大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒ORF2多肽对恒河猴的免疫保护研究

在大肠杆菌中表达的一段戊型肝炎病毒（HEV）结构蛋白NE2,纯化后以弗氏佐剂,按0d,10d,30d的方案10μg/针的剂量免疫3只恒河猴,在第2周抗体阳转,第6周时1只滴度达1∶100 000,另2只滴度1∶20 000,此时以106 PCR滴度的HEV病毒粪悬液攻击。对照组3只均出现血清转氨酶（ALT）升高,抗体阳转,粪便持续排毒1月以上;疫苗组无一发病,未检出非疫苗来源的抗体,其中1只始终未检出粪便排毒,另2只仅出现短暂排毒。以一份NE2免疫后猴血清（滴度1∶20 000）与103 PCR滴度的病毒混匀后感染2只恒河猴,结果对照组2只均持续排毒3周以上,抗体阳转,1只ALT明显升高;而抗体中和组2只猴始终未检出粪便排毒,抗NE2抗体缓慢下降,ALT正常。这些结果表明NE2具有良好的免疫原性和免疫保护性,有可能成为有效的戊肝疫苗。     

肠道病毒71型灭活疫苗免疫恒河猴在攻毒实验中的感染动力学

本文旨在根据前期研究建立的恒河猴感染动物模型,对同期研制的肠道病毒71型(EV71)实验性灭活疫苗免疫动物进行全面的免疫保护性评价。评价指标包括病毒攻击后动物体内病毒载量及病理学变化,根据所得结果进行实验性疫苗免疫后动物在病毒攻击中的感染动力学分析。3个疫苗剂量(20、80、320EU)免疫的恒河猴均出现不同效价的中和抗体,80EU和320EU剂量组在二次免疫后第6周抗体效价达1∶128～1∶256,经104.5CCID50病毒鼻腔攻击后均未检出阳性病毒载量。20EU剂量组中,淋巴器官、中枢神经系统及其他主要脏器均出现比对照组低但仍为阳性的病毒增殖现象。病理学方面,各剂量组免疫恒河猴的中枢神经系统以及肺等器官均未出现相关病理损伤。本实验在确定该疫苗对恒河猴有效保护性的同时,亦为明确EV71灭活疫苗免疫剂量提供了直接的实验依据。     

戊型肝炎病毒实验感染恒河猴的研究

报道了用戊型肝炎(Hepatitis E, HE)病人粪便悬液感染恒河猴后的组织病理学、血液生化与免疫学以及病毒学分子生物学检测的结果.三只实验猴在感染后第3～4周均出现ALT异常;粪便以及肝脏与胆囊组织超薄切片中电镜观察到27～34nm大小的病毒样颗粒;病理组织切片观察表明,肝脏组织有典型的急性炎症病灶;粪便与血清经RT-nPCR扩增到戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus, HEV)特异性片段,粪便排毒从感染后第7天持续至第50天左右,病毒血症迟于粪便排毒,出现于感染后两周左右,维持1～2周;ELISA检测发现,实验猴血清中HEV IgG抗体水平在感染后3～4周阳转,4～5个月后转阴.这些实验结果提示,恒河猴作为HEV感染实验动物模型是理想的,建立系统的恒河猴实验模型对探讨HEV感染发病机理、机体免疫应答以及临床诊断与疫苗研制具有重要意义.     

Semliki森林病毒衍生的DNA疫苗与常规DNA疫苗的比较

比较Semliki森林病毒(SFV)衍生的复制型DNA疫苗载体(复制型载体)和常规非复制型DNA疫苗载体(非复制型载体)的导入效率、表达效率、诱导凋亡率和免疫效果,从而评价其作为DNA疫苗载体的应用前景.使用等量SFV载体和常规DNA载体同等效率转染细胞后,复制型载体表达强度比非复制型载体高约3倍,其诱导凋亡的能力是非复制型载体的11倍;以不同剂量的SFV载体和常规DNA载体分别转染BHK21细胞,复制型载体各剂量组载体的表达量均高于非复制型载体.复制型载体在1μg组出现峰值,而非复制型载体则出现在4μg组.体内免疫的结果表明,SFV载体pSCA-SS1免疫的各组小鼠中,低剂量1μg组小鼠的总抗体滴度高于10μg和100μg剂量组;1μg pSCA-SS1免疫的小鼠产生的总抗体滴度与CTL水平,分别与pcDNA3-SS1免疫的小鼠中10μg和100μg组相当.但10μg、100μg组pSCA-SS1免疫小鼠的总抗体及CTL水平,都低于pcDNA3-SS1免疫的小鼠的10μg、100μg组.结果提示:SFV衍生的复制型DNA疫苗载体,在低剂量组时即可诱生与常规DNA疫苗载体高剂量组相近的免疫效果.     

不同基因型戊型肝炎病毒存在多种类型抗原表位

以戊型肝炎病毒(HEV)ORF2重组蛋白p166Us为免疫原制备单克隆抗体(McAbs),采用间接ELISA和免疫印迹法,检测McAbs与不同基因型和亚型HEV重组蛋白p166Bur(Ⅰa型)、p166Pak(Ⅰb型)、p166Mor(Ⅰc型)、p166Mex(Ⅱ型)、p166Us(Ⅲ型)、p166Nz(猪HEV,Ⅲ型)和p166Chn(Ⅳ型)的反应性,采用抗原或抗体竞争ELISA分析p166蛋白与天然HEV颗粒之间抗原表位的关系。结果获得4D3、2E3、11E11、12H5、3A3和1F16株稳定分泌McAbs的杂交瘤细胞株。4D3分泌的McAb与7种p166均发生反应,其与免疫原p166Us的结合可被Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ型天然HEV颗粒或病人血清竞争抑制。2E3、11E11和12H5分泌的McAbs只与p166Us、p166Nz和p166Chn发生反应,它们与p166Us的结合仅能被Ⅲ和IV型病毒或血清所抑制。3A3分泌的McAb只与p166Us及p166Nz结合,1F1分泌的McAb只与p166Us结合,两者均能被Ⅲ型美国株竞争抑制,而Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型不能抑制它们与p166Us的结合。由此可见,不同基因型和亚型HEV ORF2编码蛋白p166上存在多种类型抗原表位,其中包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ基因型共同的,Ⅲ、Ⅳ基因型共有的和第Ⅲ基因型特异的等,这些表位与天然HEV颗粒上的抗原表位具有相同的免疫学特征。     

细胞分离戊型肝炎病毒的初步研究

本文报告用2BS细胞分离戊型肝炎病毒(HEV)感染成功的猴肝脏标本中的HEV的初步结果,将2BS细胞长成致密单层,接种已知含有HEV的肝悬液,盲传至第4代,发现在第27天细胞出现了轻微的细胞病变(CPE),随着进一步的传代,细胞病变时间逐渐提前。至第7代时,在第17天就可见到CPE,CPE的主要特征是细胞间隙变宽,透明度降低和轻度细胞破坏,无大片细胞溶解和脱落现象。免疫电镜检查在第5代和第6代细胞培养液中见到很少的27—34nm的病毒颗粒。将第4代至第7代的细胞悬液20ml接种了3只恒河猴,有2只猴在24天和26天出现了典型的ALT升高,待这3只猴恢复正常后一年,再次接种以上细胞悬液20ml,3只猴全部发生了ALT升高,并在胆汁中检查到27—34nm的病毒颗粒,我们初步推测2BS适应的这株病毒很可能是戊型肝炎病毒。     

南京地区戊型肝炎病毒基因型鉴定和变异分析

为了解南京地区戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)基因型的分布以及变异状况,本研究采用逆转录套式聚合酶反应(RT-nPCR)的方法检测南京地区40份急性散发性戊型肝炎患者的粪便标本,对PCR产物进行测序,利用生物信息学软件比较核苷酸的同源性、遗传距离,进行基因分型和变异分析.40份粪便标本中检测到14份阳性HEV、RNA,检出率为35%,基因分型均为HEV Ⅳ型,且分属2个不同的亚型;利用生物信息学软件对国内Ⅰ型和Ⅳ型毒株加以比较,发现HEV Ⅳ型毒株比Ⅰ型变异程度高,不同年份的HEV Ⅳ型毒株变异更大,有新的亚型出现,且变异有随时间推移而增大的趋势.     

模拟HIV性传播特点的SIVmac239恒河猴直肠黏膜感染

目的制备SIVmac239恒河猴(Macaca mulatta)细胞适应株病毒,模拟HIV性传播感染特点进行恒河猴直肠黏膜感染研究,探索引起系统性感染的病毒阈值水平与机体病毒、免疫学之间相关性,为我国艾滋病黏膜疫苗等生物制剂有效性评价提供新的模型构建思路。方法参照HIV性传播自然感染剂量范围,选用SIVmac239连续升高的3种剂量直肠黏膜途径感染两只恒河猴,采取多种方法进行病毒血症和免疫反应特点分析。结果两只恒河猴经2×101TCID50和2×102TCID50病毒滴度2次攻击后45d,经检测均未建立系统性感染,病毒特异性免疫反应均为阴性;第3次2×103TCID50病毒滴度攻击后,M296猴表现出典型的系统性感染特点,并诱导特异性免疫反应。结论确认了HIV性传播过程中的病毒剂量效应关系,为预防性生物制剂的猴体有效性评价提供了新的思路。同时,发现SIVmac239Gag区特异性的T细胞免疫反应在病毒控制过程中发挥了关键作用,对于新一代艾滋病黏膜疫苗的抗原选择具有指导性意义。     

基因Ⅰ、Ⅳ型戊型肝炎病毒高灵敏度通用引物的设计和初步应用

设计针对国内流行的戊型肝炎病毒(HEV)基因Ⅰ、Ⅳ型,在这两型序列的保守区域设计了一套RT-PCR引物——E引物,并将E引物与目前较常用的3对通用引物(Meng、ConORF1和ConORF2引物)比较了检测基因Ⅰ、Ⅳ型HEV的灵敏度。对基因Ⅰ型HEV,E引物能检出的稀释度为105,参考引物能检出的稀释度为10^2～10^4;对基因Ⅳ型HEV,E引物能检出的稀释度为10^2,参考引物能检出的稀释度为10^1～10^2。在17份HEV-IgM阳性血清中,E引物检出5份,检出率为29．4％;参考引物只能检出1份或2份,检出率最高为11．8％。E引物在33份HEV-IgM阳性的隐性感染血清中检出6份,阳性率18．2％;在79份HEV-IgM阳性的临床肝炎血清中检出36份,阳性率45．6％。以上结果初步表明,对于在国内流行的基因Ⅰ、Ⅳ型HEV,E引物的检测灵敏度要高于目前常用的通用引物。     

重组霍乱毒素B亚基与恶性疟原虫多抗原表位融合蛋白对恒河猴的免疫保护作用研究

使用重组霍乱毒素B亚基（CTB）与恶性疟原虫抗原表位融合蛋白（AWTE）免疫恒河猴,研究其免疫应答并观察对食蟹疟原虫攻击的保护作用。结果表明：在0,14,28天分别通过鼻腔和肌肉注射免疫恒河猴,第3次免疫后2周,抗CTB抗体平均滴度可达1∶512（鼻腔免疫）和1∶10000（肌肉免疫）;肌肉免疫后抗疟原虫抗体滴度也显著高于鼻腔免疫组。用125×10⁸个食蟹疟子孢子攻击,对照组5只恒河猴在攻击后10～14d全部感染,其中1只在攻击后21d死亡,另4只重度感染,感染持续30d以上。鼻腔免疫组的5只动物均在攻击20d后出现原虫,其中3只轻度感染,感染持续4d后即恢复,其余2只感染持续36d以上。肌肉注射组3只未受感染,其余2只在攻击后19d后轻度感染,感染4d后即完全恢复。以上结果表明,使用霍乱毒素B亚基为载体蛋白构建的重组疟疾疫苗具有良好的免疫原性,对食蟹疟攻击具有良好的交叉免疫保护作用。     

Relationships of the Col plasmids E2, E3, E4, E5, E6, and E7: Restriction mapping and colicin gene fusions

Thirteen ColE plasmids representing the E2-E7 types have been compared by restriction mapping. Over 80% of their restriction sites were found to be similarly positioned, indicating that these plasmids share a common structure. Three variants are ColE2-CA42 and ColE7-K317, both of which contain 1.8-kb DNA segments in place of a 2.5-kb segment common to the other plasmids, and ColE6-CT14, which has an additional 5.0-kb DNA segment compared to the other plasmids. The colicin (col), immunity (imm), and colicin release (hic) genes of these plasmids have been localized to regions corresponding to those known for ColE3-CA38 and ColE2-P9, with the imm and hic genes adjacent to the 3' end of the col gene. Active colicin is produced from hybrid col genes containing 5' and 3' ends from different E-type plasmids. The 3'-termini of the fused col genes specify the colicin type.     

Negative regulation of the bovine papillomavirus E5, E6, and E7 oncogenes by the viral E1 and E2 genes.

Papillomaviruses induce benign squamous epithelial lesions that infrequently are associated with uncontrolled growth or malignant conversion. The virus-encoded oncogenes are clearly under negative regulation since papillomaviruses can latently infect cells and since different levels of viral oncogene expression are seen within the layers of differentiating infected epitheliomas. We used bovine papillomavirus type 1 (BPV-1) to investigate the mechanisms involved in the negative regulation of transformation. We found that the following two distinct and interacting mechanisms negatively regulate BPV-1 transformation effected by virally encoded trans-acting factors: (i) E2 repressors suppress transformation by the E6 and E7 oncogenes, and (ii) E1 and the E2 transactivator suppress transformation by the E6, E7, and E5 oncogenes. These systems interact in that the E2 repressors function to relieve the transformation suppression effected by the E1 and E2 transactivator genes. A BPV-1 mutant that lacked E2 repressors and E1 had greatly augmented transformation capacity. Analysis of this mutant revealed that the enhanced transformation was due to expression of the E6 and E7 genes in the absence of E5, revealing a previously unappreciated potency and synergy for the BPV-1 E6 and E7 oncogenes.