重组高原鼠兔瘦素原核表达载体的构建、蛋白表达及纯化

瘦素(leptin)由ob 基因编码,对调节能量代谢起着重要作用。本研究建立了高原鼠兔瘦素的原核表达系统,并对其进行了原核表达。研究中作者从高原鼠兔瘦素基因的cDNA 文库中,扩增编码高原鼠兔瘦素的核酸序列,并利用DNA 基因重组技术将其克隆到原核表达载体pET30a(+ )中,构建了高原鼠兔瘦素原核表达载体pET30a(+ )/ ppleptin。对目的片段进行测序确认后,将其转化到大肠杆菌BL21 中,并利用IPTG 诱导外源性目的蛋白表达。表达的包涵体蛋白经溶解及变性后上柱纯化。重组质粒经测序检测后,表明原核载体构建正确。同时,SDS - PAGE 凝胶电泳结果显示,重组菌在16KD 处有明显新增条带,纯化后的目的蛋白条带纯度较高。该结果为高原鼠兔瘦素的后续基础研究提供了基础资料。     

三种乳腺特异表达载体表达特性的比较

为了比较不同来源乳腺特异表达载体的表达特性 ,将人溶菌酶 (hLYZ)cDNA分别克隆入自行构建的p2 0 5C3载体和国外引进的pBJ41和pBC1载体。重组载体p2 0 5C3LYZ、pBJLYZ和pBCLYZ分别用 2 5kDaPEI包裹后 ,通过尾静脉途径注射哺乳期小鼠。注射后 72h采集乳样 ,经微球菌溶解实验证明 ,3组小鼠乳汁中hLYZ的表达量分别为 87、69、60mg L ;从每组小鼠的 1 2种组织提取总RNA ,经Dotblotting检测证明 ,三种重组载体除在乳腺中表达外 ,p2 0 5C3LYZ还在小鼠的脾和肠、pBJLYZ在脾、pBCLYZ在脾和肾中具有一定的异位表达 ;在有hLYZmRNA转录的上述脏器中用微球菌溶解试验均可检测到hLYZ活性。这些实验结果表明 ,自行构建的乳腺特异表达载体的表达特性与从国外引进的表达载体无明显差别。     

表达人溶菌酶基因牛乳腺特异表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺酪蛋白基因的1.8kb和1.1kb的5'和3'调控 序列,克隆入TA载体.经测序鉴定后,利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体 pcDNA3(切除CMV启动子),并插入人溶菌酶基因(hLYZ)的cDNA, 构建成牛乳腺特异表达 载体.获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定、PCR验证等表明,成功克隆了酪蛋白基因5 '和3'的调控区,并成功构建了表达人溶菌酶基因的牛乳腺特异表达载体.     

高原鼠兔脑红蛋白基因的克隆与组织表达

克隆高原鼠兔脑红蛋白(Neuroglobin,NGB)基因编码区并检测其在成年高原鼠兔脑组织和其他组织中的表达,同时探讨高原鼠兔低氧适应的分子生物学机制。从高原鼠兔脑组织中提取总RNA,通过RT - PCR 获得高原鼠兔NGB cDNA,将其与pGEM - T Easy 载体连接,构建重组质粒,蓝白斑筛选阳性克隆并进行鉴定和测序;制备地高辛标记的RNA 探针并采用原位杂交法(In suit hybridization,ISH) 分析脑红蛋白基因在高原鼠兔脑组织中的分布;采用RT - PCR 和蛋白印记(Western blot)检测高原鼠兔不同组织中脑红蛋白的表达含量。将含有目的片段的阳性克隆经测序和Blast 分析,显示其部分编码序列与GenBank 中绵羊、大鼠等同源性很高(大于84% ),表明本实验所克隆的序列为脑红蛋白基因;原位杂交结果显示NGB 在青藏高原土著动物高原鼠兔脑部分布较为广泛;高原鼠兔不同组织中都有NGB mRNA 表达,NGB 基因并不是中枢神经系统所特有的,睾丸和肾上腺也有较高的表达。NGB 基因在高原鼠兔脑组织和其他组织中分布较为广泛,推测NGB mRNA 可能在高原鼠兔机体较为广泛的区域中发挥着作用,同时为高原低氧适应相关基因的研究提供了实验依据。     

藏鼠兔与高原鼠兔表型及分子性状的比较

本文应用限制性内切酶分析藏鼠兔和高原鼠兔的线粒体ＤＮＡ限制性片段长度多态性,并结合形态、生镜、地史和化石资料综合探讨两物的异同。结果表明,形态上差异显著的两个物种,在分子水平上也同样具有明显的区别,用１６种酶分别消化各样品,共检出３０例限制性类型,两种间存在丰富的多态性;它们的ｍｔＤＮＡ分子均为１７．９ｋｂ（千碱基对）左右;平均遗传距离为０．０４５５,分歧时间约为距今二百三十万前的上新世晚期,相当     

高原鼠兔松果腺褪黑激素含量昼夜节律的研究

自然光照条件下,高原鼠兔（Ｏｃｈｏｔｏｎａｃｕｒｚｏｎｉａｅ）松果腺褪黑激素（Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ,ＭＬＴ）含量呈现明显的昼夜节律（Ｐ＜０．００１,夜间组含量均值与白天组含量均值差异显著性比较）。在２月份的实验中,对１８只鼠兔（体重１２２—１６４克）松果腺的采样时间分别为０２．００,０９．００,１２．００,１８．００,２２．００和２４．００时。白天ＭＬＴ含量波动为５６—６４微微克／松果腺,夜间波动为１１３—１７０微微克／松果腺。夜间ＭＬＴ含量高峰值出现在２４．００时。在１０月份的实验中,对６０只鼠兔（体重１０２—１５３克）松果腺的采样时间分别为０３．００,０６．００,０９．００,１２．００,１５．００,１８．００,２１．００和２４．００时。白天ＭＬＴ含量波动为７７—１１９微微克／松果腺,夜间波动为１３９—５０５微微克／松果腺。夜间ＭＬＴ含量高峰值出现在０３．００时。将２月份和１０月份高原鼠兔松果腺ＭＬＴ含量进行差异显著性比较,１０月组显著高于２月组（Ｐ＜０．０５）。结果表明,该动物的松果腺本身对光周期具有敏感性,它能够感知环境光周期的变化,成功地完成神经内分泌的转换。     

高原鼠兔种群敏殖生态的研究

1985-1988年,在青海湖黑马河地区以耳标法对高原鼠兔的繁殖生态进行了研究。在繁殖群体中主要是来自上年出生的第1、2胎的鼠兔（82.85%）,第3胎和老体占少数。成年雌鼠兔100%参加繁殖,通常年产3胎,有的年份可产4胎或5胎。产仔数1-8只（平均为4.52±0.12）,1只雌鼠兔终生可产2-29只。妊娠期为22.2±0.13天。洞内哺乳期为11.65±0.01天。有的年份当年出生的少数雌鼠兔到36.8±3.05日龄可达到性成熟并参加繁殖,生1-2胎,雄鼠兔性成熟较晚。     

高原鼠兔蒸发失水的地位及热能调节

本文对高原鼠兔(Ochotona curzoniae)的静止代谢率(RMR)、蒸发失水(EWL)、非颤抖性产热(NST)等能学参数进行了测定,计算了干燥热传导(dry C)、热能调节热标(TI)等,评估了蒸发散热(EHL)在热传导(C)中的地位,结果表明:高原鼠兔的基础代谢率(BMR)和最小热传导(C_m)均高于期望值;25℃以上EHL占有重要地位;热能调节能力较好,但抗高温能力较差;这些特征对于栖居在年气温差较小、日温差大的高寒环境中的高原鼠兔具重要的适应意义。     

高原鼠兔种群的性比

The sex ratio (♂ / ♀ ) of plateau pika's (Ochotona curzoniae) population was studied by re-captured method in the region of the Haibei Mpine Meadow Ecosystem Research Station, Northwest Institute of Plateau Biology, the Chinese Academy of Sciences from April of 2001 to August of 2002. The result showed that there was no significant difference from 1:1 in adult's sex ratio in whole breeding season, whereas the sex ratio of juvenile had some fluctuations among different age stages. The sex ratio of the second litter varied significantly from embryo to 60-day-old, but no difference at the first and the third litter. We concluded it was caused by conflict between maternal strategy and juvenile's strategy. No significant differences of sex ratio were found both in adult and juvenile between 2001 and 2002. The sex ratio of plateau pika before and after overwintering did not vary. In summary,we proposed that sex ratio of plateau pika's population was not influenced by exogenous factors, but some serf-regulation mechanisms may be involved.     

高原鼠兔与达乌尔鼠兔食物资源维生态位的研究

作者于１９９３年在青海省刚察县年诺索玛地区发现高原鼠兔（Ｏｃｈｏｔｏｎａ ｃｕｒｚｏｎｉａｅ）和达乌尔鼠兔（０．ｄａｕｒｉｃａ）在布哈河谷二阶同域且重叠分布之现象,并从这两种鼠兔的食物资源利用出发,研究了其生态位关系问题。在食物资源维上的生态位宽度（ＰＳ）,高原鼠兔为０．４７４４,达乌尔鼠兔为０．４９６４,即它们具有相近似的生态位宽度。这两种动物的生态位在食物资源谱维上的重叠值（ＦＴ）为０．８０９     

高原鼠兔红细胞免疫功能的研究

本文应用免疫花环试验法测定了封闭群中高原鼠兔红细胞Ｃ３ｂ受体和红细胞免疫复合物的花环率,并比较了不同年龄高原鼠兔红细胞的免疫功能。研究结果表明,高原鼠兔红细胞在自身免疫系统中具有重要的免疫功能;随年龄增长,其红细胞免疫功能逐渐减弱。与人、兔和大白鼠等动物相比,高原鼠兔红细胞免疫粘附活性高,因此适宜作红细胞免疫实验的动物模型。     

乳腺生物反应器特异高效表达载体的构建

乳腺生物反应器具有广阔的开发前景,而提高目的基因的表达量是该领域一个重要的研究课题。因此,选用强的非特异性启动子pCAG,而不是乳腺特异性启动子来实现高效表达;通过Cre/loxP系统和山羊β-乳球蛋白启动区（pBLG）表达Cre重组酶来实现载体的自删除以达到乳腺特异表达的目的。方法：构建含PolyA终止信号的Cre乳腺特异表达元件PolyA-pBLG-cre,插至强启动子pCAG驱动的报告基因lacZ表达载体中,构建成乳腺特异表达载体pCBCZ（pCAG-loxP-PolyA-pBLG-cre-loxP-lacZ）。转染细胞实验结果：PCR鉴定确认pCBCZ载体在小鼠乳腺上皮细胞（HC11）中发生Cre-loxP同源重组。X-Gal染色表明载体能驱动lacZ在HC11细胞中高效表达β-半乳糖苷酶,而在NIH 3T3细胞中仅少量表达。结论：构建的pCBCZ载体能高效驱动外源基因在乳腺细胞中表达,且具有较好的乳腺特异性,为研发乳腺生物反应器表达载体提供新的方法。     

高原鼠兔种群繁殖生态的研究

1985—1988年,在青海湖黑马河地区以耳标法对高原鼠兔的繁殖生态进行了研究。在繁殖群体中主要是来自上年出生的第1、2胎的鼠兔(82.85％),第3胎和老体占少数。成年雌鼠兔100％参加繁殖,通常年产3胎,有的年份可产4胎或5胎。产仔数1—8只(平均为4.52±0.12),1只雌鼠兔终生可产2—29只。妊娠期为22.2±0.13天。洞内哺乳期为11.65±0.01天。有的年份当年出生的少数雌鼠兔到36.8+3.05日龄可达到性成熟并参加繁殖,生1—2胎。雄鼠兔性成熟较晚。     

高原鼠兔 Ochotona curzoniae自然寿命研究

1984至1987年2月在青海湖黑马河地区,以耳标观察法对高原鼠兔Ochotona curzoniae的自然寿命进行了研究。其结果,高原鼠兔的生存曲线呈L型。最大寿命957天,平均寿命119.9天。1986年出生的幼体,第1胎雄鼠平均寿命108天,雌鼠106天,第2胎雄鼠为58天,雌鼠为66.3天;第3胎雄鼠为24.8天,雌鼠为15.4天。     

繁殖期高原鼠兔的攻击行为

通过室内配对实验对高原鼠兔（Ｏｃｈｏｔｏｎａ ｃｕｒｚｏｎｉａｅ）繁殖期的攻击行为进行了研究。结果表明,雌雄动物的攻击水平相同,同性个体间的攻击性明显高于异性个体间。雌雄动物具有不同的攻击模式。雌性个体遇到陌生个体首先以攻击中的进攻和追逐为主,然后通过相互接触确定个体的性别,若为同性个体,以防御为主,若为异性个体,则有防御和亲昵两种选择;雄性动物遇到陌生个体同样首先以攻击为主,相互接触后,若为异性     

高原鼠兔与达乌尔鼠兔的摄食行为及对栖息地适应性的研究

通过对标志高原鼠兔和达乌尔鼠兔直接观察的方法,对它们的摄食行为及栖息地适应性进行了研究。两种鼠兔的摄食行为链存在着明显趋同的行为程序时间系列。在摄食活动中,前者用于防御敌害的时间分配较多。而达乌尔鼠兔则花费更多的时间于采食。对小生境内的高大植株进行刈割,是高原鼠兔保持其防御视野开阔,降低被捕食风险的适应性策略;达乌尔鼠兔则善于利用栖息地内高大植株覆盖物作为它们的临时隐蔽所,以有效地躲避敌害。这表明它们具有反捕食的行为调控能力,也证明捕食风险强化了物种对栖息地的选择。     

高原鼠兔的季节性繁殖

作者对成年雄性高原鼠兔（Ｏｃｈｏｔｏｎａｃｕｒｚｏｎｉａｅ）野外繁殖进行了全周年的调查。同时,对松果腺在其季节性繁殖周期调控中所起的作用进行了探讨。２月至４月上旬为其季节性繁殖的恢复期,睾丸、附睾、输精管和精囊腺的重量增加,血浆睾硐水平升高;但松果腺重量和褪黑素（Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ,ＭＬＴ）含量降低。４月中旬至５月下旬为性活跃期,性腺器官显著增重,睾硐水平升至最高;而松果腺重量和ＭＬＴ含量呈现最低水平。６月至８月,鼠兔的性腺功能明显减弱;而松果腺重量和ＭＬＴ含量开始升高,此时为抑制期。９月至１月为性休止期,性腺器官的重量及血浆睾硐水平维持在最低水平;而松果腺重量和ＭＬＴ含量在较高的水平波动。结果表明,高原鼠兔的繁殖呈现明显的季节性。其松果腺活动的年周期反映了自然光周期的变化,并与鼠兔的季节性繁殖密切相关。     

不同海拔高原鼠兔、大白鼠血红蛋白电泳及血液学对比观察

人类的不同类型的血红蛋白类型具有不同的氧亲和力。上海生理所研究发现移居到西藏高原后在比较长期生活在低氧环境后 ,有形成一种新的血红蛋白趋向 ,并认为这是人体对低氧环境的一种适应性改变。在此报道基础上 ,西藏医科所又在西藏三个不同海拔地区 ,对移居、世居和只进入高原三个月的人群作了血红蛋白类型检查。结果发现血红蛋白电泳图谱呈四条带 ,即除了有低海拔地区正常人的Ａ1、Ａ2 和Ｆ三种类型血红蛋白外 ,还有另一种血红蛋白 ,并将它暂称为血红蛋白Ｘ。而对高原土生动物以及迁饲大白鼠 ,在低氧环境下其血红蛋白类型是否出现异常变…