7细胞系;在此基础上,观察PLEKHA1对巨噬细胞迁移的影响。结果：经基因克隆、酶切、连接后,构建了鼠源PLEKHA1重组慢病毒表达载体,包装病毒感染RAW264.7细胞,经嘌呤霉素筛选后免疫印迹检测,RAW264.7细胞中PLEKHA1的蛋白表达提高近30倍;同时,发现PLEKHA1的过表达影响RAW264.7细胞的迁移。结论：构建了稳定表达小鼠PLEKHA1的RAW264.7细胞系,PLEKHA1过表达降低RAW264.7细胞的迁移能力。     

流感病毒NS1蛋白稳定表达的A549细胞系建立

A型流感病毒的NS1(Nonstructurol 1 protein,NS1)蛋白是病毒复制、毒力等的重要调节蛋白.运用RT-PCR方法扩增A/Beijing/501/2009(H1N1)流感病毒NS1基因,克隆至真核表达载体pCMV-HA,用Lipofectamine2000将线性化pCMV-HA-NS1与neo基因共同转染A549细胞,通过G418筛选获得阳性重组细胞,并采用PCR、RT-PCR、Western blot技术检测重组细胞中NS1蛋白的表达,通过免疫荧光技术观察NS1蛋白在细胞中的定位.PCR、RT-PCR检测显示NS1基因成功整合进入细胞基因组,并转录为mRNA;Western blot检测显示重组细胞系稳定表达NS1蛋白,免疫荧光显示NS1蛋白定位于细胞核内.表明通过G418筛选,成功构建稳定表达NS1蛋白的重组A549-HA-NS1细胞系,且NS1蛋白定位于细胞核内,为进一步研究NS1蛋白的生物学功能奠定基础.     

慢病毒介导的稳定表达LBH的前列腺癌细胞株的建立

目的:构建稳定表达LBH基因的人前列腺癌细胞株PC-3M-LBH,探讨LBH基因对PC-3M细胞增殖能力的影响。方法:构建表达LBH基因的重组慢病毒载体并制备出相应的慢病毒,感染低表达LBH基因的人前列腺癌PC-3M细胞后,经嘌呤霉素筛选获得细胞克隆;实时荧光定量PCR和蛋白印迹法(Western-Blot)分别检测细胞株中LBH的mRNA、蛋白表达水平;采用CCK-8法检测表达LBH基因后细胞增殖能力的改变。结果:成功构建了重组慢病毒表达质粒p Lenti-LBH并包装出了慢病毒,感染前列腺癌细胞后经嘌呤霉素筛选得到PC-3M-LBH细胞株;PC-3M-LBH细胞株中LBH基因的mRNA和蛋白表达显著上调;相对母细胞和NC对照组,PC-3M-LBH细胞在接种后第4天即出现明显的生长抑制,到第6天其生长抑制率达到19.7%。结论:构建的细胞株能稳定表达LBH基因,该基因的表达能显著抑制前列腺癌PC-3M细胞的体外增殖。     

MEKK3稳定表达细胞株的建立及其对A549细胞增殖的影响

目的 构建人MEKK3基因编码区序列（cDNA）的真核表达载体、建立其稳定表达细胞株并观察其对肺腺癌细胞增殖的影响.方法 从A549细胞中提取总RNA,应用RT-PCR扩增MEKK3 cDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/hygro（＋）质粒中,构建成MEKK3基因的真核表达载体,然后转染入人肺腺癌A549细胞中,潮霉素筛选稳定转染克隆,通过MTT实验,研究转染MEKK3基因前后细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确无误,Western印迹检测结果显示MEKK3基因在A549细胞中具有良好的表达;荧光实时定量PCR结果表明MEKK3基因在其稳定转染的A549细胞克隆中表达上调,与空载体稳定转染及未转染细胞比较,差异具有统计学意义（P＜0.05）;MTT结果显示MEKK3表达上调的稳定克隆组,A549细胞的增殖活性显著增强（A570=0.876 1±0.074 5）,明显高于空载体稳定转染组（A570=0.582 8±0.070 3）及未转染亲代细胞组（A570=0.584 9±0.035 2）,差异具有统计学意义（P＜0.01）,而后两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 MEKK3表达上调可导致肺腺癌细胞的增殖增强.