戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

烟台沿海地区贝类海产品戊型肝炎病毒检测分析

了解烟台地区贝类海产品中戊型肝炎病毒污染状况,为戊型肝炎防控提供科学依据。采集了烟台近海区域贝类海产品11种,用PEG 8000对戊肝病毒进行优化富集,应用实时荧光定量RT-PCR方法进行检测,用已知戊肝阳性病人粪便标本做系列梯度稀释作为荧光信号强度参照。11种共151份贝类海产品中,在海虹（贻贝）中检出戊肝病毒阳性3份,可疑阳性2份,其它10种贝类中未检出。烟台近海区域贝类海产品（贻贝）中存在戊型肝炎病毒污染。     

新疆猪粪便戊型肝炎病毒RNA的检测及序列分析

从戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)IgG检测阳性的新疆某猪场采集70份猪粪便,利用逆转录套式聚合酶链方法(RT-nPCR),检测HEV RNA,其中13份为阳性,阳性率18.57%.将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上,构建成重组质粒并测序,结果表明,13株猪源HEV分离株在HEV ORF2 348bp核苷酸序列的同源性为97.1%～100%,为同一基因型;与HEV Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的同源性分别为74.1%～77.6%,71.6%～74.1%,73.3%～78.2%和82.8%～91.4%,与ⅣA亚型的同源性同源性最高达89.4%～91.4%.以该核苷酸片段绘制的基因进化树显示13株猪源HEV与HEVⅣT1株在同一分支上,属基因Ⅳ型;与国内其他猪源HEV分离株该片段核苷酸序列的同源性为82.6%～91.3%,提示中国猪源HEV的基因型比较一致,同属HEVⅣ型.     

李痘病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立李痘病毒(PPV)特异、灵敏、快速的实时荧光定量RT-PCR检测方法,用于核果类种苗的健康评测及李痘病毒疫情监测。方法:根据PPV-D株系和PPV-M株系的外被蛋白(CP)基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,扩增全长CP基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体上,构建质粒标准品,建立PPV的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:此荧光定量RT-PCR方法对PPV检测呈现高灵敏度和高特异性,与马铃薯Y病毒和马铃薯X病毒无交叉反应,最低检出限可达1.6×102拷贝/μL,标准曲线的相关系数为0.999 18。结论:建立了李痘病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,可望应用于检验检疫部门对李痘病毒的快速检测。     

戊型肝炎病毒分子生物学与疫苗研究进展

戊型肝炎病毒（HEV）是80年代发现的又一新型肝炎病毒,近年来对戊型肝炎病毒病原学、流行病学、实验室诊断、基因结构等方面研究取得了重大进展,本文就戊型肝炎病毒（HEV）的分型、分子生物学特性、蛋白组份、疫苗研究等作一简要概述。     

新疆猪粪便戊型肝炎病毒RNA的检测及序列分析

从戊型肝炎病毒(Hepatitis Evirus,HEV)IgG检测阳性的新疆某猪场采集70份猪粪便,利用逆转录套式聚合酶链方法(RT-nPCR),检测HEV RNA,其中13份为阳性,阳性率18．57％。将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上,构建成重组质粒并测序,结果表明,13株猪源HEV分离株在HEV ORF2 348bp核苷酸序列的同源性为97．1％～100％,为同一基因型;与HEVⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的同源性分别为74．1％-77．6％,71．6％-74．1％,73.3％～78．2％和82．8％-91.4％,与ⅣA亚型的同源性同源性最高达89．4％-91．4％。以该核苷酸片段绘制的基因进化树显示13株猪源HEV与HEV Ⅳ T1株在同一分支上,属基因Ⅳ型;与国内其他猪源HEV分离株该片段核苷酸序列的同源性为82．6％-91．3％,提示中国猪源HEV的基因型比较一致,同属HEV Ⅳ型。     

戊型肝炎病毒的分子生物学研究现状

本文介绍了戊肝病毒的分子生物学方面的最新进展,详细阐述了ＨＥＶ的基因结构、调控序列和其功能,以及相应蛋白的抗原位点。并对ＨＥＶ的分型、分类进行了比较。     

鼠源戊型肝炎病毒IgG抗体定量检测方法的建立

目的制备鼠源戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)抗体定量参考品,建立小鼠HEV IgG抗体定量检测方法,并对其进行验证及初步应用。方法制备鼠源抗-HEV IgG参考血清MS1,以世界卫生组织人源抗-HEV Ig标准品(NIBSC code:95/584)对其进行标定并检测其稳定性;以标定的参考品为标准,建立小鼠HEV IgG抗体定量检测方法,对线性、范围、重复性、准确度等进行验证,并对戊肝疫苗免疫后小鼠血清进行HEV IgG抗体定量检测。结果制备的MS1血清含量为30.9U/m L(95%CI:±1.1),CV为4.8%;加速稳定性试验和冻融稳定性试验中,MS1含量CV均15%。建立的小鼠抗-HEV IgG抗体定量检测方法在0.01~0.15 U/m L范围内具有良好的线性(r0.99);灵敏度为0.007 U/m L;对高、中、低3份不同含量抗-HEV阳性小鼠血清重复检测3次,CV均10%;加样回收率为83.8%~107.7%。戊肝疫苗免疫1 w,3 w,5 w时,小鼠血清HEV IgG抗体均值分别为0.3 U/m L、39.4 U/m L、345.4 U/m L。戊肝疫苗初次免疫小鼠1 w后抗体阳转率为100%,但抗体均处于较低水平;血清抗体水平随着免疫针次的增加而升高(P0.05)。结论制备的鼠源HEV IgG抗体定量参考稳定性良好的,建立的小鼠HEV IgG抗体定量检测方法,具有良好的灵敏度、重复性及准确度,可用于小鼠实验中戊肝疫苗免疫原性的评价。     

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RTPCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severeacuterespiratorysyndromeassociatecoronavirus,SARSCoV)核酸。筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RTPCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性。实验结果表明:本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好。本研究建立的TaqMan荧光定量RTPCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测。     

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severe acute respiratory syndrome -associate coronavirus,SARS-CoV)核酸.筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性. 实验结果表明本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好.本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测.     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测水稻RAcl基因mRNA方法的建立

构建包含RAcl基因cDNA片段的质粒,作为水稻肌动蛋白基因RAcl之mRNA定量检测的标准品,建立检测方法,为水稻其他基因的定量建立内参。从水稻叶总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增RAcl基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体进行连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR实验。建立了RAcl基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达102拷贝,线性范围为102—1护拷贝,阈值循环数（Ct）与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r=1．000）,扩增效率高（E=98．2％）。建立了基因RAcl实时定量PCR的质粒标准品。     

RT-PCR一步法检测甲型肝炎活病毒方法的建立

建立灵敏、特异、快速检测甲型肝炎活病毒(HAV)的方法。提取HAV总RNA,选用HAV高保守区为目标区,设计合成一对引物,通过RT-PCR反应扩增其核酸,用琼脂糖凝胶电泳法检测其扩增产物,紫外灯下观察,约200bp处为目标片段,根据观察结果,计算HAV滴度。RT-PCR一步法快速、灵敏、重复性好、特异性强,可用于甲型肝炎活病毒检测。     

H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

H13亚型禽流感病毒以往只在海鸥、鸭等水禽中被发现,2018年,我们实验室报道了蛋鸡感染H13亚型禽流感病毒的证据,表明H13亚型禽流感病毒存在从水禽中溢出感染陆禽的风险,因而有必要加强对H13亚型禽流感病毒的监测。实时荧光定量PCR由于具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等优点,在病原监测工作中得到了广泛应用。本研究以H13亚型禽流感病毒的HA基因作为靶基因,设计了一对特异性荧光定量PCR检测引物,通过特异性试验、敏感性试验等,建立了H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法,并应用建立的检测方法对海鸥粪便样品进行核酸检测。实验结果发现,该检测方法的灵敏度为1.60×10⁰拷贝/μL;该检测方法对H1、H3、H5、H6、H7和H9等6个亚型的禽流感病毒无交叉反应;该检测方法的敏感性是常规PCR的10倍;海鸥粪便样品中H13亚型禽流感病毒的核酸检测阳性率为18.8%。我们建立的H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强等特点,该检测方法可用于大量临床样品的快速检测,为H13亚型禽流感病毒监测工作的顺利开展提供了技术支撑。     

荧光定量PCR检测土拨鼠肝炎病毒核酸方法的建立

目的建立土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus,WHV）核酸的荧光定量PCR（Real-time PCR）检测方法,应用于土拨鼠肝炎病毒模型的研究。方法分别根据土拨鼠肝炎病毒核心抗原（WHcAg）和表面抗原（WHsAg）的DNA序列设计13对扩增引物,从中筛选无非特异性扩增及引物二聚体且灵敏度高的引物,用于土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测。建立感染土拨鼠肝炎病毒的土拨鼠血清中WHV核酸的Real-timePCR检测方法。结果根据WHsAg基因的5＇端设计的一对引物WHVSF1与WHVSR1,检测灵敏度可达1×101拷贝/μL,病毒拷贝数与Real-time PCR Ct值的标准曲线的R2值为0.997,且电泳未见明显非特异性条带及引物二聚体。结论建立了土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测方法,该方法为进一步研究土拨鼠肝炎病毒模型奠定了基础。     

应用实时荧光定量RT-PCR检测宫颈癌及其外周血中VEGF表达的研究

目的:研究血管内皮生长因子在宫颈癌患者癌和癌旁组织及外周血循环细胞中的表达情况,分析其在肿瘤生长与转移中的作用。方法:采用基于TaqMan探针技术的实时荧光定量RT-PCR法检测了50例宫颈癌患者癌及癌旁组织和40例正常宫颈组织标本中VEGF mRNA的表达情况及其对应的外周血中的VEGF mRNA表达,分析其与临床病理参数之间的关系。结果:宫颈癌组织及癌旁组织中VEGF mRNA的表达水平无明显差异,但均与正常宫颈组织的表达水平差异有显著性;宫颈癌组织中VEGF mRNA的表达与肿瘤的组织学类型无明显的相关性;而与肿瘤的临床病理分期、病理分化程度、淋巴结转移、肿瘤直径、深肌层浸润间均呈显著的正相关。宫颈癌患者外周血中VEGF的表达明显高于对照组水平,与淋巴结是否转移密切相关,但与其他临床病理参数无关。结论:实时荧光定量RT-PCR可以敏感且特异性的检测出宫颈癌组织及外周血中VEGF mRNA的表达,且方法准确可靠,操作方便,在肿瘤的微转移的诊断监测方面有一定的应用价值。VEGF有可能成为治疗恶性肿瘤的一个潜在的分子靶点。