外侧隔—海马CA1通路电生理分析

电刺激外侧隔区可在海马 CA1区锥体细胞层记录到群锋电位,在 CA1辐射层顶树突记录到兴奋性突触后电位(EPSP)。侧脑室注射微量海人酸损毁海马 CA3-CA4区锥体细胞后,电刺激外侧隔区在 CA1顶树突不再诱发 EPSP,由此认为外侧隔-CA1顶树突的神经联系是通过同侧海马 CA3锥体细胞侧支实现的。但 CA3-CA4损毁后,电刺激外侧隔区在海马 CA1起层锥体细胞底树突仍可记录到 EPSP。这一在正常情况下被掩盖的外侧隔-CA1底树突神经联系及其来源尚有待探讨。     

液压打击损伤后海马CA1区神经元兴奋性变化的研究

为考察脑损伤对海马CA1区锥体神经元电活动的影响并研究大黄素对神经元的超兴奋性和突触传递的作用,应用液压打击大鼠脑损伤模型和细胞外记录方法提取诱发的海马CA1区场兴奋性突触后电位(fPSP)和群峰电位(PS),进行相关的数据处理和分析。发现损伤侧比非损伤侧的fPSP斜率明显升高,PS波峰个教显著增加,而PS潜伏期明显减小;在灌流液中施加大黄素,CA1区诱发场电位明显减弱。研究结果表明：颅脑损伤可造成海马CA1区锥体神经元的迟发性过度兴奋;大黄素对神经元的兴奋性有抑制作用,可能对颅脑损伤后的中枢神经系统具有保护功能。     

AMPA受体参与的出生后大鼠海马发育早期的电生理学特点

本研究旨在探讨α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体参与的出生后大鼠海马发育早期的电生理学特点。选择出生后0.5月龄、1月龄、2月龄和3月龄Wistar大鼠共计48只(每组各12只)。应用全细胞膜片钳技术及MED64平面微电极阵列技术检测海马CA1区锥体神经元的被动膜特性及AMPA受体参与的自发兴奋性突触后电流(spontaneous exctitatory postsynaptic current,sEPSC)和场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)。结果显示,海马CA1区锥体神经元在出生后0.5～3月龄期间,在被动膜特性方面表现为:膜电容与静息膜电位无显著性变化;膜输入电阻与时间常数均显著下降。在主动膜特性方面,呈现出阶段性变化:0.5～1月龄期间,s EPSC的反应表现为:振幅显著升高,频率明显增大,上升时间及下降时间显著增加;1～3月龄期间,sEPSC的反应特性与0.5～1月龄期间相反。此外,0.5～3月龄期间,海马CA1区诱发出的f EPSP范围明显扩大,而幅值显著减小;各月龄海马CA1区诱发出的fEPSP幅值均可被AMPA受体竞争性拮抗剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)明显降低。以上结果提示,在出生后大鼠海马发育早期过程中,AMPA受体作为调节突触传递和突触联系的主要兴奋性受体,可以促进海马的发育及功能成熟。     

HIV-1 gp120对鼠海马长时程增强效应的影响

为了探讨人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)的包膜糖蛋白gp120对鼠海马脑片CA1区的突触传递及可塑性的影响,应用离体脑片记录技术,记录大鼠海马CA1区的兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential,EPSP),研究了gp120对高频电刺激Schaffer侧支引起的鼠长时程增强效应(long-term potentiation,LTP)的影响.结果发现:gp120对大鼠海马CA1区LTP产生抑制作用,对其基础EPSP没有影响,而且这种抑制效应随着gp120浓度增大而增强,即具有剂量依赖性.PKA/PKC蛋白激酶抑制剂H7可以反转这种抑制效应.提示:gp120可能是通过抑制海马CA1区的LTP而参与艾滋病相关性痴呆(HIV-1 associated dementia,HAD)的形成.     

血小板激活因子对大鼠海马脑片CA1区LTP的作用

目的:为了探讨血小板激活因子(platelet-activating factor,PAF)对大鼠海马脑片CA1区的长时程增强效应(long-term potentiation,LTP)的影响.方法:应用离体脑片电生理记录技术,记录大鼠海马CA1区的兴奋性突触后电位EPSP,研究了PAF对大鼠海马脑片CA1区的突触传递和可塑性的影响.结果:小剂量(1μmol/L)PAF可诱发大鼠海马CA1区LTP的产生;大剂量(10～50μmol/L)PAF不能诱发大鼠海马CA1区LTP的产生,且不能阻止高频电刺激(HFS,100 Hz,1 000 ms×2,每隔20 s给予)Schffer侧支引起的大鼠海马脑片CA1区LTP的形成和维持.大剂量PAF对海马CA1区基础EPSP没有影响.PAF受体拮抗剂银杏苦内酯(ginkgolide B,GB)可拮抗小剂量PAF诱发大鼠海马CA1区LTP的产生.结论:大剂量PAF具有神经毒性,可能是通过抑制海马CA1区的LTP的形成而参与艾滋病痴呆(HIV-1 associated dementia,HAD)的形成机制.     

CRISPR/Cas9高效敲除突触结合蛋白Ⅰ的电生理学研究

研究一种蛋白质在神经元中的功能,最有效的方法之一是在该基因敲除动物的神经元中确认其表型.传统的用胚胎干细胞建立基因敲除动物模型的方法虽然稳定,但是复杂、耗时.近几年来,一种新型基因组编辑技术——CRISPR/Cas9,能够在不分裂的神经元中高效特异地敲除目的基因.本文研究了用CRISPR/Cas9系统敲除突触结合蛋白Ⅰ(synaptotagminⅠ,Syt1)基因后的小鼠海马培养神经元的电生理学特性.我们设计并构建了Syt1单导向RNA(Syt1 sgRNA)的慢病毒载体质粒,并用编码Cas9和Syt1 sgRNA的慢病毒感染培养的小鼠海马神经元,急性敲除神经元中Syt1基因(Syt1 sgRNA组),并用不靶向任何基因的Scramble sgRNA感染神经元作为阴性对照(Scramble组).通过全细胞膜片钳的方法检测单动作电位诱发的兴奋性突触后电流(single AP-eEPSC)、微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)、高糖反应测量的即刻可释放囊泡池(RRP)以及10 Hz串刺激测量的囊泡释放概率(P_r).结果显示,Syt1 sgRNA组神经元丧失了Syt1的功能,并且与Syt1敲除(Syt1 KO)小鼠神经元的突触传递表型相似,而Scramble组神经元的各参数和野生型(WT)小鼠神经元相比没有显著性差异.本文为CRISPR/Cas9技术应用于神经元中基因的急性修饰提供了依据.     

海马脑片盲法膜片钳全细胞记录技术

本文较为详细地介绍了海马脑片盲法膜片钳全细胞记录技术,对其关键步骤和需要注意的问题进行了重点说明,同时对CA1区锥体神经元突触活动的特点,电压门控性Ca^2 通道以及谷氨酸（glutamate,Glu)γ－氨基丁酸（GABA）受体通道电流性质等进行了观察和分析,实验结果为采用海马脑片盲法膜片钳全细胞记录技术研究海马神经元离子通道动力学性质和中枢神经系统药物对突触活动的影响提供了可靠的依据。     

“不完全氧糖剥夺”对A型氨基丁酸受体介导的抑制性突触后膜电流的增强作用

摘要: 氧糖剥夺模型作为研究脑缺血的离体模型被广泛使用，该模型模拟了局灶性脑缺血的病理变化。然而在缺血病灶中心区与正常脑组织之间的称为缺血半暗带的区域,脑血流也有程度不一的降低。为了模拟这种病理变化，我们发展了一种中等程度氧糖剥夺的离体脑片模型，该模型满足两个条件，氧气部分剥夺而葡萄糖完全剥夺。临床上通过增强A型γ-氨基丁酸受体介导的抑制活动可以阻止海马神经元的坏死，但其机制不清楚。因此我们采用全细胞膜片钳的记录方法，研究中等程度的氧糖剥夺对海马脑片CA1区神经元的A型γ-氨基丁酸受体介导的抑制性突触后膜电流(IPSCs)的影响。我们发现中等程度的氧糖剥夺使A型γ-氨基丁酸受体电流(IPSCs)的峰值增加而衰减时程延长。进一步研究发现该电流的峰值增加是由于A型γ-氨基丁酸受体－氯离子通道的电导增加所致，而与氯离子的反转电位无关。这些发现提示神经系统在中等程度脑缺血的早期阶段可以通过内稳态机制来维持兴奋性系统和抑制性系统之间的平衡。关键词: 中等程度脑缺血, A型γ-氨基丁酸受体, 抑制性突触后膜电位, 峰值     

大白鼠上丘脑片深层部突触传递和LTP的研究

在大白鼠上丘脑片深层部的中层或深层给电刺激、分别在径向对应的深层或中层,记录到诱发的突触后场电位.以100Hz、1秒的强直刺激首次在上丘的深层部引出了长时程突触增强(LTP).N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的选择性拮抗剂2-氨基-5-磷酸戊酸盐(APV)对LTP的阻断效应表明,NMDA受体不仅对上丘深层部LTP的产生有作用.而且也与LTP的维持有关.突触后场电位的幅度受APV或兴奋性氨基酸受体的非选择性拮抗剂犬尿喹啉酸(KYNA)的作用而减小,受γ-氨基丁酸(GABA)A型受体的选择性拮抗剂荷包牡丹碱(Bicu)的作用而增加,表明谷氨酸能神经递质在上丘深层部的兴奋性突触传递中起着重要作用,并且这些突触传递也受到GABA能抑制性突触的调节.     

大白鼠上丘脑片深层部突触传递和LTP的研究

在大白鼠上丘脑片深层部的中层或深层给电刺激、分别在径向对应的深层或中层,记录到诱发的突触后场电位.以100Hz、1秒的强直刺激首次在上丘的深层部引出了长时程突触增强(LTP).N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的选择性拮抗剂2-氨基-5-磷酸戊酸盐(APV)对LTP的阻断效应表明,NMDA受体不仅对上丘深层部LTP的产生有作用.而且也与LTP的维持有关.突触后场电位的幅度受APV或兴奋性氨基酸受体的非选择性拮抗剂犬尿喹啉酸(KYNA)的作用而减小,受γ-氨基丁酸(GABA)A型受体的选择性拮抗剂荷包牡丹碱(Bicu)的作用而增加,表明谷氨酸能神经递质在上丘深层部的兴奋性突触传递中起着重要作用,并且这些突触传递也受到GABA能抑制性突触的调节.     

海马内不同亚型雌激素受体α及相关信号分子与糖尿病小鼠空间认知障碍的相关性

本研究旨在探讨海马内不同亚型雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)及相关信号分子与糖尿病引起的空间认知障碍的相关性。腹腔注射四氧嘧啶建立1型糖尿病小鼠模型,并采用Morris水迷宫方法检测模型组小鼠是否存在空间认知障碍;然后用Western blot比较模型组和正常对照组小鼠海马内ERα不同亚型ER-α36和ER-α66的表达,同时检测窖蛋白-1(caveolin-1)、PKCα、cAMP反应元件结合蛋白2(cAMP-response element binding protein 2,CREB2)和突触素(synaptophysin,Syn)的表达变化。结果显示,相对对照组,糖尿病模型组小鼠空间训练第3天和第5天的逃避潜伏期显著延长(P0.05),撤去平台后游泳路程增加;模型组小鼠海马caveolin-1、PKCα表达量显著降低(P0.05),ER-α66蛋白表达水平没有明显变化,而ER-α36和CREB2的表达量显著升高(P0.05)。以上结果提示,海马内ER-α36及相关信号分子的异常表达对糖尿病小鼠空间认知障碍形成可能具有重要的作用。     

长时程增强效应初始阶段有突触前蛋白簇数目的快速增加

突触传递的长时程增强效应 (ＬＴＰ)和长时程抑制效应 (ＬＴＤ)反映神经元间突触传递效能的变化 ,目前认为这是学习和记忆的基础 ,而谷氨酸受体在ＬＴＰ和ＬＴＤ的诱导中起关键作用。海马是与学习和记忆功能密切相关的脑区 ,Ａｎｔｏｎｏｖａ等近来研究发现 ,体外培养的海马神经元在ＬＴＰ初始阶段有突触后谷氨酸受体 (ＧｌｕＲ1)簇数目的增加 ,而且在突触前神经元有突触前蛋白簇突触素数目以及突触素与谷氨酸受体共存位点数目的快速、持久的增加。进一步实验证明ＬＴＰ初始阶段并没有新蛋白的合成 ,突触前和突触后神经元蛋白质数目的快速增…     

突触前α7烟碱受体对海马神经元兴奋性突触传递的调控

采用盲法膜片钳技术观察突触前烟碱受体(nicotinic acetylcholinel receptors,nAChRs)对海马脑片CAl区锥体神经元兴奋性突触传递的调控作用。结果显示,nAChRs激动剂碘化二甲基苯基哌嗪(dimethylphenyl—piperazinium iodide,DMPP)不能在CAl区锥体神经元上诱发出烟碱电流。DMPP对CAl区锥体神经元自发兴奋性突触后电流(spontaneous excitatory postsynaptic current,sEPSC)具有明显的增频和增幅作用,并呈现明显的浓度依赖关系。DMPP对微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic current,mEPSC)具有增频作用,但不具有增幅作用。上述DMPP增强突触传递的作用不能被nAChRs拮抗剂美加明、六烃季铵和双氢-β-刺桐丁所阻断,但可被α-银环蛇毒素阻断。上述结果提示,海马脑片CAl区锥体神经元兴奋性突触前nAChRs含有对α-银环蛇毒素敏感的胡亚单位,其激活可增强海马CAl区锥体神经元突触前递质谷氨酸的释放,从而对兴奋性突触传递发挥调控作用。     

杀虫环对黑胸大蠊神经突触传递的阻遏作用

用电生理糖间隙法研究杀虫环对黑胸大蠊神经突触传递的作用,并以α-银环蛇毒素作比较。结果证明:1)杀虫环阈浓度1×10^-5M即显著地抑制兴奋性突触后电位(EPSP)。作用开始使之阈值递增,此时只有增加刺激强度方可诱出EPSP。2)(虫非)蠊第Ⅵ腹神经节是胆碱能的。已知突触后阻遏剂如α-银环蛇毒素的作用是N型乙酰胆碱受体(n-AchR)的专一性配基,与杀虫环阻遏神经突触的传递颇为相似,二者均不影响突触后神经元的静息电位和动作电位的传导;而杀虫环对非胆磁能的神经肌肉接头则无影响。3)自发突触后电位随杀虫环处理时间的不同而变化。开始自发释放电位的振幅、频率逐渐增加,继之产生持续期较长的阵发性高频发放,以后又逐渐消失。     

噪声对海马CA3区神经元电活动及突触超微结构的影响

本文用电生理学方法及电镜技术研究105dB(A)白噪声对海马CA3区神经元电活动及突触超微结构的影响。结果表明:大鼠在强噪声暴露期间(5min),其神经元放电出现减频反应(占53.3％),增频反应(占20％)和基本无反应(占26.7％)。而强噪声定时重复暴露(每天1h共50天)后,单位放电频率极显著地低于对照组,以及高频单位消失而低频单位增加;同时,突触超微结构(大鼠和豚鼠)也出现小泡不集中于突触前膜和线粒体空泡化增多等不利于突触功能的变化。表明强噪声对海马CA3区神经元的影响是明显的,且以抑制性作用更为显著。本文结合本室以往工作进行讨论,认为噪声影响学习功能可能有通过影响海马的活动而作用的机制。     

大鼠在体海马CA1区场电位引导新技术——刺激/记录/给药一体化装置的开发和应用

大鼠海马场电位记录是研究学习记忆的一个重要手段,尤以在体记录更具生理学意义.为克服目前在体海马场电位记录的弊端和诸多不便,提高实验效率,设计并完善了一套简便易行,融刺激、记录、给药于一体的大鼠海马在体CA1区场电位实验技术.将雄性SD大鼠麻醉后固定于脑立体定位仪上,利用自制的刺激/记录/给药联合装置,引导海马CA1区场兴奋性突触后电位(fEPSP).结果表明,使用刺激/记录/给药联合装置能长时间稳定记录由测试刺激诱发的海马CA1区fEPSP.高频刺激条件下,能成功诱导早期时相长时程增强(E-LTP)和晚期时相型长时程增强(L-LTP).海马内注射AMPA受体阻断剂CNQX(100μmol/L,1μl)可迅速抑制fEPSP,注射NMDA受体拮抗剂AP-5(100μmol/L,1μl)可明显压抑LTP,药物发挥作用的时间较侧脑室给药明显缩短,剂量减少.采用此联合装置还成功实现了PPF的稳定记录.总之,采用刺激/记录/给药一体化技术进行在体海马CA1区场电位记录的特点是简单、可靠、高效,可以为开展脑认知功能活动的电生理学研究奠定良好的基础.     

α7nAChR和nNOS在Aβ诱导的认知障碍大鼠皮质及海马表达的时间和空间变化

本研究旨在观察α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7n ACh R)与神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthetase,n NOS)在Aβ诱导的认知障碍大鼠皮质和海马时间和空间的分布与变化。取Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,随机分成6组,其中3个实验组分别经侧脑室注射凝聚态Aβ1-42(2.5μg/μL,4μL),连续观察7 d(7 d Aβ组)、14 d(14 d Aβ组)和21 d(21 d Aβ组);3个对照组则分别注射和实验组等量生理盐水并观察相同的时间。用Y迷宫刺激器检测大鼠的学习和记忆行为能力,用免疫组织化学和Western blot检测皮质和海马CA1、CA3、DG各区α7n ACh R和n NOS阳性细胞分布和蛋白表达量的变化。结果显示,与各自对照组相比,3个实验组大鼠的学习和记忆行为能力降低,前额叶皮质和海马各区α7n ACh R和n NOS的表达均显著下调,特别在前额叶皮质浅层和海马CA3区变化明显;3个实验组之间比较结果显示,Aβ诱导的认知障碍大鼠学习和记忆功能、前额叶皮质和海马α7n ACh R和n NOS表达均随着Aβ作用时间的延长呈进行性下降。以上结果提示,前额叶皮质和海马α7n ACh R和n NOS表达的共同降低可能是Aβ诱导的大鼠认知功能障碍的基础。     

无线神经遥测技术在阿尔茨海默病转基因小鼠恐惧学习记忆活动中的应用——海马Theta节律观察

APP/PS1/tau三转基因(3xTg)小鼠是国际公认的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)动物模型,其6月龄时即可表现出与海马相关的认知活动障碍及电生理指标异常,但同步记录AD小鼠行为学和脑电活动的研究仍鲜有报道。近年来,无线遥测技术的发展为同步记录小动物行为和脑电活动创造了条件。本研究利用无线神经遥测技术,结合行为学检测手段,同步记录了3xTg AD小鼠在恐惧记忆活动过程中的行为学表现和海马Theta节律变化,以期揭示AD时认知功能障碍与Theta节律的关系。结果显示:(1)恐惧学习训练阶段,3xTg小鼠与野生型(wild type, WT)小鼠相比,行为学和脑电活动均无明显差异;(2)记忆检测阶段,3xTg小鼠因条件刺激(conditioning stimulus, CS)引起的僵直比率显著低于WT小鼠;(3)条件刺激前(Pre-CS)与CS期间3xTg小鼠海马Theta节律的峰值功率均明显低于WT小鼠;(4) CS可有效提高WT小鼠海马CA1区Theta节律的峰值频率,而这一刺激对3xTg小鼠无效。以上结果表明,3xTg小鼠在认知行为障碍即恐惧学习记忆能力下降的同时,伴有海马CA1区Theta节律的发放频率与发放功率降低。据此推测,Theta节律活动的衰减与3xTg小鼠恐惧记忆行为障碍有关,增强海马Theta节律可能有助于认知行为的改善。     

大鼠海马CA1区β受体参与长时程增强和空间学习

在离体海马脑片上, 激活CA1区β肾上腺素能受体(β受体)易化这一区域突触传递的长时程增强(LTP). 然而, 在体情况下, CA1区β受体是否参与LTP的调控, 是否参与海马依赖性的学习和记忆, 尚无实验证据. 为此, 观察了β受体激动剂异丙肾上腺素或拮抗剂心得安对在体CA1区LTP的调控作用以及对大鼠在Morris水迷宫中的空间学习的影响. 正常情况下对突触强度仅有微小调制作用的10 Hz的θ节律刺激(每串150个脉冲, 1串), 在CA1区局部给予L-异丙肾上腺素后, 显著地诱导出LTP, 这一效应被DL-心得安所阻断; 相反, 正常情况下对突触强度有显著调制作用的5 Hz的θ节律刺激(每串150个脉冲, 3串), 在CA1区局部给予DL-心得安后, 诱导出的LTP显著地被压抑. 相应地, 训练前20 min在CA1区注射DL-心得安, 大鼠在水迷宫中的学习速度显著地慢于对照组大鼠, 训练后24 h的空间记忆保持亦相应较差. 以上结果表明, β受体参与海马CA1区的突触可塑性, 且对空间学习重要.     

锌离子对配体门控型离子通道的调节作用

在中枢神经系统(central nervous system,CNS)中,锌离子对配体门控型离子通道具有重要的调节作用。锌离子随着神经元的活动从突触前膜的囊泡中释放到突触间隙,对突触内受体进行调控。锌离子抑制N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)型谷氨酸受体的活性,而对非NMDA型谷氨酸受体的调控具有多样性。由γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)受体所介导的抑制性突触传递活动也受到锌离子的抑制;而锌离子对glycine受体则呈现出浓度依赖的双向调节效应。病理条件下,锌离子参与了兴奋性细胞毒作用所触发的神经元凋亡过程。本文主要阐述了在CNS中,锌离子对配体门控型离子通道所介导的突触传递活动的调控作用,以及这些调控作用的生理功能和病理意义。