人脐静脉内皮细胞的原代培养和鉴定

目的：探索建立稳定有效的脐静脉内皮细胞体外培养方法。方法：用0．1％II型胶原酶消化分离人脐静脉肉皮细胞,加入含内皮细胞生长因子的M199完全培养液中培养,用胰蛋白酶-EDTA进行消化传代培养,用光镜和免疫组化方法对培养的细胞进行形态观察和鉴定。结果：原代培养的内皮细胞在接种后24h后完全贴壁生长,第445天后融合呈铺路石样镶嵌排列,免疫组化可见胞浆中第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应,证实培养的细胞为内皮细胞。结论：脐静脉灌注II型胶原酶消化法配合M199完全培养液可获得高纯度的内皮细胞,细胞可传代5—6次,但细胞产出量不高,不能传10代以上,5代以后细胞形态变化较大,对于复杂的基础研究应用受限。     

王不留行黄酮苷对过氧化氢和高糖诱导损伤的人脐静脉内皮细胞的保护作用

体外培养人脐静脉内皮细胞,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒评价王不留行黄酮苷孵育24 h后的细胞毒性。先给予13.76、6.88、3.44μmol/L的王不留行黄酮苷和维生素C阳性对照组(浓度为100μmol/L)预孵育12 h后,再分别以H2O2和高糖诱导内皮细胞损伤。SRB法测定细胞活力,试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。与模型组相比,王不留行黄酮苷13.76、6.88、3.44μmol/L组均可改善H2O2和高糖损伤模型的细胞活力,尤以13.76μmol/L作用最为显著(P0.01);并且王不留行黄酮苷13.76μmol/L显著降低H2O2和高糖损伤组培养液中LDH和MDA释放量,增强细胞内SOD活性。     

血红素对人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤的保护作用

采用过氧化氢作用于人脐静脉内皮细胞 ,成功地制作了氧化应激损伤的细胞模型 ,将培养的细胞分为 3组 :正常对照组 ,损伤组 (给予过氧化氢 )和血红素组 (同损伤组的制备 ,预先加入血红素 ) .观察各组细胞在光、电镜下形态学和蛋白质电泳的改变 ,用MTT法检测了各组细胞的生长状态 .结果表明 :在血红素组 ,细胞生长状态、MTT水平和蛋白质电泳结果与损伤组相比有明显好转且差异显著 ,证明血红素对人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤有明显的保护作用 .     

阿魏酸在缺氧条件下促进人脐静脉内皮细胞血管形成的实验研究

目的:研究阿魏酸(ferulic acid,FA)在缺氧条件下对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖、迁移和管腔样结构形成的影响。方法:原代培养人脐静脉内皮细胞,在缺氧实验条件下,细胞被分为7组,即1个对照组和6个实验组。对照组采用1%酒精处理,实验组用不同浓度(1×10~(-8)、1×10~(-7)、1×10~(-6)、1×10~(-5)、1×10~(-4)及1×10~(-3) mol/L)的阿魏酸处理。分别采用MTS法、划痕法、Matrigel法分析不同浓度阿魏酸处理对人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和管腔样结构形成的影响。结果:缺氧条件下,浓度为1×10~(-6)~1×10~(-4)mol/L的阿魏酸处理能明显促进HUVECs的增殖(P0.05),以1×10~(-5) mol/L处理的效果最好(P0.01);与对照组相比,1×10~(-6)mol/L(P0.05)、1×10~(-5) mol/L(P0.01)及1×10~(-4) mol/L(P0.01)阿魏酸处理均能明显促进HUVECs横向迁移,以1×10~(-5) mol/L处理迁移的细胞数量最多;1×10~(-8)~1×10~(-4) mol/L阿魏酸处理能不同程度地促进HUVECs管腔样结构的形成,以1×10~(-5) mol/L处理形成管腔样结构的数量最多(P0.01)。结论:阿魏酸在缺氧条件下能促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和管腔样结构形成。     

血管紧张素Ⅱ促进内皮细胞凋亡和NOX4表达

目的分析高浓度血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激人脐静脉内皮细胞（HUVECs）时细胞内活性氧（ROS）、NOX4mRNA水平和细胞凋亡的变化。方法倒置显微镜下观察人脐静脉内皮细胞形态;免疫组化法检测人脐静脉内皮细胞Ⅷ因子相关抗原的表达;RT—PCR检测HUVECs中NOX4的表达;流式细胞仪检测各组细胞内ROS生成量和细胞凋亡率,Hoechst染色分析细胞凋亡。结果高AngⅡ刺激HUVECs时,NOX4mRNA表达上调,细胞内ROS生成增加,细胞凋亡增加。结论高AngⅡ上调HUVCEs内NOX4mR—NA表达并促进细胞内ROS生成和细胞凋亡。     

番茄红素对血管内皮细胞氧化应激损伤的作用及机制研究

目的:观察番茄红素(lycopene,LYC)对于血管内皮细胞功能的作用,探讨其作用机制。方法:人脐静脉内皮细胞(HUVECs)处理实验分组:对照组,H2O2组,H2O2+LYC组(1、2、4、8μmolL-1)。MTT法检测HUVECs存活率;免疫印迹法(Western blot)检测p38MAPK蛋白磷酸化水平、抗凋亡蛋白B淋巴细胞/白血病-2(bcl-2)及线粒体凋亡通路相关蛋白bax的表达;细胞黏附能力测定和伤口愈合实验检测HUVECs粘附率和迁移率;TUNEL法检测HUVECs凋亡率;ELASA法测定HUVECs内活性氧(ROS),超氧化物歧化酶(SOD),乳酸盐脱氢酶(LDH)释放量和caspase-3的活性。结果:H2O2损伤后HUVECs存活率显著降低(P0.01),凋亡率显著增加(P0.01),黏附和迁移能力显著降低(P0.01),bax和p-p38MAPK的表达上调,bcl-2的表达下调,并且ROS、LDH的释放和caspase-3的活性增加(P0.01),SOD的释放减少。而LYC的预处理可以明显逆转H2O2以上作用。结论:H2O2氧化应激损伤中,LYC保护内皮细胞可能与其抗过氧化损伤细胞凋亡,抑制异常的p38MAPK信号通路有关。     

丹参酮ⅡA对正常和氧化损伤内皮细胞的保护作用研究

采用过氧化氢诱导建立的内皮细胞氧化损伤模型,探讨了丹参酮ⅡA对氧化损伤的HUVECs的保护作用.通过内皮细胞LDH、SOD、NOS、GSH-Px的活性和MDA、NO含量的变化趋势,MTT和流式细胞术反映的细胞存活率的变化,研究了丹参酮ⅡA对正常和氧化损伤HUVECs的作用.结果表明丹参酮ⅡA在10～100μmol/L浓度之间时,无明显细胞毒性.浓度在20 μmol/L以上时,丹参酮ⅡA能显著增强HUVECs抵御氧化损伤的能力;同时降低了LDH的泄漏,阻止了MDA等过氧化物的生成,提高了NOS、NO、SOD和GSH-PX分泌量,显著减少了细胞早期凋亡率和坏死率.表明丹参酮ⅡA可以保护HUVECs免受氧化损伤,防止动脉粥样硬化斑块的形成.     

β-谷甾醇对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的抑制作用

目的 探讨β-谷甾醇(β-sitosterol)对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)损伤的作用及其机制.方法 将HUVECs分为对照组、单纯高糖组、高糖+10μmol/Lβ-谷甾醇组和高糖+50μmol/Lβ-谷甾醇组,用中性红摄取法...     

脂联素在高糖孵育血管内皮细胞中的表达调节

目的:探讨脂联素(APN)在高糖孵育血管内皮细胞中的表达调节及意义.方法:用不同浓度葡萄糖(5.5、11、22及33mM)孵育人脐静脉内皮细胞(HUVECs),2天后收集细胞和上清液.用实时荧光定量RT-PCR方法检测细胞中APN、肿瘤坏死因子α(TNFα)和过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)的mRNA表达,用ELISA方法检测细胞上清液中APN和TNFα分泌情况.结果:随培养液中葡萄糖浓度的升高,HUVECs中APN的mRNA表达及上清中APN蛋白含量降低(p<0.05),TNFα的mRNA表达及上清中TNFα蛋白含量增加(p<0.05),HUVECs中PPARγ的mRNA表达降低(p<0.05),且组间比较差异均有统计学意义(p<0.05).结论:高糖诱导血管内皮细胞保护性细胞因子APN表达分泌下降,可能是高糖诱导的血管内皮细胞功能损害的重要机制之一.     

Influence of protein histidine phosphatase overexpression and down-regulation on human umbilical-vein endothelial cell viability

PHP (protein histidine phosphatase) is expressed by mammalian tissues, particularly in blood vessel walls. We investigated whether PHP plays a significant role in endothelial cells. By Western blot and immunofluorescence analysis PHP was found in HUVEC (human umbilical-vein endothelial cells). Overexpression of PHP by the use of a plasmid vector, pIRES2-AcGFP1-PHP, induced apoptosis in HUVEC. To exclude the possibility that increased cellular protein alone unspecifically caused cell damage, the inactive H53A mutant of PHP was also overexpressed as a control; it did not lead to apoptosis. Down-regulation of PHP by the RNAi (RNA interference) technique did not affect cell viability. In conclusion, HUVEC are damaged by overexpression, but not down-regulation, of PHP, suggesting a pronounced impact of the enzyme on the cells when its activity is increased.     

Coptis japonica Makino extract suppresses angiogenesis through regulation of cell cycle-related proteins

Angiogenesis, neovascularization from pre-existing vessels, is a key step in tumor growth and metastasis, and anti-angiogenic agents that can interfere with these essential steps of cancer development are a promising strategy for human cancer treatment. In this study, we characterized the anti-angiogenic effects of Coptis japonica Makino extract (CJME) and its mechanism of action. CJME significantly inhibited the proliferation, migration, and invasion of vascular endothelial growth factor (VEGF)-stimulated HUVECs. Furthermore, CJME suppressed VEGF-induced tube formation in vitro and VEGF-induced microvessel sprouting ex vivo. According to our study, CJME blocked VEGF-induced cell cycle transition in G1. CJME decreased expression of cell cycle-regulated proteins, including Cyclin D, Cyclin E, Cdk2, and Cdk4 in response to VEGF. Taken together, the results of our study indicate that CJME suppresses VEGF-induced angiogenic events such as proliferation, migration, and tube formation via cell cycle arrest in G1.     

Culture Conditions for the Production of Alkaline Protease from n-Paraffins by a Kabicidin Resistant Mutant No. 5–128B

A novel process for the microbial production of alkaline protease on an industrial scale was successfully established by using a kabicidin resistant mutant, No. 5–128B, derived from Fusarium sp. S–19–5. The most suitable carbon source for producing alkaline protease was n-paraffins (C₁₀~C₁₄) and the effective nitrogen source was dried-yeast cells containing no nucleic acid, the optimum concentrations being 12.5% (w/v) and 7.0% (w/v), respectively. The optimal temperature and initial pH for protease production were 24°C and 6.0, respectively. Under the optimal conditions using a shaker flask mutant No. 5–128B produced 41000 PU/ml of alkaline protease, which corresponded to about 10 times the amount produced by the parent strain. The relation between the high ability to produce alkaline protease and the resistance to kabicidin, a polyene antibiotic, is discussed.     

Suppression of Tie-1 in endothelial cells in vitro induces a change in the genome-wide expression profile reflecting an inflammatory function

Tie-1 is an endothelial specific receptor tyrosine kinase that is upregulated in diseases such as atherosclerosis and rheumatoid arthritis. We recently demonstrated that Tie-1 induced a proinflammatory response when overexpressed in endothelial cells. Here, we used a complementary approach and suppressed endogenous Tie-1 expression in endothelial cells to examine its function by microarray analysis. Tie-1 appeared to govern expression of many genes involved in inflammation. Expression knockdown of Tie-1 significantly reduced endothelial conditioned medium ability to stimulate MCP-1 production in U937 cells. Collectively, our results support the notion that Tie-1 has an inflammatory function in endothelial cells.     

人脐带动脉与脐带静脉血管内皮细胞在体外相同培养环境下的定性研究

血管内皮细胞受损与许多心脑血管疾病的发生和发展有关,已成为当今生命科学、药学领域的重要的研究对象。体外分离获得血管内皮细胞以及鉴定对于研究血管功能和为心脑血管疾病建立细胞模型极为重要。该研究通过了一种简便快捷、分离纯度高的人脐带动脉内皮细胞(human umbilical cord artery endothelial cells,HUAEC)和脐带静脉内皮细胞(human umbilical cord vein endothelial cells,HUVEC)的分离及培养体系,同时从形态特征、增殖活力、成管能力、表面抗原和特异基因的表达等方面检测了二者在体外相同培养环境下的动态变化与差异。该研究发现,HUAEC和HUVEC在体外连续传代培养过程中形态特征、成管能力、表面抗原(CD144、CD31、CD309、CD133、CD34)这几个方面作为内个皮细胞的基本特性没有明显差异,尽管HUAEC相对于HUVEC增殖活力更高。对于新鲜分离的HUAEC和HUVEC,二者特异性基因表达水平具有显著差异(HUAEC高表达EFNB2、DLL4、NRP1、CXCR4;HUVEC高表达EPHB4、COUP-TF II),然而随着培养时间的延长(传代次数的增加),HUAEC丧失其特异性基因(P6)的表达之后,HUVEC仍保持其特异性基因的高表达。因此HUVEC特异性表达基因EPHB4、COUP-TF II可以作为区分体外培养的人脐带动脉或者脐带静脉来源的内皮细胞的可靠鉴定标志基因。     

CCR2介导MCP-1诱导的人内皮细胞凋亡

本室前期工作发现,单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)可诱导人内皮细胞(hVECs)凋亡.为进一步揭示MCP-1诱导凋亡分子机理,首先观察MCP-1对hVECs CC类趋化因子受体2(C-C motifchemokine receptor-2,CCR2)蛋白表达的影响.Western印迹结果显示,MCP-1以剂量依赖方式诱导CCR2在hVECs的表达.以脂质体为载体的CCR2反义寡核苷酸序列转染hVECs后,激光共聚焦显微镜及膜联蛋白(annexin)V-FITC/PI双染流式细胞术显示,CCR2反义寡核苷酸转染hVECs48h后可明显降低CCR2蛋白质的表达(P0.05),抑制MCP-1诱导的hVECs凋亡(P0.01).反义CCR2抑制凋亡结果与加入CCR2阻断剂RS102895后细胞凋亡测定结果一致.上述结果表明,MCP-1的主要受体CCR2介导了MCP-1诱导的hVECs凋亡.