农杆菌转化获得转B．t．基因水稻及其生物学鉴定

以水稻主栽品种"秀水11"和"春江11"预培养4d未成熟胚为转化受体,经农杆茵LBA4404／pGBI4A2B(含B．t．基因)感染后,筛选出抗性愈伤组织并获得转化植株。其中抗性愈伤组织产生频率达44％～70％,转化植株产生频率达27％～64％。转基因植物总DNA经PCR和Southernblot分子杂交试验表明,T-DNA上的外源基因已整合到水稻的基因组里。对转B．t．基因水稻植株进行了两种水稻主要害虫纵卷叶螟和二化螟的饲虫试验。与对照相比,7d后纵卷叶螟幼虫死亡率达31％～49％,同时纵卷叶螟对转基因水稻叶片的危害程度大大减轻。二化螟在咬食转B．t．基因水稻植株7d后的校正死亡率达15％～71％,30d后多数转基因水稻仍能正常抽穗,表明转基因水稻对上述害虫具有一定抗性。     

根癌农杆菌介导转化水稻成熟胚及转Metr基因植株的获得

以粳稻品种广陵香糯为材料,用携带有双元载体pBB的根癌农杆菌EHA105为载体,研究了根癌农杆菌介导转化粳稻成熟胚愈伤组织的几个影响因素,建立了合适的粳稻成熟胚愈伤组织转化系统。一种基于MS为基本培养基的商品培养基(HRM)较适合于作为粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基,合适的愈伤组织诱导培养天数为7~8 d,合适的筛选培养基为CC培养基。在此基础上,将Metr基因导入粳稻品种广陵香糯中,获得了一批转基因水稻植株,PCR分析表明外源基因已经整合进了水稻的基因组中。部分转基因植株后代遗传分析表明外源基因的分离符合3∶1的理论比例。     

根癌农杆菌介导B.t.基因和CpTI基因对花椰菜的转化

用根癌农杆菌介导的方法 ,将B .t.基因和Cp TI基因分别导入花椰菜“杂交 75天”的父本和母本的无菌苗下胚轴切段细胞 ,都获得了转基因植株。经过预培养的下胚轴切段用根癌农杆菌 (LBA44 0 4/ pG BI4A2B ,含B .t .基因 ;LBA44 0 4/pBRLC ,含CpTI基因 )进行感染后 ,共培养 48h ,继续培养 30d后 ,将分化芽转移至筛选培养基上。 10d后 ,大多数分化芽的顶端变成紫色 ,2 0d后紫色芽逐渐变白死亡 ,而转化芽在选择培养基上长成小植株。小植株移至大田能正常生长、开花、结籽。PCR和Southernblot分析表明B .t和CpTI基因已整合在植物基因组中     

青菜的高效再生和农杆菌介导B.t.及CpTI基因的转化

分别对培养基中适宜的激素组成和AgNO3 添加浓度进行研究 ,建立了青菜下胚轴和子叶外植体的高效再生系统 ,青菜品种“矮抗青”的最高芽分化频率下胚轴可达 6 5 % ,子叶为 5 2 %左右。在此基础上 ,对影响转化频率的不同因素进行了探讨 ,共获 94株卡那霉素抗性植株。对转基因植株总DNA的Southernblot ting分析证明 ,B .t .基因和CpTI基因已整合到青菜植株的细胞核基因组中。经过抗虫性筛选试验 ,从转基因植株的T3 代筛选到 7个转B .t.基因的抗虫纯合株系和 5个转CpTI基因的抗虫纯合株系 ,并进入田间小区青菜抗虫新品种试验     

根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立

比较了影响根癌农杆菌转化水稻的各种因素后,建立了农杆菌介导的水稻高效转基因实验体系。按该体系,水稻品种中花１１号预培养４ｄ的幼胚经农杆菌ＥＨＡ１０５／ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１感染后,具有ＧＵＳ基因瞬间表达的幼胚比例在５０％以上,最高可达９０％,按产生潮霉素抗性愈伤和转基因植株的比例计算,转化率分别达到了８７．６％和６４．６％。     

简单高效的根癌农杆菌介导的水稻基因转化方法

本文在研究影响农杆菌介导的水稻转化的主要因素基础上,建立了一套简单、高效的水稻转基因系统。将水稻成熟胚来源的愈伤组织用农杆菌EHA101／pHQ9,EHA101／pHQ10,EHA101／pHQT3感染后,筛选抗性愈伤,经分化获得转化株。抗性愈伤的平均得率为约100个愈伤／g愈伤外植体,抗性愈伤的分化频率平均高达85％。转基因植株的GUS染色、Southern杂交结果表明,T-DNA上的外源基因已整合进转基因植物的基因组中。转基因植株T1代对潮霉素的抗性表明,多数转基因株系符合孟德尔分离比3：1。该系统的建立将有助于应用T—DNA标签法和基因打靶法进行水稻功能基因组的研究。     

根癌农杆菌介导Bt基因转化水稻的研究

为了培育出无筛选标记基因的转基因水稻,试验将loxp-hpt-loxp基因与成基因连锁在-起转化水稻方法,得到loxp-hpt—loxp—Bt转基因水稻植株,再与同质的带有ere基因的水稻杂交,以定向删除潮霉素抗性筛选标记。试验表明以水稻品种“皖粳97”为供试材料,将成熟胚来源的愈伤组织用根癌农杆菌EHA105／pCAMBIA1305．1感染后,筛选出抗性愈伤组织并获得再生植株。经PCR验证,得到20棵转基因水稻植株。     

简单高效的根癌农杆菌介导的水稻基因转化方法

本文在研究影响农杆菌介导的水稻转化的主要因素基础上,建立了一套简单、高效的水稻转基因系统。将水稻成熟胚来源的愈伤组织用农杆菌EHA101/pHQ9,EHA 101/pHQ 10,EHA 101/pHQ T3感染后,筛选抗性愈伤,经分化获得转化株。抗性愈伤的平均得率为约100个愈伤/g愈伤外植体,抗性愈伤的分化频率平均高达85%。转基因植株的GUS染色、Southern杂交结果表明,T-DNA上的外源基因已整合进转基因植物的基因组中。转基因植株T1代对潮霉素的抗性表明,多数转基因株系符合孟德尔分离比3∶1。该系统的建立将有助于应用T-DNA标签法和基因打靶法进行水稻功能基因组的研究。     

根癌农杆菌介导转化诸葛莱获得转基因植株

以诸葛莱下胚轴和子叶为材料,在附加ＢＡ和ＮＡＡ的ＭＳ培养在上诱导芽于生,在１／２ＭＳ培养基上诱导生根,获得完整再生植株,建立了诸葛菜组织培养高频再生体系,再用根癌农杆菌介地转化炒下胚了叶,在附加一定量的氨邪说青霉素,头孢霉和卡那霉素的相应增减基上进行筛选,并增减再生成苗,获得完整抗性再生植株,移植到盛有土壤的花盆中均可存活,生长正常,将再生植株叶片,进行ＧＵＳ、ＮＰＴⅡ酶活性性测定和Ｓｏｕｔｂｅｒ     

根癌农杆菌介导的转新城疫病毒融合蛋白基因水稻植株的获得

利用转基因植物作为生物反应器可以表达重组蛋白、生产外源蛋白质,也可以成为动物疫苗的廉价生产系统。以编码新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)的基因为外源基因,以玉米泛素蛋白(Ubi)启动子为启动子,以潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因作为选择标记基因,β-半乳糖苷酸酶(GUS)基因作为报告基因构建了适宜于农杆菌介导转化水稻的表达质粒pUNDV,并通过农杆菌介导转化水稻,获得了多株转基因植株。通过PCR分析和GUS活性检测,证实含有NDV-F基因的T-DNA已整合到水稻核基因组中,为研制廉价安全的转基因水稻新城疫基因工程疫苗奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立

比较了影响根癌农杆菌转化水稻的各种因素后,建立了农杆菌介导的水稻高效转基因实验体系。按该体系,水稻品种中花11号预培养4d的幼胚经农杆菌EHA105／pCAMBIA1301感染后,具有GUS基因瞬间表达的幼胚比例在50％以上,最高可达90％;按产生潮霉素抗性愈伤和转基因植株的比例计算,转化率分别达到87．6％和64．6％。转基因植株总DNA的Southern杂交分析表明T－DNA上的外源基因已整合进了水稻基因组,且在大多数转基因植株中表现为单拷贝插入;遗传分析证明T1代的表型分离符合孟德尔法则。此转化系统的建立为高效地将有用的外源DNA导入水稻植株奠定了基础。     

利用根癌农杆菌和基因枪法转化获得转抗虫融合蛋白基因（Bt—CpTI）甘蓝植株

以下胚轴,带柄子叶和茎尖为外植体,利用根癌农杆菌和基因枪法将抗虫融合蛋白基因（Bt-CpTI)导入甘蓝品种“中甘8号”,得到了13株卡那霉素抗性植株,经PCR扩增反应和Southern blot分子验证表明;农杆菌介导转化下胚轴和带柄子叶来源的Ⅰ型抗性植株均为转基因植株,而农杆菌介导转化茎尖外植体得到的Ⅱ型抗性植株属“假阳性”植株,基因枪介导转化茎尖的2株Ⅲ型植株中,有1株是非转基因植株,经胰蛋白酶抑制剂活性分析和抗虫测试证明,部分转基因植株有较高的胰蛋白酶抑制剂活性和抗菜青虫能力。     

应用B.t.和SBTi基因提高水稻抗虫性的研究

用基因枪法将单个B.t.基因或与SBTi基因一起导入到两个华南地区优良籼稻品种中,获得21个转B.t.单基因的植株系,4个转B.t.和SBTi双基因的植株系。对R1代植株的分子杂交和遗传分析表明,3个转双基因系中多个拷贝的B.t.和SBTi基因均是整合在植株基因组同一染色体上相同或相近位点。Northern blot证明在R2代转基因植株中B.t.基因稳定表达。对稻纵卷叶螟的抗性实验表明,转B.t.单基因或B.t.和SBTi双基因的转基因植株均较原种对照有更强的抗性,而转双基因植株较转单基因植株又有更强的抗性。     

根癌农杆菌介导的水稻转化研究进展

农杆菌介导的水稻基因转化是水稻基因转化的热门。本文对由农杆菌介导转化获得的水稻品系（品种）,影响农杆菌介导转化的因素,农村菌浸染的方法,外源基因的检测和遗传等方面作综合论述,并提出了农杆菌介导转化水稻的前景。     

根癌农杆菌介导的高羊茅遗传转化研究

采用携带卡那霉素抗性基因nptⅡ和Na^ ／H^ 反向运输AtNHX1基因的表达载体pROK2／AtNHX1(带有35S启动子)和pROK2U／AtNHX1(带有ubi1启动子)的根癌农杆菌AGL1和GV3101,对4个品种高羊茅下胚轴来源的胚性愈伤组织进行了遗传转化。胚性愈伤组织经根癌农杆菌感染和共培养后,用50～150mg／L巴龙霉素筛选抗性愈伤组织,获得1126棵再生植株,用10～20mg／L卡那霉素进一步筛选再生植株,总共得到525棵绿色抗性植株。抗性植株的总DNA用AtNHX1基因的特异引物进行PCR检测,其中21棵为PCR阳性,最高转化频率为1．77％。Southern杂交结果证实,外源基因以低拷贝整合到高羊茅的基因组中,实验发现,在不同品种之间转化效率有所差异。     

通过根癌农杆菌介导的共转化获得具有蜡质基因反义片段的转基因水稻

在构建剔除潮霉素抗性基因的反义蜡质基因重组质粒p13W8的基础上,用分别携带p13W8质粒和有潮霉素抗性基因的pCAMBIA1300质粒的根癌农杆菌,在不同处理条件下对粳稻3个品种进行共转化.试验结果显示,共感染混合液中pCAMBIA1300菌液比例高,抗性愈伤组织的转化频率也较高;抗性愈伤组织的PCR检测结果表明,潮霉素抗性基因的阳性检测率为98%,反义蜡质基因的阳性检测率为68%.在105株转基因植株中,反义蜡质基因阳性株为30株,占转基因植株的28.6%.乙酰丁香酮处理组的平均转化频率略高于未处理组;在乙酰丁香酮的各种处理中,直接浸泡愈伤组织的转化频率稍高于其它处理方式.     

根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植的再生

用根癌农杆菌共培养法把外源基因导入甘蓝型油菜主要栽培品种“云北２号”,获得转基因植株。所用外植体为带有１－２ｍｍ子叶柄的完整子叶,根癌农杆菌为Ａ２０８ＳＥ（ｐＴｉＴ３７－ＳＥ,ｐＲＯＡ９３）。Ｔｉ质粒ｐＲＯＡ９３带有ＮＰＴⅡ及ＧＵＳ嵌合基因。共培养２天后转到附加２５ｍｇ／Ｌ卡那霉素的分化培养基（ＭＳ＋４．５ｍｇ／ＬＢＡＰ）上。ＡｇＮＯ３和羧苄青霉素促进芽的分化,头孢霉素则有抑制作用。最高转化频率为     

农杆菌介导将白叶枯病抗性基因Xa21导入水稻获得转基因植株

利用农杆菌介导的高效遗传转化系统,将白叶枯病抗性基因Xa21转入黄淮稻区主栽品种豫粳6号的胚性愈伤组织,获得转基因植株,GUS染色和PCR分析证明Xa21基因已整合到水稻基因组中,其自交T1代植株经GUS染色和白叶枯病接种鉴定呈现3：1分离,研究为培育抗白叶枯病水稻品种奠定了基础。     

农杆菌介导的水稻转Bt基因研究

通过农杆菌介导法 ,将Bt毒蛋白基因的一种—cryIAb基因导入 2个云南水稻栽培品种(滇系 4号 ,合系 39号 )的愈伤组织中 ,经过潮霉素筛选后 ,获得了一批抗性苗 ,部分苗经PCR检测为阳性 ,GUS组织化学染色分析发现Bt基因已整合到水稻基因组 ,并由此建立了一套有效的水稻遗传转化体系。实验中发现培养器皿的透气性对水稻愈伤组织的形成、生长具有较大的影响 ,提高培养基的渗透势能够提高愈伤组织的分化率。选择合适的洗菌液渗透势能够大大降低洗菌对愈伤组织所造成的损伤 ,从而提高转化率。     

根癌农杆菌介导转化诸葛菜获得转基因植株

以诸葛菜下胚轴和子叶为材料,在附加BA和NAA的MS培养基上诱导芽再生,在1／2MS培养基上诱导生根,获得完整再生植株,建立了诸葛菜组织培养高频再生体系,再用很癌农杆菌介导转化诸葛菜下胚轴和子叶,在附加一定量的氨苄青霉素、头孢霉素和卡那霉素的相应培养基上进行筛选,并培养再生成苗,获得完整抗性再生植株,移植到盛有土壤的花盆中均可存活,生长正常。将再生植株叶片,进行GUS、NPTⅡ酶活性测定和Southernblot分子杂交,证实外源基因已稳定整合到植物基因组中,并高效表达。