柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白抑制NF-κB信号通路的作用机制研究

目的 柯萨奇病毒B组5型（CVB5）是手足口病的重要病原体之一,可导致发热、皮疹或疱疹等临床症状,重症者出现神经系统疾病,甚至死亡。天然免疫应答是机体抗病毒入侵的第一道防线,其中核因子κB (NF-κB)是宿主天然免疫反应中的重要蛋白质,然而关于CVB5感染后调控NF-κB介导信号通路的研究尚鲜有报道。方法 本研究通过检测启动子活性、促炎因子水平以及通路中关键蛋白表达等,阐明CVB5对NF-κB信号通路的调控作用机制。结果 CVB5感染可抑制促炎因子表达和p65的磷酸化。CVB5非结构蛋白（NSP）可抑制促炎因子表达以及重要蛋白p65和IκBα的磷酸化。经STRING11.1数据库预测表明,CVB5 3CD蛋白与宿主多聚胞嘧啶结合蛋白1 (PCBP1)具有相互作用,且PCBP1可促进IκBα和p65的磷酸化,抑制病毒复制。结论 CVB5 NSP可负调控NF-κB信号通路,且与3CD相互作用的PCBP1蛋白可通过调控NF-κB通路抑制CVB5复制。本研究探索病毒与宿主天然免疫应答的调控作用,从而为研制抗CVB5感染的药物提供作用靶点。     

弹状病毒感染诱导斑马鱼免疫应答的分子机制

弹状病毒(Rhabdovirus)是引起鱼类病毒性传染病的重要病原之一.近几年,鱼类弹状病毒感染斑马鱼(Danio rerio)诱导非特异性免疫反应的分子机制研究备受关注.作者通过鱼类弹状病毒感染斑马鱼进行转录组和蛋白质组学研究,结果表明,Toll样受体(TLRs)、RIG-Ⅰ样受体(RLRs)等介导的干扰素(IFNs)反应以及补体途径等被激活,并且丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、髓样分化因子88(My D88)/核因子κB(NF-κB)炎症信号通路等参与抗病毒应答的调控过程.本文首次综述了4种鱼类弹状病毒(SVCV,VHSV,IHNV,SHRV)感染诱导斑马鱼免疫应答的分子调控及其研究进展,以期将来为鱼类弹状病毒性疾病研究与防治提供科学参考.     

斑马鱼myd88和traf6真核表达载体的构建

髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88,MYD88)和 TNF 受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)均属于 Toll 样受体(Toll-like receptors,TLR)家族成员中的关键衔接分子.斑马鱼是研究先天免疫应答的独特模式生物,为了构建myD88和traf6的真核表达载体,用于免疫应答机制的研究,克隆了斑马鱼myd88和traf6基因的编码区CDS全长序列,分别是855 bp和1 629 bp.结构分析表明,斑马鱼MYD88存在2个保守结构域为死亡结构域和TIR结构域,TRAF6存在4个保守结构域分别为RING结构域、2个锌指结构域、环-环(coiled-coil)结构域以及TRAF同源结构域(meprinand TR-AF-homology,MATH),并与其他物种氨基酸序列一致性较高.系统进化树分析发现斑马鱼myd88和traf6基因与硬骨鱼类亲缘关系较近,说明斑马鱼myd88和traf6基因的同源性符合其在物种进化上的地位并且具有很高的结构同源性.将斑马鱼myd88和traf6基因的CDS全长序列连接至pCMV-Tag2B表达载体.通过对重组质粒进行双酶切检测发现,成功克隆了斑马鱼pCMV-myd88和pCMV-traf6真核表达载体.为了验证这2个真核表达载体的生物学功能,本研究在HEK293T细胞中进行NF-κB的报告基因活性检测.结果表明,过表达myd88和traf6基因后,斑马鱼NF-κB家族nfκbl启动子的转录活性显著升高,分别约为空载对照组的2.5倍和8倍.鉴于MYD88和TRAF6在天然免疫功能等方面的重要作用,实验结果为以后研究斑马鱼的先天免疫信号传导过程提供了有力的研究工具.     

泛素样蛋白ISG15在抗病毒天然免疫中的作用

干扰素刺激基因15(ISG15)编码的蛋白是抗病毒天然免疫通路中的重要调节因子,病毒感染和干扰素刺激均可强烈诱导ISG15的表达。ISG15是最早发现的泛素样蛋白,可对细胞内多种蛋白进行修饰并调节蛋白功能,但不介导蛋白质的降解,在机体抗病毒天然免疫反应中发挥重要作用,其机制尚未完全明确。近几年对ISG15的研究有所突破,发现了ISG15在抗病毒天然免疫反应中的新功能。我们简要概述了泛素样蛋白ISG15的概况、修饰酶系统及ISG15在抗病毒天然免疫反应中功能的研究进展。     

EB病毒潜伏膜蛋白1通过结合TRAFs调控NF-κB

为了探讨EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)的致瘤机制,对鼻咽癌中LMP1激活重要的核转录因子NF-κB机制进行了研究.首先,采用免疫共沉淀-蛋白质印迹在稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞系HNE2-LMP1中证实LMP1与TRAF1,2,3结合形成免疫共沉淀复合物,进一步以野生型LMP1及其三种突变体的鼻咽癌细胞系LMP1（野生型,wt）、HNE2-LMP1 del187～351(CTAR1缺失型)、HNE2-LMP1(1～231)(CTAR2缺失型)、HNE2-LMP1(1～187)(羧基端胞浆区缺失型)、HNE2-pSG5(空白载体型)为材料,结合NF-κB报道基因质粒（pGL2-NF-κB-luc）的荧光素酶活性表达分析NF-κB的活性,证实:较之母细胞, 野生型LMP1活化NF-κB达13.8倍, LMP1(1～187)几乎不活化NF-κB,LMP1(1～231)活化NF-κB达4.9倍, LMP1(del187～351)活化NF-κB达9.1倍;TRAF1过表达升高LMP1(wt)及LMP1(1～231)介导的NF-κB活性,而对LMP1(del 187～351)活化NF-κB无影响;TRAF3过表达或TRAF3负显性突变体抑制LMP1(wt)及LMP1(1～231)介导的NF-κB活性,而不影响LMP1(del 187～351)活化NF-κB; TRAF2过表达升高LMP1(wt)、LMP1 (1～231)及LMP1(del 187～351)介导的NF-κB活性.这些结果表明：鼻咽癌中LMP1通过TRAF1、TRAF2或TRAF3调控NF-κB,TRAF1和TRAF3主要通过CTAR1发挥作用,TRAF2的作用主要是通过CTAR1和CTAR2介导的.     

TRAF6 与NF-κB 在特发性炎症性肌病小鼠肌肉中的表达及意义

目的:研究肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)与核转录因子κB(NF-κB)在特发性炎症性肌病(IIMs)中的表达情况,探讨TRAF6在IIMs发病中的作用及机制。方法:30只雌性BALB/c小鼠随机分为5组(每组6只),A:正常对照组;B~E:IIMs模型自第一次免疫后分别在1周、2周、3周、4周末处理组;采用实时荧光定量PCR方法检测各组小鼠肌肉组织中TRAF6与NF-κB m RNA表达水平。结果:(1)IIMs各组小鼠肌肉中TRAF6与NF-κB m RNA与正常对照组相比表达均有不同程度升高(P0.01),第2周末时升高最为显著(P0.01),第3周、4周呈下降趋势(P0.01);(2)IIMs小鼠各组肌肉组织中TRAF6与NF-κB m RNA表达水平与肌肉炎症程度呈正相关(r=0.940,r=0.908,P0.01),前二者之间也呈显著正相关(r=0.944,P0.01)。结论:TRAF6、NF-κB m RNA表达在IIMs小鼠肌肉中上调,TRAF6可能通过NF-κB的激活在IIMs发生发展过程中发挥重要作用。     

线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)在宿主天然免疫信号通路中的调节作用

线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)作为一种接头蛋白在调节宿主天然免疫信号通路过程中扮演重要角色．Toll样受体(TLR)和RIG-Ⅰ样受体(RLR)等细胞模式识别受体识别入侵的病原体并将信号传递给MAVS,MAVS通过刺激下游的TBK1复合体和IKK复合体分别活化NF-κB和IRF3等信号通路,进而激活干扰素α／β表达,诱发细胞内抗感染天然免疫反应．MAVS除定位线粒体外,也可定位于过氧化物酶体上．MAVS在细胞内的不同定位决定了其在早期快速和持续性抗病毒天然免疫中的不同调节机制．MAVS只有同时定位在过氧化物酶体和线粒体上才可诱导干扰素刺激基因(ISG)快速且稳定地表达．本文通过对MAVS的发现、结构、细胞定位及其在天然免疫信号通路中的调控机制等最新进展进行综述,以期揭示MAVS蛋白在细胞内天然免疫信号通路中的重要调节作用,为研究病毒逃逸宿主天然免疫的机制和研究新型抗病毒免疫治疗策略提供新思路．     

斑马鱼TAK1正向调控IRF7介导的天然免疫反应

在鱼类中关于转化生长因子β-激活激酶1(TAK1)在天然免疫反应中的功能研究较少。为了探究TAK1在斑马鱼天然免疫中的功能,本文克隆并获得了一种斑马鱼tak1剪接异构体(Drtak1),其开放阅读框含有1737个核苷酸,编码578个氨基酸,其中包括N端的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域和C端的卷曲螺旋结构部。通过免疫荧光试验,证实DrTAK1是一种胞质蛋白。双荧光素酶报告试验显现在EPC细胞中单转DrTAK1不能诱导IFN的产生,但与IRF7共转时能显著提高其诱导干扰素启动子表达的能力。本文研究结果首次在斑马鱼中发现TAK1能正向调控IRF7介导的天然免疫反应,为后续DrTAK1功能研究奠定了基础。     

肿瘤坏死因子受体作用因子3(TRAF3)结构及生物学功能

目前在哺乳动物中发现6个肿瘤坏死因子受体作用因子(TNF receptor associated factors,TRAFs)家族成员,它们主要参与TNF受体家族信号通路.这些TRAF成员在C末端有螺旋卷曲结构和保守的TRAF结构域.TRAF3是TRAF家族中功能最为多样化的成员之一.1996年对TRAF3基因敲除小鼠进行研究发现,小鼠在出生早期死亡,这阻碍了TRAF3的生物学功能进一步研究,另一方面也证实了TRAF3在出生后发育以及维持正常的免疫系统功能方面有着重要生物学功能.10年后研究发现,TRAF3的缺失能够导致非经典NF-κB信号通路激活,这使得TRAF3在该信号通路中的功能得到了进一步的阐述.最近研究表明,TRAF3不仅能够负向调节NF-κB和MAPK信号通路,还能够正向调节Ⅰ型干扰素的产生.通过研究还发现,TRAF3可能存在着负向调节钙调蛋白磷酸酶活性的新功能.因此,研究TRAF3在免疫信号通路中的作用以及与之相关的病毒疾病具有重要的意义.     

黄颡鱼FTR67基因的克隆及功能研究

鱼类TRIM(Tripartite motif)家族的特异性扩张产生了一个硬骨鱼类特有的亚家族finTRIM (Fish novel TRIM, FTR),为探究finTRIM在黄颡鱼(Tachysurus fulvidraco)先天抗病毒免疫中发挥的作用,文章鉴定了1个与斑马鱼(Danio rerio) FTR67同源性较高的黄颡鱼finTRIM基因,命名为TfFTR67 (Tachysurus fulvidraco FTR67)。系统进化树分析表明, FTR67在有些鱼类物种中发生了基因重复,导致基因拷贝增多。TfFTR67不受SVCV的诱导表达,是一个组成型表达的基因。过量表达TfFTR67抑制poly(I﹕C)及RLR信号分子诱导的干扰素反应,同时促进病毒在细胞中的复制。鉴于TfFTR67与斑马鱼FTR67的表达特征和功能不同,研究结果表明,鱼类FTR67在不同物种中发生了基因重复和功能歧化。