农杆菌介导法与基因枪轰击法结合在植物遗传转化上的应用

根癌农杆菌介导法(Agrohacterium mediated transformation)和基因枪轰击法( particle bombardment transformation)是植物遗传转化的主要方法。两种方法各有优缺点．农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低,遗传稳定性好;基因枪转化法不受材料基因型的限制。通过结合两种方法的优点,发展了3种农杆菌介导和基因枪轰击法相结合的遗传转化方法,分别为农杆枪法、基因枪轰击／农杆菌感染法、金粉或钨粉包裹菌体细胞作为微弹轰击法。对3种结合转化方法的技术途径、原理、转化受体及研究进展等方面进行了综述。     

基因枪介导的大蒜遗传转化体系的建立

以大蒜无菌苗根诱导的愈伤组织为受体进行基因枪转化,根据愈伤组织的形态特征设计了6组基因枪转化参数进行试验。结果表明,其中4组转化试验都获得了转基因植株;轰击距离9 cm、压力1100 psi和轰击距离12.5 cm、压力1300 psi各轰击1次的轰击方式获得了最高的转化效率,为2.4%。对抗性植株进行了PCR和Southern blot检测,证明pCAMBIA1301载体上的潮霉素抗性选择标记基因和gus报告基因已整合到抗性植株的基因组中。对转化后的愈伤组织、胚状体、根、再生芽尖和叶片进行gus基因的表达检测,抗性材料显示出明显的蓝色反应。这些结果表明已初步建立了基因枪介导的大蒜遗传转化体系,将为大蒜的基因工程改良奠定基础。     

基因枪介导的老芒麦遗传转化体系的建立

川草2号老芒麦(Elymus sibiricus)是青藏高原地区治理荒漠化和建设高产人工草地的主要栽培草种。用川草2号老芒麦5种外植体诱导愈伤组织,经分化测试,仅幼穗愈伤组织能分化再生。以当代培养25天和35天的结构致密坚硬的幼穗愈伤组织为受体,分别进行农杆菌侵染和基因枪转化,结果只有基因枪能转化成功。在基因枪转化过程...     

多年生黑麦草成熟胚再生体系的建立及基因枪转化

目的:建立以多年生黑麦草成熟胚为起始材料的再生体系,用于基因枪转化。方法:多年生黑麦草成熟种子在附加 5mg L 2,4 D的MS培养基上诱导愈伤组织,转至新继代培养基上产生胚性愈伤组织。分化培养基为无激素MS培养基。再生植株在培养基成分减半的无激素MS培养基生根,之后移栽至土壤。基于这一再生体系,用含有水稻几丁质酶基因RC2 4的质粒pARN6和含有草丁膦乙酰转移酶基因Bar的质粒pDB1,通过基因枪轰击胚性愈伤组织。用附加PPT的继代培养基进行转化植株的抗性筛选。结果:共获得 2 4 3株再生植株。通过PCR进行检测,获得1 8株整合有RC2 4基因的植株,1 5株整合有Bar基因的植株,同时转入 2个基因的植株 2株。     

农杆菌介导的Pr基因对非洲菊遗传转化的研究

采用农杆菌介导法将Pr基因转入非洲菊(Gerbera hybrida),建立适合于农杆菌介导的基因遗传转化受体系统,获得再生植株。经PCR和GUS染色检测,Pr基因成功转入非洲菊幼苗。     

基因枪在植物遗传转化中的应用

基因枪技术是近年发展起来的一项新的植物遗传转化技术,本文较为系统地介绍了基因枪的类型,以及它们各自的特点和工作原理,并对基因枪在植物遗传转化中的广泛用途作了重点介绍,文中引用用参考文献七十余篇,为进一步深入了解学科的最新研究进展提供了方便。     

基因枪技术在农作物基因转化中的应用和进展

基因枪技术是一种重要的基因转化方法,近来在单子叶植物的基因转化中应用尤为广泛,本文简要介绍了基因枪技术的转化原理、实际应用、优缺点、影响因素及其发展前景。     

三角褐指藻基因枪转化体系的建立

三角褐指藻具有较高的脂肪酸含量,是一种很有潜力的生物柴油生产原料。此外,它是多不饱和脂肪酸尤其是二十碳五烯酸（EPA）重要的来源。合适转化体系的缺乏限制了通过基因工程手段对其进行改造。首次采用基因枪方法成功地将外源基因转入三角褐指藻,转化细胞经染色后呈现蓝色,表明外源报告基因β-糖苷酸酶( GUS ) 基因得到了成功的表达。同时还进行了转化参数等因素对转化效率影响的分析,优化了转化条件。结果显示最佳的转化条件为: 每60 μg钨粉包被1 μg质粒DNA,样品室真空度为27英寸汞柱,可裂膜为1500psi,受体与阻挡网距离6 cm。此外,转化载体采用了三角褐指藻内源基因fcp的启动子,实现了外源基因在细胞内的表达。通过5种基因工程中常用抗生素对三角褐指藻生长抑制的研究发现,三角褐指藻对卡那霉素、氨苄青霉素、链霉素和新霉素不敏感,500 mg/L 的卡那霉素、氨苄青霉素和新霉素,以及1000 mg/L 链霉素仍不能抑制其生长;三角褐指藻对氯霉素非常敏感,130 mg/L的氯霉素可以完全抑制其生长,其半抑制浓度为60 mg/L。这为基因工程手段改造三角褐指藻脂肪酸代谢相关途径奠定了基础。     

籼稻基因枪转化的研究

对国内外１７个籼稻品种进行了基因枪转化,研究了有利于籼稻愈伤组织诱导和生长的培养条件和筛选程序,１５个品种获得了潮霉素抗性愈伤组织,５个品种再生了植株,包括当前国际上推广的ＩＲ系统及国内的优良品种和恢复系,分子生物学证据证明潮霉素基因已经整合入籼稻的基因组。最高植株转化频率接近一般粳稻水平,多数低于粳稻水平。这为建立籼稻的转化系统打下了基础。     

基因枪介导甘蔗遗传转化几个影响因素的研究

用基因枪GJ1000介导将Bt基因转入甘蔗嫩叶、Ⅰ型愈伤组织和Ⅱ型愈伤组织。结果表明,用Ⅱ型愈伤组织作为受体最用利于转化;气体压力、轰击距离、轰击次数和真空度对转化效率有不同程度的影响。条件优化后,得到了大量的抗性愈伤组织和一些抗性植株,转化率分别为34.9％和3.36％。     

烯效唑(S-3307)对非洲菊切花保鲜的影响

以非洲菊(GerberajamesoniiBolus)切花为材料,以保鲜基本液(BP,20gL-1蔗糖 200mgL-1柠檬酸 150mgL-18-羟基喹啉柠檬酸盐)和添加30mgL-1烯效唑(S-3307)的基本液(BP S-3307)作对比实验,通过对切花外部形态观察和切花衰老过程中一些生理生化指标测定,探讨了S-3307对非洲菊切花的保鲜效果。结果表明,S-3307处理使切花的瓶插寿命比对照(蒸馏水)延长了4.3d,比BP处理延长了2.3d,而弯颈率分别仅为对照和BP处理的9.6%和28.8%。说明S-3307可增强切花的吸水能力,增加花枝的鲜重,延缓了切花花瓣中蛋白质的降解和抗氧化酶SOD和CAT活性的下降,并减少了游离脯氨酸和MDA的积累,维持膜结构的相对稳定性,从而延缓了非洲菊切花的衰老和提高了切花瓶插期间的观赏品质。     

影响非洲菊愈伤组织诱导和增殖的因素

以非洲菊(Gerbera jamesonii Bolus)7个品种的叶片和带叶叶柄为外植体,接种到附加0.5、1.5和2.0 mg L-1 2,4-D的MS培养基上培养,各品种均能诱导出愈伤组织并增殖。愈伤组织的诱导和增殖状况均是叶片好于叶柄,但各品种之间存在显著差异。将品种F30和Ⅱ的叶片和带叶叶柄接种到含不同浓度单一细胞分裂素(6-BA、TDZ、KT)的MS培养基上培养,均未能诱导出愈伤组织,而在含2.0 mg L-1 6-BA 0.5 mg L-1 NAA的培养基上可以诱导出愈伤组织,且由品种Ⅱ叶柄诱导产生的愈伤组织可再分化出芽,品种F30诱导的愈伤组织却不能分化,但在其叶柄基部可直接出芽。以上结果说明,生长素是非洲菊愈伤组织诱导和增殖所必须的,非洲菊愈伤组织诱导、增殖和芽再生方式受品种及外植体类型的影响。     

非洲菊未授粉胚珠的离体诱导和植株再生

通过不同培养基及培养条件的筛选,离体诱导12个品种的非洲菊未授粉胚珠的结果表明:MS中的大量元素 Heller中的微量元素 1/2铁盐 0.2mg·L~(-1)6-BA 0.1mg·L~(-1)IAA较适宜于非洲菊未授粉胚珠愈伤组织的诱导和芽的再生,8个品种中以品种‘E19’诱导愈伤组织的诱导率最高(为23.1%);5个品种可再生形成不定芽,再生率为4.8%-19.6%。用根尖染色体鉴定法鉴定再生的23个植株的倍性的结果显示,21.7%为二倍体,43.5%为单倍体,34.8%为混倍体.     

An Efficient Rice Transformation System Utilizing Mature Seed-derived Explants and a Portable,Inexpensive Particle Bombardment Device

We developed a practical and efficient gene transfer system for indica rice utilizing mature-seed derived explants and a simple bombardment device which uses compressed helium for accelerating DNA-coated metal particles. Unlike instruments which have been described in the literature previously, this new bombardment device, which is an improvement of the particle inflow concept, does not require vacuum. This attribute simplifies the transformation procedure significantly and it makes rice transformation technology accessible to laboratories which may not have the resources to invest in more expensive particle bombardment instruments. We determined experimentally that we could recover transgenic rice plants utilizing three different particle bombardment instruments at comparable frequencies.     

基因枪法介导GNA基因遗传转化甘蔗的研究

目的:将含有雪花莲外源凝集素(GNA)基因的植物表达载体用基因枪法分别导入一个果蔗和一个糖蔗品种中,以期获得转基因植株。方法:将GNA基因插入到植物表达载体上,构建出不同选择标记、不同启动子的表达载体,并用基因枪法将之导入甘蔗胚性愈伤组织,分别在G418、PPT和Hyg的选择压力下,筛选抗性植株,并进行分子杂交鉴定。结果:通过斑点杂交和PCR-Southern杂交证明GNA基因已整合到甘蔗基因组中。结论:用基因枪法成功获得了含有GNA基因的甘蔗转化株,为培育抗甘蔗绵蚜(Ceratovacuna lanigeraZehnther)的新品种提供了基础。     

不同保鲜剂对非洲菊切花的保鲜效应

探讨不同保鲜剂对非洲菊切花的瓶插寿命、观赏品质以及生理生化指标的影响。结果表明,在供试7组保鲜剂中,以处理7(T₇):20g/L Suc+200mg/L 8-HQC+150mg/L CA+75 mg/L KH₂PO₄·3H₂O+1g/L CaCl₂的保鲜效果最佳,可显著延长非洲菊切花瓶插寿命;T₇处理有利于减缓花瓣组织pH上升、花青素含量下降及花瓣细胞膜相对透性的上升,从而延长瓶插寿命。     

多效唑和三唑酮对非洲菊微繁的效应

培养基中加入多效唑0．2,0．4,0．6mg／L,可使非洲菊组培苗健壮、矮化,提高增殖系数,促进继代后生根;在生根培养基中加入0．2～1．0mg／L多效唑,可增加生根量,促进根的增粗,提高移栽成活率。0．1mg／L三唑酮可降低植株高度,提高增殖率。     

Efficient TDZ-induced regeneration from capitulum explants of Gerbera jamesonii Bolus ex Hooker F. - an ornamental plant with high aesthetic value

Gerbera jamesonii Bolus ex Hooker F. (Asteraceae), a most prominent ornamental plant ranking fifth in the world cut flower market has gained huge demand across the globe for its high aesthetic value. In the present study, an efficient plant regeneration protocol was developed using capitulum explants from the field grown mature plants of G. jamesonii. A successful surface sterilization procedure was established using a series of sterilants without affecting explant regenerability. The culture of capitulum explants on Pre-culture Induction Medium [(PIM), Murashige and Skoog (MS) medium fortified with 0.5?mg/L thidiazuron (TDZ) in combination with low levels of auxins] for a period of 2 weeks in dark conditions was crucial for inducing morphogenetic response. Upon transfer onto Shoot Regeneration Medium [(SRM), MS +4.0?mg/L 6-benzyladenine (BA) and 0.2?mg/L NAA], explants has significantly produced highest number of shoots (16?±?0.33). Incubation for 18–21?days on Shoot Multiplication and Elongation Medium [(SMEM), MS +2.0?mg/L BA +0.2?mg/L NAA] resulted in the highest number of multiple shoots (22.00?±?0.93) with increased mean shoot length (3.49?±?0.08). In vitro elongated shoots were rooted (95%) on ½ MS +1.0?mg/L indole-3-acetic acid (IAA) within 10–12?days and fully rooted plants were transferred to poly-house for hardening with 90% survival rate.     

非洲菊基因组DNA提取及ISSR-PCR扩增模板浓度优化

以改良的CTAB法为基础,对非洲菊基因组DNA提取进行了下述优化：在第二次用氯仿,异戊醇抽提时,加入“PCN”溶液(0.0675g PVP,45μl 10％ CTAB 4％NaCl),可明显去除多糖;在材料研磨时加入化学物质M(0.1000g Na2SO3,0.0500g Vc)及N(0.0200gVE,0.1000gNa2B4O7,0.0200gPVP,200μlB-巯基乙醇),都可去除酚类物质,明显提高DNA及ISSR-PCR扩增的质量,但N的效果稍优于M;同时加入M、N及“PCN”,具有明显的优化效果,所提5个样品DNA,平均A260/A280、A260/A230分别为1.81、2.02,浓度为0.649μg/μl,片段大小约为49kb,ISSR扩增带多且清晰、明亮、稳定性及多态性高,表明DNA纯度很高。对扩增反应的最佳模板浓度进行研究表明,所提DNA模板必须稀释30倍(浓度为15～30μg/μl时),才能扩增出清晰的谱带。