丙酮酸脱氢酶活性调控在线粒体代谢与生长平衡中的作用

丙酮酸脱氢酶多酶复合体(PDC)催化丙酮酸生成乙酰辅酶 A(acetyl-CoA)的反应是线粒体代谢与生长的调控枢纽.丙酮酸脱氢酶激酶 (PDK)/丙酮酸脱氢酶磷酸酶(PDP)对丙酮酸脱氢酶(PDH)的磷酸化 /脱磷酸化作用以及丙酮酸/乙酰辅酶A对PDH底物产物水平的调控是线粒体适应不同生理环境的代谢调节方式,而调控 PDK基因转录的上游信号恰好也是线粒体生长或生物发生的调控机制.过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR)/过氧化物酶体增殖物激活受体g共激活因子-1(PGC-1) 信号通路可能是线粒体代谢与生长在基因转录水平的共同调控通路.线粒体代谢与生长经共同通路调节可维持线粒体功能与结构之间的平衡.     

乙酰辅酶A合成代谢对酿酒酵母生理功能的影响

【目的】研究酿酒酵母(Saccharomycesc erevisiae)中乙酰辅酶A合成酶基因ACS1和ACS2的生理作用。【方法】将来源于S.cerevisiae的ACS1和ACS2分别进行过量表达,研究过量表达ACS1和ACS2后S.cerevisiae胞内乙酰辅酶A含量、ATP水平、甲羟戊酸途径转录和乙醇耐受性等生理学特性变化。【结果】与出发菌株相比,过量表达ACS1和ACS2使得:(1)胞内乙酰辅酶A含量提高了2.19倍(ACS1)和5.02倍(ACS2);(2)胞内ATP含量提高了3.93倍(ACS1)和2.05倍(ACS2);(3)甲羟戊酸途径8个关键基因表达量显著上调;(4)S.cerevisiae对乙醇胁迫抵御能力显著增强。过量表达ACS1对乙醇胁迫的耐受能力强于过量表达ACS2。【结论】增加胞内乙酰辅酶A的含量可以显著增加甲羟戊酸途径碳代谢流量,并增强S.cerevisiae对发酵过程主要副产物乙醇的耐受能力。     

乙酰辅酶A与内质网乙酰化

乙酰辅酶A是细胞内物质和能量代谢的重要中间物，同时也是蛋白质乙酰化的乙酰基供体。蛋白质乙酰化包括Nα-乙酰化和Nε-乙酰化，由不同的酶进行催化。蛋白质乙酰化发生在多个亚细胞部位，如细胞基质、细胞核、线粒体和内质网腔等。不同细胞器和区室内乙酰辅酶A的波动可调控内质网蛋白质的乙酰化水平。本文从柠檬酸转运蛋白SLC25A1和SLC13A5、乙酰辅酶A转运蛋白AT-1以及乙酰转移酶ATase1和ATase2的功能出发，以相关人类疾病、内质网乙酰化失调小鼠模型和柠檬酸/乙酰辅酶A通量失调小鼠模型为背景进行分析，阐述了乙酰辅酶A和内质网乙酰化以及内质网乙酰化功能失调与退行性疾病之间的关系，旨在为靶向治疗相关疾病提供一定的策略。     

低氧下氧化型ATM通过胞内柠檬酸累积促进人乳腺癌细胞的迁移和侵袭

该研究主要探讨低氧下共济失调毛细血管扩张突变(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)蛋白激酶活化通过糖代谢重塑对人乳腺癌MCF7及MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的影响。构建靶向ATM基因的慢病毒载体(shATM)及其阴性对照病毒(shNC),感染人乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞,建立ATM基因稳定沉默细胞系。实验设阴性对照组(shNC)、ATM基因沉默组(shATM)以及ATM特异性抑制剂KU60019处理组,利用实时荧光定量PCR检测ATM下调效果;Western blot检测常氧及低氧下ATM、p-ATM、γ-H2AX、p-CHK2(T68)的蛋白表达水平,利用伤口划痕愈合及Transwell实验分别检测细胞迁移和侵袭能力的改变,用糖代谢相关试剂盒检测糖代谢过程中相关底物的变化。结果表明,低氧处理12 h时(此时尚未发生DNA损伤),人乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞p-ATM(即氧化型ATM)表达量显著增加,其迁移和侵袭能力增加。糖代谢改变表现为葡萄糖消耗量、丙酮酸产量、乙酰辅酶A产量明显高于乳酸生成量;进而检测三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)产物,发现与柠檬酸相比,下游琥珀酸和延胡索酸产生了较大程度的累积。而shATM和KU60019细胞处理组能有效抑制p-ATM的表达量、细胞迁移和侵袭能力、葡萄糖消耗、丙酮酸产量、乙酰辅酶A产量,但对于乳酸产量的抑制作用并不明显;TCA中柠檬酸的产量的降低程度明显大于其下游琥珀酸和延胡索酸的降低量。在低氧下,shATM细胞中补充外源性柠檬酸,肿瘤细胞的迁移侵袭能力均得到一定程度回补。研究结果揭示,低氧情况下,氧化型ATM的表达量明显增加,并通过胞内柠檬酸的累积促进人乳腺癌细胞的迁移和侵袭。     

挖掘与调控乙酸胁迫响应基因提高重组酿酒酵母合成番茄红素水平

【背景】乙酰辅酶A是酿酒酵母异源合成番茄红素的重要中间产物,胞质中乙酰辅酶A主要来自乙酰辅酶A合成酶催化乙酸合成。【目的】通过外源添加乙酸盐结合调控乙酸胁迫应答基因增加胞内乙酰辅酶A含量,改善细胞生长,促进番茄红素合成。【方法】在合成番茄红素的重组酵母菌中过表达乙酰辅酶A合成酶编码基因(acs2),在发酵过程中添加10g/L乙酸盐,结合转录组学分析挖掘乙酸胁迫响应基因,进行单一和组合调控。【结果】添加乙酸盐后,重组菌Y02中番茄红素含量增加了19.14%,但细胞生长受到抑制,转录组学结果表明adk2、fap7、hem13、elo3、pdc5、set5、pmt5、hst4、clb2和swe1表达水平增加,因此构建了单基因和双基因过表达菌株,其中Y02-set5-hst4菌在添加乙酸盐后细胞生长得到了显著改善,同时胞内乙酰辅酶A浓度提高了78.21%,番茄红素含量和产量达到12.62 mg/g-DCW和108.67 mg/L,与对照菌Y02相比分别提高了42.76%和67.13%。同时该菌中甲羟戊酸途径中关键基因erg12、erg20和hmg1的表达量与对照菌相比分别上调了1.70、1.4...     

应用单克隆抗体鉴定人类肝脏线粒体蛋白质组中的抗原优势蛋白

对线粒体蛋白质组的鉴定和分析有助于理解线粒体的功能和相关疾病的发病机制, 包括能量代谢、凋亡、自由基产生、产热作用、钙离子信号通路等. 本实验旨在鉴定人类肝脏线粒体蛋白质组中的抗原优势蛋白. 用线粒体蛋白质作为免疫原, 经过细胞融合、筛选和克隆, 制备了240多个单克隆抗体杂交瘤细胞系. 单克隆抗体识别的线粒体蛋白抗原通过人类肝脏cDNA表达文库筛选方法鉴定, 相应的线粒体蛋白质的亚细胞定位通过免疫组化证实. 发现了肝脏线粒体中6个抗原优势蛋白, 分别被至少两种特异性的单克隆抗体所识别. 这6个蛋白分别是乙酰辅酶A酰基转移酶(线粒体3-酮酯酰辅酶A硫解酶)2、醛脱氢酶1家族A1、氨甲酰磷酸合成酶1、二氢硫辛酰胺S乙酰转移酶(丙酮酸脱氢酶复合物的E2组分)、烯酰辅酶A水合酶1和羟基类固醇(11β)脱氢酶1. 这些单克隆抗体有望应用于人类肝脏蛋白质组计划的相关研究, 如去除优势蛋白、蛋白与蛋白之间相互作用的研究和验证等.     

黄芩甙对肝癌细胞BEL-7402形态学的影响

目的观察黄芩甙对肝癌细胞BEL-7402凋亡的影响,同时观察对肝癌细胞形态及超微结构、线粒体超微结构、线粒体膜电位和细胞内Ca^2＋的影响,探讨线粒体损伤在黄芩甙诱导肝癌细胞凋亡中的作用及可能的机制。方法应用细胞培养技术培养肝癌细胞BEL-7402,光镜、倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜观察细胞形态及超微结构的变化尤其是线粒体的变化,应用流式细胞仪检测细胞凋亡百分率及线粒体膜电位、细胞内Ca^2＋的改变,免疫组化法检测细胞Bcl-2、Pax蛋白表达。结果黄芩甙诱导肝癌细胞BEL-7402凋亡呈剂量依赖关系,细胞形态、超微结构及线粒体超微结构出现明显改变,降低肝癌细胞线粒体膜电位,使细胞内Ca^2＋增加,细胞Pax表达增加,广泛分布于胞核和胞质中,Bcl-2表达减少。结论黄芩甙诱导肝癌细胞BEL-7402凋亡,线粒体损伤在黄芩甙诱导肝癌细胞凋亡中起重要作用,其机制可能为抑制肝癌细胞Bcl-2蛋白表达,促进Pax蛋白表达及细胞内Ca^2＋增加,激发线粒体膜通透性转运孔开放,线粒体跨膜电位降低,使肝癌细胞凋亡。     

抑制miR-34a减少高糖代谢记忆所致视网膜色素上皮细胞SIRT1下调和凋亡

目的探讨mi R-34a在视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞高糖"代谢记忆"中的作用及其机制,为糖尿病视网膜病的防治提供新的策略。方法 RPE细胞用高糖培养4d后换用正常糖浓度培养4d,模拟糖尿病高糖代谢记忆模型,用mi R-34a mimic和mi R-34a inhibitor改变高糖代谢记忆RPE细胞内mi R-34a表达,实时定量PCR检测mi R-34a表达水平,免疫细胞化学和Western blot检测组蛋白去乙酰化酶Sirtuin 1(SIRT1)水平,annexin V-PI法流式细胞术检测细胞凋亡。结果实时定量PCR检测显示,高糖培养和代谢记忆可显著升高RPE细胞内mi R-34a表达水平,mi R-34a mimic可进一步显著上调代谢记忆RPE细胞内mi R-34a表达水平,mi R-34a inhibitor可显著下调代谢记忆RPE细胞内mi R-34a水平;免疫细胞化学染色显示,高糖培养和代谢记忆可使RPE细胞内STRT1免疫反应性显著降低,过表达mi R-34a进一步下调代谢记忆RPE细胞内STRT1免疫反应性,而mi R-34a inhibitor则可抑制代谢记忆对RPE细胞内STRT1免疫反应性的下调作用;流式细胞术检测发现,高糖培养和代谢记忆使RPE细胞凋亡明显增加,过表达mi R-34a进一步增加代谢记忆RPE细胞凋亡,而mi R-34a inhibitor则显著抑制代谢记忆RPE细胞凋亡的增加。结论 mi R-34a抑制剂能通过抑制高糖代谢记忆对RPE细胞SIRT1水平的下调和细胞凋亡的增加,部分逆转高糖代谢记忆效应,防治糖尿病视网膜病变。     

细胞周期蛋白依赖激酶Roscovitine诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡及其机制的研究

目的：探讨细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）抑制剂Roseovitine（Ros）诱导非小细胞肺癌（NSCLC）A549细胞凋亡及其作用机制。方法：以不同浓度Ros（101．1M、20yM、40μM）处理细胞24h,采用AnnexinV-PI染色以流式细胞仪检测细胞凋亡,Westernblot法检测胞浆中和线粒体促凋亡蛋白Bax和Bad的表达,流式细胞仪检测线粒体膜电位（脚）变化。结果：Ros以剂量依赖的方式诱导A549细胞凋亡,同时Bad和Bax在胞浆的含量随着Ros剂量的增加而减少,而在线粒体中却出现相反的结果,线粒体膜电位随Ros剂量的增大而降低。结论：Ros可通过促进Bax和Bad由胞浆向线粒体易位,诱导NSCLCA549细胞由线粒体途径发生凋亡。     

乳酸钠促进法夫酵母虾青素合成代谢流作用分析

【目的】研究乳酸钠(一种糖代谢产物)的加入对法夫酵母JMU-VDL668发酵过程中细胞生长和虾青素合成的影响。【方法】分别在摇瓶和7 L发酵罐实验基础上,采用代谢通量分析的方法分析添加乳酸钠对法夫酵母菌株JMU-VDL668合成虾青素代谢流的影响。【结果】在7 L发酵罐实验中添加乳酸钠,虾青素产量最高可达17.70 mg/L,与对照组相比提高26%。代谢通量分析表明,乳酸钠可以调节丙酮酸、乙酰辅酶A节点处的代谢通量分布,乳酸在乳酸脱氢酶的作用下可以直接进入代谢网络的后半程,乙酰辅酶A的通量和进入TCA循环的通量得到了显著加强。【结论】乳酸钠的加入提供了更多的乙酰辅酶A等前体物质和能量供给,因此促进了虾青素的合成。