微生物活细胞的固定化

随着固定化酶和固定化细胞技术的发展,近年来人们十分注意活细胞的固定化。众所周知,以往利用固定化细胞生产L-天门冬氨酸和L-苹果酸的酶反应都是单一酶催化的,这种细胞是死的,而仅仅细胞内的酶有活性。可     

疏水吸附固定化天冬氨酸酶及其性质的研究

本文论述了一种N-烷基琼脂珠衍生物的合成方法,研究了pH,离子强度、载体上疏水基团含量等因素对载体吸附天冬氨酸酶的影响以及固定化天冬酸酶的性质。结果表明邻甲苯胺基琼脂珠在pH5.5,0.1mol/L磷酸缓冲液(含有0.25mol/LKCL)中,每克湿载体可吸附15—25mg酶蛋白,酶活力回收达90％以上。固定化酶的性质有所改变,其热稳定性和操作稳定性明显增强。 固定化天冬氨酸酸柱可以用于连续化生产L-天冬氮酸,在pH8.0,1.0mol/L及丁烯二酸铵(含0.02mol/L MgCl_2),30℃条件下,以空间流速SV=3.5操作2个月,固定化酶活力仍保持79.5％。     

利用甲壳素固定大肠杆菌（E.coli）细胞转化苯丙酮酸形成L—苯丙氨酸的研究

利用甲壳素作为固定化介质,能够保留83.3％的游离细胞转氨酶活性,以0.35mol/L苯丙酮酸为前体,于37℃下反应9小时,可产L-苯丙氨酸54.3g/L,其克分子转化率为94％。同时,用25％戊二醛溶液(30μl/g·cell)处理细胞1小时,再用0.3％OP溶液浸泡处理15小时,可以使固定化细胞转化率有较大的提高,Mg~(2+)对转化也有促进作用。     

固定化微生物处理模拟污染地表水

以聚乙烯醇和海藻酸钠为包埋剂、驯化后的活性污泥为包埋菌剂,制备固定化微生物颗粒,其中包埋剂与包埋菌剂的比例为2:1。将该固定化微生物颗粒按20%的填充率装填到自制反应器中,用于处理模拟污染地表水,研究该固定化微生物的性能特点及其对模拟污染地表水的净化效果。结果表明:固定化微生物反应器的最佳水力停留时间为10h,最佳进水COD负荷为1.15～1.85g·L-1·d-1。在水温为20～29℃、溶解氧为3～4mg·L-1、水力停留时间为10h的条件下,当进水COD浓度为70.58～91.76mg·L-1、铵氮浓度为13.68～17.82mg·L-1时,COD去除率>62.3%,铵氮去除率>90.6%,表明固定化微生物能够有效地去除污染地表水中的COD和铵氮。     

Eupergit C250L固定化D-海因酶及其催化性质

D-海因酶是海因酶法制备D-氨基酸的关键酶。利用Burkholderic cepecia1003菌发酵产酶,所得海因酶纯化后,以Eupergit C250L为载体进行共价固定化。分别考察了酶液蛋白浓度、固定化时间对蛋白固定量和酶活回收率的影响以及固定化前后海因酶催化性质的变化。结果表明:较高的酶液蛋白浓度和较长的固定化时间均有助于改善海因酶的固定化效果;固定化可显著提高海因酶的最适作用温度,但对其最适作用pH影响不大;固定化后海因酶对D,L-BH和MH的米氏常数均有较大幅度的降低。固定化酶反应器的实验表明:40℃下,底物(D,L-BH)1.0 g.L-1,体积流速1.0 mL.min-1,经21 h转化,产物N-Phe质量浓度可达0.47 g.L-1,转化率达43.21%。     

卡拉胶包埋乳酸菌的研究

用5%K—卡拉胶包埋乳酸菌,经0.5％戊二醛和0.2M已二胺溶液加固处理,得到了一种较为满意的固定化乳酸菌。扫描电镜观察表明卡拉胶有效地包埋了大量乳酸菌,但固定化乳酸菌的产酸能力与游离乳酸菌的产酸能力无显著差异,同时温度、柠檬酸钠等因素对固定化乳酸菌产酸能力的影响小于对游离乳酸菌的影响。     

利用固定化酵母细胞转化反式肉桂酸生产L-苯丙氨酸

研究了探红酵母(Rhodotorula rubra)的培养基成分、培养固定化及转化条件。实验表明最佳培养基成分(％)：葡萄糖0 5,胰蛋白胨0．5,酵母膏0．5,磷酸二氢钾0．05,L-Phe0．05,pH．0,30℃,20L发酵罐中培养15～17h.最佳固定化条件为：用2．5％卡拉胶包埋18％的湿菌体。最佳转化条件为：1．0％反式肉桂酸,4mol／L铵离子,pH10．5,30℃。用卡拉胶固定化的深红酵母(Rhodotorula rubra)可以将77．7％的反式肉桂酸转化为L-苯丙氪酸。     

多酶共固定化的研究进展

固定化酶技术是现代生物催化的核心技术。过去几十年里,固定化酶技术的研究主要集中在单酶固定化。近年来,多酶共固定化由于具有可增加反应的局部浓度、提高反应收率等优点而得到研究者的广泛关注。本文根据国内外研究现状并结合本实验研究从多酶非特异性共价共固定化、非特异性非共价共固定化、非共价包埋固定化以及位点特异性固定化四个方面阐述多酶固定化方法的研究进展,并分析和展望了其在工业上的应用前景。     

固定化生物催化剂的研究动向

近年来,国内外对于固定化酶、固定化细胞、固定化细胞器以及生物传感器的研究很活跃,在固定化方法上取得了较大进展,一部分固定化酶、固定化微生物细胞以及生物传感器在食品发酵工业、有机合成工业、化学分析、临床诊断以及能源开发等方面得到了应用。目前,大多数固定化酶、固定化细胞以及生物传感器还处在实验室研究阶段或中试阶段,有待改进;动物细胞、植物细胞以及细胞器的固定化研究还处于探索阶段、有待深入。     

固定化细胞合成生物表面活性剂鼠李糖脂的研究

从石油受污环境中分离筛选得到一株高产鼠李糖脂(rhamnolipid,RL)的假单胞菌(Pseudomonas sp.)B3。在游离细胞合成鼠李糖脂的基础上,应用包埋与交联相结合的复合固定化方法制备出性能优良的固定化细胞。以二次回归方程预测模型为基础,对发酵条件进行优化,得到B3固定化细胞合成RL的最优条件为:接种量15%,初始pH 7.0,合成温度38℃,120r·min-1振荡培养100h,RL的产量达到4 843.25mg·L-1,比游离细胞提高56.42%。制备的固定化细胞连续使用3个发酵周期,RL的产量均保持在4 517.75mg·L-1以上,说明B3固定化细胞具有用于连续发酵合成RL的可行性。     

L-谷氨酸氧化酶与CBD的融合表达及其在微晶纤维素上固定化分析

酶的固定化作为一种重要的技术,已在生物催化领域得到了广泛的应用。现将来源于普拉特链霉菌3304(Streptomyces platensis NTU3304)产生的胞外L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase,Gox)基因gox融合到来源于粪碱纤维单胞菌Cellulomonas fimi的纤维素结合域(CBDcex)的基因上,构建表达载体p ETM10-Gox-CBD,并在大肠杆菌中表达。通过蛋白纯化获得融合蛋白,并命名为Gox-CBD。利用CBD对微晶纤维素特异性吸附的特性将其固定在微晶纤维素上,并对固定化酶的制备条件、结合量、酶学性质及其微晶纤维素结合稳定性等进行了研究。在4℃条件下结合约1 h,融合蛋白Gox-CBD结合在纤维素上的结合量即可达到9.0 mg/g。通过对重组型、融合表达游离的以及固定化在微晶纤维素上的谷氨酸氧化酶的酶学性质进行比较发现,固定化酶的比酶活有所降低;但固定化酶的热稳定性相对于游离酶有了很大的提高,在60℃孵育30 min后还保留有约70%的活性,而游离的重组Gox在相同条件下几乎完全失去活性。当固定化结合蛋白在p H10或者盐浓度5 mmol/L的Na Cl条件下可以牢固结合。并且可以通过一步纯化方法固定化融合蛋白Gox-CBD于微晶纤维素上。因此,L-谷氨酸氧化酶与纤维素结合域融合表达的研究为蛋白的纯化及酶的固定化提供了一种新策略。     

土壤霉菌菌丝球的筛选、鉴定及固定化菌丝球的应用

从土壤中分离纯化真菌并鉴定为烟曲霉L-3。以菌株L-3作为固定化载体,将地衣芽孢杆菌固定在真菌上组成固定化体系。研究了混菌菌丝球,菌丝饼,发酵混合液,粗漆酶液对刚果红染料废水的降解情况并对染料废水进行毒性试验。结果表明,菌丝球对染料废水的降解效果最显著,降解率高达99.96%,菌丝饼仅用20 s降解率为91%,发酵混合液与粗漆酶液的处理效果并不显著。该体系对染料废水的去毒率较明显,尤其是菌丝球的去毒率可达到78%。可见,固定化体系对染料废水不但有较高的降解能力,也有较高的去毒率。     

酶法提取玉米胚中总黄酮的研究

尝试使用α-淀粉酶进行糖苷转移提取玉米中总黄酮,同时对α-淀粉酶的固定化进行研究。对α-淀粉酶固定化的研究表明:以壳聚糖为载体,用体积分数4%戊二醛进行交联,加酶量为3 g.L-1条件下可以获得最佳的固定化效果;与游离酶相比,其最适作用温度范围、pH值范围均比游离酶范围宽;固定化酶的热稳定性优于游离酶,且具有良好的操作稳定性。本试验使用游离酶法、固定化酶法提取玉米中总黄酮,得率分别为2.82%、2.46%。     

改性壳聚糖固定化脂肪酶的研究

以化学改性后的壳聚糖为载体固定假丝酵母99-125脂肪酶,研究了不同的活化剂对壳聚糖表面羟基基团的活化程度,及以活化后壳聚糖为载体采用不同固定化方法对假丝酵母脂肪酶固定效果的影响。结果表明1-乙基-3-(3-甲基氨基)丙基碳二亚胺可有效的活化壳聚糖表面羟基,活化后的壳聚糖表面氨基与戊二醛偶联后形成的壳聚糖为良好的脂肪酶固定化载体,其固定脂肪酶的水解活力可高达86.8U/g。此外,还对影响固定化进程中的各种因素进行了研究,确定最优条件,比较了固定化前后酶的热稳定性、有机溶剂稳定性及最适反应温度。并考察了该固定化脂肪酶催化合成棕榈酸十六酯的操作稳定性,结果表明,连续反应16批之后棕榈酸十六酯的转化率仍能达到85%以上。     

固定化脂肪酶催化制备L-薄荷醇

用大孔树脂NKA固定高选择性的脂肪酶,催化有机相中转酯化反应,从而拆分八异构体消旋薄荷醇来制备L-薄荷醇。研究pH、载体与酶比例对固定化酶制备的影响及固定化酶的反应稳定性;考察温度、转酯化过程醇酯比例、及底物醇异构组成变化对拆分效果的影响。结果表明:固定化酶的最适pH为8,载体与酶的比例为5∶1时,所得固定化酶的反应稳定性比游离酶的反应稳定性提高了约50%;转酯化反应的最优温度为40℃,醇酯比例为1.5∶1时最佳,改进八异构体消旋薄荷醇组分比例后,非对映体选择率dep达到了95.1%。     

丝胶蛋白粉末的制备及其应用于L-天冬酰胺酶的固定化

蚕丝蛋白经高压高温水脱胶后所得的丝胶溶液,经过纯化、浓缩以及喷雾干燥,制成丝胶蛋白粉末.这种丝胶蛋白分子质量高达200 ku,其粉末呈白色,平均粒度10 μm,为热水溶性蛋白.以这种丝胶蛋白粉末为载体,用戊二醛为交联剂,制成固定化L-天冬酰胺酶.对这种固定化酶活性和动力学性质进行初步研究和分析,结果表明这种固定化酶性能稳定,对热的稳定性有所提高,并具有较好的操作稳定性,抗胰蛋白酶水解能力大大提高.     

固定化米根霉生产L－乳酸的研究

开发了利用聚氨酯泡沫为载体固定化米根霉生产Ｌ－乳酸的新工艺。确定了固定化细胞发酵条件：葡萄糖浓度为５０ｇ／ｌ,载体立方体边长为４～８ｍｍ,载体量为２０ｃｍ３／７０ｍｌ培养基,固定化细胞制备培养时间为２４ｈ．利用固定化细胞发酵产酸速率是游离菌的３倍以上,对糖转化率达７７．７０％,与理论转化率相近。该固定化细胞应用在反复间歇发酵中可稳定１０批次以上。     

三相流化床中固定化米根霉萃取发酵生产L-乳酸

以TRPO／磺化煤油为萃取剂,在2L三相流床反应器中进行了固定化米根霉原位萃取和异位萃取发酵生产L-乳酸的实验,结果表明,发酵液中的pH值能被控制在3．5左右．产酸速率高达每小时．每1L固定化颗粒产生11gL-乳酸。提出了一个数学模型用以描述萃取发酵中L-乳酸的积累及在各相的分配情况。模型计算曲线与实验值符合良好。     

产L-苹果酸重组大肠杆菌的构建

基于产琥珀酸重组大肠杆菌E.coli B0013-1050的琥珀酸合成途径,利用Red同源重组技术结合Xer/dif重组系统敲除富马酸酶基因fumB、fumC,苹果酸酶基因maeB,构建L-苹果酸合成途径,最终得到重组大肠杆菌E.coli2030,该菌株在15 L发酵罐中,产L-苹果酸12.5 g/L,葡萄糖-苹果酸转化率为52.1%,同时对发酵产物中主要杂酸丙酮酸和琥珀酸的生产原因进行了初步的探讨与分析。为进一步提高L-苹果酸的转化率,整合表达来源于黄曲霉的苹果酸脱氢酶基因,构建重组菌E.coli 2040,在15 L发酵罐中产L-苹果酸14 g/L,葡萄糖-苹果酸转化率提高到60.3%。     

纳米材料固定化酶的研究进展

近年来,纳米技术为酶固定化提供了多种纳米级材料,纳米材料固定化酶不仅具有高的酶负载量,而且具有良好的酶稳定性。本文基于纳米材料固定化酶,对纳米材料的种类进行了总结,分析了纳米材料对固定化酶性能的影响,并介绍了纳米级固定化方法及纳米材料固定化酶在生物转化、生物传感器、生物燃料电池等领域的应用。