碱基编辑器的开发及其在细菌基因组编辑中的应用

碱基编辑器是近两年发展起来的新型基因组编辑工具,它将碱基脱氨酶的催化活性和CRISPR/Cas系统的靶向特异性进行结合,催化DNA或RNA链上特定位点的碱基发生脱氨基反应,进而完成碱基的替换。碱基编辑器分为DNA和RNA碱基编辑器两大类,其中DNA碱基编辑器分为两种:胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器;前者可以实现胞嘧啶到胸腺嘧啶的转换,而后者则可以将腺嘌呤突变为鸟嘌呤。由于DNA碱基编辑器不会造成DNA的双链断裂(DSB),也不依赖于宿主的非同源末端修复和同源重组途径,因此,大大减少了DSB相关的编辑副产物,如小片段插入或缺失等。基于CRISPR/Cas系统的RNA碱基编辑器,可以实现RNA链上腺嘌呤核苷到次黄苷的转换。本文对不同类型碱基编辑器的开发过程、适用范围和编辑特点等进行梳理,并对其在细菌基因组编辑中的应用进行了介绍;最后简要探讨了细菌中碱基编辑器的缺点以及将来可能的研究方向。     

碱基编辑器在基因治疗中的潜在安全性风险及解决方案研究进展

碱基编辑器(base editor, BE)是一种由脱氨酶与人工核酸结合蛋白结合形成的基因编辑工具,可以对单个碱基进行定点替换,以达到改变核酸序列的目的。其主要特点是能够在不产生核酸完全断裂的条件下,进行高效的碱基编辑,BE在动植物育种以及遗传性疾病的基因治疗领域已经显示出巨大的应用价值。目前已报道的碱基编辑器包括胞嘧啶碱基编辑器、腺嘌呤碱基编辑器、糖苷酶碱基编辑器、双碱基编辑器、线粒体碱基编辑器以及RNA编辑器等。然而,各种碱基编辑器中含有的两个主要功能元件,即脱氨酶和人工核酸结合蛋白,均有脱靶效应,为本技术的广泛应用带来严重的安全隐患。本文通过对不同碱基编辑工具的种类特点、疾病模型治疗现状以及安全性问题和解决方案进行综述,希望对后续的碱基编辑技术的优化研究提供参考。     

BE3型胞嘧啶碱基编辑器在谷氨酸棒杆菌中的开发及应用

碱基编辑技术结合了CRISPR/Cas系统的靶向特异性与碱基脱氨酶的催化活性,因其不产生双链DNA断裂、不需要外源DNA模板、不依赖同源重组修复,自开发以来,便受到研究者的追捧,在哺乳动物细胞、植物、微生物等领域相继得到开发与应用。为了进一步丰富碱基编辑系统在谷氨酸棒杆菌中的应用,将鼠源胞嘧啶脱氨酶(rAPOBEC1)与nCas9蛋白融合,实现了在谷氨酸棒杆菌中C到T的编辑,编辑比例较低(0-20%);在上述融合蛋白C端添加UGI蛋白,构建BE3型胞嘧啶碱基编辑器,抑制体内的DNA碱基切除修复机制,显著的提高了碱基编辑效率,使得C到T的碱基编辑效率高达90%;为了简化操作,将双质粒碱基编辑系统优化为单质粒碱基编辑系统,并显著提高转化效率;最后通过单质粒碱基编辑系统对基因组中其他位点的编辑测试,进一步证明了BE3型碱基编辑器在谷氨酸棒杆菌中的高效性,同时发现该碱基编辑器具有较宽的编辑窗口(PAM上游-11到-19位),有助于覆盖更多的基因组靶标位点,为谷氨酸棒杆菌的基因组改造提供了更多的工具选择。     

碱基编辑系统研究进展

碱基编辑技术(base editing)是基于CRISPR/Cas系统发展起来的新型靶基因修饰技术,目前依据碱基修饰酶的不同可分为胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor, CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor, ABE)。这两类碱基编辑系统利用胞嘧啶脱氨酶或人工进化的腺嘌呤脱氨酶对靶位点进行精准的碱基编辑,最终可以分别实现C-T (G-A)或A-G (T-C)的碱基替换。碱基编辑技术自2016年被开发以来,因其高效、不依赖DNA双链断裂产生、无需供体DNA参与等优势,已经成功应用在各种动物、植物及其他生物中,为基因治疗及精准作物育种等领域提供了重要技术支撑。本文从碱基编辑技术的特点、开发过程、优化、应用、脱靶效应及改善策略等方面进行了系统介绍,最后对未来需要迫切解决的一些问题进行了分析和展望,以期为相关领域的科研人员进一步了解、使用及优化碱基编辑系统提供参考。     

基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑技术及其在生物医学和农业中的应用

近年来,基于成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas)的基因编辑技术飞速发展,该系统可以利用同源定向重组(Homology directed repair,HDR)来完成其介导的精准编辑,但效率极低,限制了其在农业和生物医学等领域上的推广应用。基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑技术作为一种新兴的基因组编辑技术,能在不产生双链断裂的情况下实现碱基的定向突变,相对于CRISPR/Cas介导的HDR编辑具有更高的编辑效率和特异性。目前,已开发出了可将C碱基突变为T碱基的胞嘧啶碱基编辑器(Cytidine base editors,CBE),将A碱基突变为G碱基的腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editors,ABE),以及可实现碱基任意变换和小片段精准插入和缺失的Prime编辑器(Prime editors,PE)。另外,能实现C到G颠换的糖基化酶碱基编辑器(Glycosylase base editors,GBE)以及能同时编辑A和C两种底物的双碱基编辑器也已被开发出来。文中主要综述了几种DNA碱基编辑器的开发历程、研究进展及各自优点和局限性;介绍了DNA碱基编辑技术在生物医学以及农业中的成功应用案例,以期为DNA碱基编辑器的进一步优化和选择应用提供借鉴。     

基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术研究进展*

基于CRISPR/Cas系统出现的单碱基编辑技术可以实现高效且简便的单个碱基的替换编辑,其原理是将胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)或腺苷脱氨酶(adenosine deaminase)与Cas9n(D10A)形成融合蛋白,通过CRISPR/Cas精准识别和定位DNA上的靶位点后,利用胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶将靶点距离sgRNA位点基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列端的4~7位的单个碱基发生单碱基转换或颠换。对基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术发现的历史、组成和分类、工作原理进行了概述,并总结了该系统最新进展及应用。     

基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术研究进展*

基于CRISPR/Cas系统出现的单碱基编辑技术可以实现高效且简便的单个碱基的替换编辑,其原理是将胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)或腺苷脱氨酶(adenosine deaminase)与Cas9n(D10A)形成融合蛋白,通过CRISPR/Cas精准识别和定位DNA上的靶位点后,利用胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶将靶点距离sgRNA位点基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列端的4~7位的单个碱基发生单碱基转换或颠换。对基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术发现的历史、组成和分类、工作原理进行了概述,并总结了该系统最新进展及应用。     

毕赤酵母胞嘧啶碱基编辑器的设计与功能评价

【目的】在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中建立一套分子靶向突变系统，为毕赤酵母的基因工程改造提供高效的编辑工具。【方法】基于规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease，CRISPR/Cas9）技术，设计并构建nCas9与胞苷脱氨酶融合表达的胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor，CBE），并选择酵母基因组中富含碱基C的一段序列作为靶标以评价CBE的碱基编辑功能。电转化酵母后，利用高通量测序技术分析CBE的编辑效率及编辑模式，并进一步探究连接肽长度、融合蛋白相对位置和gRNA靶向序列（即spacer）长度等因素对CBE功能的影响。【结果】nCas9与PmCDA1融合组成的CBE能够实现毕赤酵母基因组碱基C的高效编辑。当连接肽长度为（GGGGS）₁₀时，CBE的编辑效率最高，编辑窗口位于前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）远端的C20–C14之间，其中C18的编辑效率可达85.1%。nCas9与PmCDA1相对位置的改变对CBE的编辑效率和编辑模式的影响不大。而gRNA靶向序列长度影响着CBE的编辑效率，且gRNA靶向序列长度不能低于17 nt，但19–23 nt之间均可引导CBE对基因组的高效编辑。【结论】本研究在巴斯德毕赤酵母中构建了一套具有高效碱基编辑活性的胞嘧啶碱基编辑器，为基于毕赤酵母的基础和应用研究提供了工具支持。     

单碱基编辑技术的原理、发展及其在家畜育种中的应用

基因编辑技术CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)在家畜育种领域得到广泛应用,但其效率低下,且存在非靶向切割、安全性较低等问题,极大地限制了家畜育种中单碱基突变的引入。单碱基编辑(single base editing)作为一种最新的基因编辑工具,能够在不导入双链断裂的情况下直接进行碱基的替换,具有编辑效率高和特异性强的特性,为家畜育种的精确基因修饰提供了一种更简单、更有效的方法。本文主要介绍了单碱基编辑系统的原理及发展进程和碱基编辑技术在家畜育种中的应用,以期为单碱基编辑器在家畜育种中进一步优化和选择应用提供参考。     

碱基编辑系统研究最新进展及应用

CRISPR系统能够在基因组DNA中完成精准编辑,但依赖于细胞内的同源重组(Homologydirected recombination,HDR)修复途径,且效率极低。基于CRISPR/Cas9系统开发的碱基编辑技术(Base editing)通过将失去切割活性的核酸酶与不同碱基脱氨基酶融合,构建了两套碱基编辑系统(Baseeditors,BE):胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)。这两类编辑器分别能够在不产生DNA双链断裂的前提下在基因靶位点完成CT (GA)或AG (TC)的替换,最终实现精准的碱基编辑。目前碱基编辑技术已经广泛应用于基因治疗、动物模型构建、精准动物育种和基因功能分析等领域,为基础和应用研究提供了强大的技术工具。文中概括了碱基编辑技术的研发过程、技术优势、应用现状、存在问题及改进策略,以期为相关领域的科研人员了解和使用碱基编辑系统提供参考。     

计算生物学分析在基因组编辑研究中的应用

基因组编辑是对基因组遗传信息进行定向改造的技术,其中CRISPR/Cas系统是目前应用最广泛的基因组编辑新技术。将先进的高通量测序以及相关计算生物分析应用于基因编辑研究,可进一步优化基因编辑效率和精度等检测流程,实现对全基因组功能基因筛选的监测。同时,利用基于生物信息及机器学习和深度学习等新方法,可对向导RNA(gRNA)的高效设计和实现对编辑效果的预测。本文将对计算生物学分析在CRISPR/Cas基因编辑系统的应用及研究进展等进行概述。     

“人造精子”介导基因编辑技术的建立与应用

"人造精子",即小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞,是一种可在体外长期培养扩增和进行遗传操作的细胞,因其具备胚胎干细胞自我更新和多向分化的特性,并拥有代替精子使卵母细胞"受精",产生半克隆小鼠的能力,而被广泛应用于生命科学研究的各个领域。与CRISPR-Cas9技术相结合,"人造精子"能够同时实现细胞水平和动物水平的复杂基因编辑,因此可作为一个有力的研究工具。本文就"人造精子"技术的建立与改进、在基因编辑方面的应用,以及全基因组标签计划的提出与进展展开综述。     

一种强力霉素诱导型白念珠菌基因敲除与筛选标记再循环工具包（英文）

【目的】在白念珠菌中建立一个快捷方便经济的基因敲除与筛选标记再循环的DNA操作系统。【方法】通过ExoIII介导的不依赖于连接酶的克隆策略,在异源筛选标记基因CmLEU2、CdHIS1和CdARG4基因的两侧分别插入了loxP位点,成为筛选标记基因盒扩增的模板。全基因合成了经过白念珠菌密码子优化的rTetR元件,并组装成Tet-on启动子。将密码子优化的重组酶Cre基因置于该启动子控制下。然后将他们插入筛选标记基因CdHIS1和CdARG4的CDS区域,形成筛选标记基因再循环载体。【结果】构建了3个用于白念珠菌基因敲除的侧翼含有loxP位点的筛选标记基因载体,以及2个含有Tet-on启动子控制的Cre酶的载体用于筛选标记基因的再循环。【结论】成功构建了一个白念珠菌中可诱导的基因敲除和筛选标记再循环的载体系统并成功应用于多个基因缺失株构建。这个系统有助于快速构建白念珠菌的单基因和多基因敲除菌株。     

转录因子ZnF-706在鳞翅目昆虫中的进化格局及在家蚕中的功能

【目的】探讨家蚕Bombyx mori的潜在驯化基因——转录因子ZnF-706在鳞翅目(Lepidoptera)昆虫进化过程及家蚕驯化过程中的分子进化格局;并基于CRISPR/Cas9家蚕基因组编辑平台,探讨ZnF-706基因在家蚕中的功能。【方法】首先分析了家蚕ZnF-706序列特征,并利用已发表芯片数据调研该基因在家蚕幼虫组织中的表达格局;利用Phylogenetic Analysis byMaximum Likelihood (PAML)分支检验方法,分析该基因在鳞翅目不同类群中的分子进化格局。基于已发表的家蚕-野桑蚕Bombyx mandarina群体基因组多态性数据,对ZnF-706进行基因区域人工选择信号分析;对ZnF-706基因上游2 kb的调控区域进行单核苷酸多态性位点频率检测,发掘在家蚕群体中固定下来的突变位点;针对突变位点所在区域进行转录因子结合活性预测。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除ZnF-706基因,获得纯和突变体;以野生型家蚕为对照,检测突变体的茧重及蛹重变化。【结果】家蚕ZnF-706的编码蛋白具有典型的锌指蛋白结构域。ZnF-706在家蚕5龄第3天幼虫各组织中广泛表达,尤其表皮、脂肪体和生殖腺中有很高的表达量;该基因在鳞翅目、蚕蛾总科(Bombycoidea)及天蚕Antherea yamamai 3个分支中均呈现快速进化信号,在家蚕中有强烈的人工选择信号。该基因所在基因组区域的家蚕-野桑蚕种群分歧度参数Fst明显升高,家蚕群体中的群体多样性π明显降低,表明它位于一个选择扫荡区域内;该基因在家蚕-野桑蚕中的9个SNP位点存在于上游调控区,并位于转录因子结合活性区域内。该基因的纯合家蚕突变体ΔZn F-706生存力减弱,并且茧重以及蛹重与野生型家蚕相比都显著降低。但与黑腹果蝇Drosophila melanogaster中不同的是,家蚕中该基因的突变并不致死。【结论】ZnF-706可能在鳞翅目尤其是泌丝昆虫中进化,并在家蚕驯化过程中受到选择压力,提示其对于特征性状茧丝的变异可能发挥作用。该基因可能通过对丝蛋白基因的直接调控,或通过影响家蚕的生长发育而间接地影响茧丝性状。本研究不仅为探究家养动物人工选择机制提供了来自昆虫类材料的独有证据,也为后续深入开展家蚕重要经济性状的转录调控研究提供线索。     

斑马鱼胚胎背腹轴建立的分子机制

脊椎动物胚胎发育起始于体轴的建立,是胚胎早期发育过程中最重要的事件之一。Wnt、BMP、Nodal和FGF等多个信号通路协同调控细胞分化和细胞运动,促进胚胎胚层的形成和空间上的分离,调控胚胎背腹轴、前后轴和左右轴线的分化,为胚胎进一步发育勾勒出蓝图。本文主要综述斑马鱼胚胎背腹轴建立的分子机制,包括背部组织中心简介;母源Wnt/β-catenin信号调控背部组织中心形成的分子机制;BMP信号调控背腹轴建立的分子机制。     

Immunomodulated signaling in macrophages: Studies on activation of Raf-1, MAPK, cPLA2 and secretion of IL-12

Little is known about the mechanism and signal transduction by LPS-mediated immunomodulation of murine peritoneal macrophages. It is found that the signal molecules of the down-stream of Ras, Raf-1, MAPK p44, and MAPK p42 are phosphorylated, and cPLA₂ is activated with a significant increase of the release of [ H³ ] AA by macrophages in response to LPS and PMA. Compared with the very recent finding that LPS and PMA trigger the activation and translocation of PKC-α and PKC-ε, these findings suggest that there is a connection between PKC signaling pathway and the Raf-1/MAPK pathway and that the activation of these main signaling events may be closely related to the secretion of IL-12 during LPS-induced modulation of macrophages. Project supported by the National Natural Science Foundation of China, Shanghai Joint Laboratory of Life Science, Shanghai Institute of CeIl Biology, and Director’s Foundations of Chinese Academy of Sciences and Shanghai Institute of Cell Biology.     

一株小麦赤霉病拮抗菌的筛选鉴定及防治效果分析

自小麦赤霉病发病田块土壤中,分离得到1株小麦赤霉病高效拮抗菌株。通过形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列比对分析,将这株拮抗菌株鉴定为奇异变形杆菌(proteus mirabilis)。P. mirabilis DY05发酵液和无细胞上清均可显著抑制禾谷镰刀菌菌丝体生长(抑制率分别为79.50%和51.25%)和分生孢子萌发(抑制率均为100%),减少呕吐毒素产生(分别减少84.32%和82.82%)。田间赤霉病防治试验结果显示,接种DY05,可降低发病率52.13%,同时病情指数降低48.74%,显示出较好的防治效果。促生生理活性评价试验结果显示,菌株DY05可以产生铁载体和IAA,并具有溶磷作用和ACC脱氨酶活性,具有很好的促生长潜力。盆栽试验结果表明,菌株DY05对小麦植株生长具有显著的促进作用。与对照组相比,菌株DY05处理可以显著增加小麦幼苗茎高、根长、鲜重和干重,其中茎高、根长、鲜重和干重分别提高了22.21%、26.41%、44.77%和26.53%。分离得到的拮抗菌株DY05具有拮抗病原真菌和促进植物生长的双重功能,为开发禾谷镰刀菌生物防治制剂提供了菌种材料。     

沙冬青属植物响应非生物胁迫的蛋白质组学研究进展

沙冬青属植物具有抗寒、抗旱、抗盐碱等特性,是研究植物逆境胁迫和筛选天然抗逆基因库的理想材料。非生物胁迫是限制沙冬青属植物生长发育及地理分布的重要因素,研究沙冬青属植物响应非生物胁迫的蛋白质组学为发掘其相关抗逆蛋白质及探索抗逆机理奠定基础。通过对近年来国内外利用蛋白质组学技术研究沙冬青属植物应答逆境胁迫的相关成果进行总结归纳,综述沙冬青属植物对低温、干旱、高盐等非生物胁迫响应的蛋白质组学最新研究进展,探讨在非生物胁迫下沙冬青属植物蛋白质水平的动态变化,揭示特定的蛋白质网络以及相关逆境应答机制,并对蛋白质组学技术应用前景进行展望,以期为沙冬青属植物抗逆分子机制更深入、全面的研究提供参考依据。     

基于GAM模型的阿拉伯海鲐鱼渔场分布与环境关系

基于2016-2017年中国印度洋围拖网生产数据以及同期的海表温度、叶绿素、表层海流和海面高度数据,采用广义加性模型(Generalized Additive Model,GAM)建立了围网单位捕捞努力量渔获量(catch per unit effort,CPUE)对海洋环境的非线性响应模型,分析了阿拉伯海鲐鱼(Scomber australasicus)渔场分布与海洋环境关系.结果表明:空间因子和环境因子对阿拉伯海鲐鱼渔场有显著影响,GAM模型的方差解释率为30.1%;印度洋季风对鲐鱼CPUE影响大,鲐鱼CPUE在印度洋东北季风高,在夏季季风低;全年阿拉伯海鲐鱼围网渔场主要分布在60°E、13°N-15°N斜向椭圆区域;模型表明,鲐鱼渔场适宜海表温度为26~28℃,叶绿素浓度0.2~0.5 mg·m^-3,海面高度0.2~ 0.4 m;影响鲐鱼渔场的因子按重要性依次为海面高度、经纬度、海表温度和叶绿素浓度.     

三七总皂苷对斑马鱼胚胎初级和次级造血的抑制作用

目的探讨三七总皂苷(Panax notoginsenosides,PNSs)对斑马鱼胚胎造血的作用,为三七的药理学应用提供实验依据。方法通过乙醇提取得到PNSs,用50、100μg/mL的PNSs从75%外包时期开始处理斑马鱼胚胎。收集发育至不同时期的胚胎,检测药物处理后,斑马鱼初级造血和次级造血的分子标记的变化。结果 PNSs处理后,初级造血的分子标记gata1、hbbe3明显下降,生成的红细胞显著减少;PNSs处理还可以抑制造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)发育。次级造血的分子标记runx1,cmyb在PNSs处理下表达下调,由HSC分化生成的T淋巴细胞分子标记rag1表达也显著降低。有意思的是,PNSs对斑马鱼初级和次级造血的抑制作用均呈剂量依赖效应。结论孕期可能需要慎重使用三七总皂苷药物。