北京鸭apoA－Ⅰ溴化氰裂解片段的分离纯化、性质及其与鸭肝HDL受体结合研究

本文对北京鸭ａｐｏＡ－Ⅰ溴化氰裂解片段的理化性质、部分结构和抗原性以及其与鸭肝细胞膜ＨＤＬ受体的结合进行了研究。ａｐｏＡ－Ⅰ用溴化氰裂解后经ＨＰＬＣ分离得两个纯的肽段Ｐ５和Ｐ６,对二肽段作了氨基酸组成分析,并分别测定了Ｐ５,Ｐ６Ｎ端的１４和９个氨基酸残基序列。通过与鸡ａｐｏＡ－Ⅰ的比较,根据同源性及肽段大小,定出Ｐ５、Ｐ６分别位于鸭ａｐｏＡ－Ⅰ的第１３８－１７０ａａ和第７５－１３６ａａ的区域。Ｉｍｍｕｎｏ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ法测定结果表明,Ｐ５、Ｐ６都含有鸭ａｐｏＡ－Ⅰ的抗原决定簇;用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ免疫检测,发现鸭ａｐｏＡ－Ⅰ的Ｐ５、Ｐ６二片段都能与鸭肝细胞膜ＨＤＬ受体结合,提示鸭ａｐｏＡ－Ⅰ的中间区域即第７５－１７０ａａ区域可能参予鸭ａｐｏＡ－Ⅰ与鸭肝ＨＤＬ受体的结合。     

北京鸭Apo A—I溴化氰裂解片段的分离,纯化及其功能…

溴化氰可裂解北京鸭ａｐｏ Ａ－Ｉ为１１个肽段，通过测定纯化后各片段分子量玫Ｎ末端氨基酸序列确定片段３－１０在ａｐｏＡ－Ｉ分子中的位置，分别为６４－２０４，７４－２４０，６４－２０６，１－１３６，１－６３，１７１－２０６，２０７－２０４和１３７－１７０，并对上述片段功能进行研究，结果为：（１）这结片均可与脂质结合形成大小不同的脂质体，其大小与片段长短成正比。（２）Ａｐｏ Ａ－Ｉ溴化氰片段３－１０激活     

北京鸭Apo A-I溴化氰裂解片段的分离、纯化及其功能域定位

溴化氰可裂解北京鸭ａｐｏＡ－Ｉ为１１个肽段,通过测定纯化后各片段分子量和Ｎ末端氨基酸序列确定片段３～１０在ａｐｏＡ－Ｉ分子中的位置,分别为６４～２４０,７４～２４０,６４～２０６,１～１３６,１～６３,１７１～２０６,２０７～２４０和１３７～１７０．并对上述片段功能进行研究,结果为：（１）这些片段均可与脂质结合形成大小不同的脂质体,其大小与片段长短成正比。（２）ＡｐｏＡ－Ｉ溴化氰片段３～１０激活ＬＣＡＴ活性分别为完整ａｐｏＡ－Ｉ的６５％、５２％、６０％、３９％、８％、７％、０％和２％,说明激活ＬＣＡＴ的活性主要存在于６４～１３６之间。（３）只有片段３、４和９形成的脂质体可与肝ＨＤＬ受体结合,其他均无明显结合力,显示氨基酸２０７～２４０是ａｐｏＡ－Ｉ与ＨＤＬ受体结合片段。     

北京鸭载脂蛋白AⅠ cDNA的克隆及其组织表达

分离提取北京鸭肝组织ｍＲＮＡ,以此为模板,反转录构建了鸭肝组织ｃＤＮＡ文库．利用制备的兔抗鸭载脂蛋白ＡⅠ（ａｐｏＡⅠ）多抗血清为探针筛选该文库,获得１０个阳性克隆．测序及序列分析表明：克隆得到了完整的鸭ａｐｏＡⅠｃＤＮＡ序列,它由１０５０个核苷酸构成,包括１８ｂｐ、２４０ｂｐ组成的５′和３′非翻译区,７９２ｂｐ组成的一个完整开放阅读框架,编码２６４个氨基酸的鸭ａｐｏＡⅠ前体,含１８个氨基酸构成的信号肽、６个氨基酸的原肽片段和２４０肽的成熟蛋白．推译出的成熟肽与鸭ａｐｏＡⅠ氨基酸的直接测序结果完全一致．该新基因已被ＧｅｎＢａｎｋ接受．Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ显示鸭ａｐｏＡⅠｍＲＮＡ不仅主要在肝和小肠组织表达;而且不同于人和哺乳动物,亦可少量在脑、肾、肌肉组织分布．结果为进一步研究不易感动脉粥样硬化动物北京鸭ａｐｏＡⅠ基因组结构、功能奠定了基础．     

天花粉同工凝集素－1双链的拆分和鉴定

天花粉同工凝集素－１经巯基乙醇还原,碘代乙酰胺保护,其链间二硫键被打开,但仍非共价结合在一起。我们利用尿素变性的Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层忻分离了此凝集素的两条链。氨基酸组成测定与其他３种肽链作一比较,它们都含有较多的酸性和羟基氨基酸。蛋白质印迹显示ＴＫＬ的抗血清不仅能与ＴＫＬ－１的两条链分别反应,也能与天花粉毒蛋白及蓖麻毒蛋白的Ａ链起作用。溴化氰裂解的ＳＤＳ－ＰＡＧＥＲ肽谱表明天花粉凝集素的两条链与天花粉毒蛋白含有类似的裂解片段,在分子量１６ｋｄ左右有相同的电泳条带。ＴＫＬ－１两亚基的Ｎ末端序列已经测定,同源性比较发现其３３ｋｄ亚基的Ｎ末端序列与天花粉毒蛋白、蓖麻毒蛋白的一些肽段类似。迄今已有的证据表明ＴＫＬ与ＴＣＳ等是一些非常相关的蛋白质。     

黑曲霉A3木聚糖酶酶学性质研究

黑曲霉Ａ３（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ Ａ３）的固体培养物浸出液,经过多步分离纯化后,获得三个组份的木聚糖酶,称为ｘⅠ、ｘⅡ和ｘⅢ。经７％凝胶浓度的盘状电泳分析均为单一组份。经等电聚焦电泳测ｘⅠ、ｘⅡ和ｘⅢ。的等电点分别为６．８、５．５和６．１。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得亚基分子量（Ｄａ）分别为ｘⅠ,４２０００;ｘⅡ,２００００;ｘⅢ,３１０００。三个酶组份的最适反应温度分别为ｘⅠ,４０℃;ｘⅡ     

天花粉同工凝集素—1双链的拆分和鉴定

天花粉同工凝集素－１经巯基乙醇还原,碘代乙酰胺保护,其链间二硫键被打开,但仍非共价结合在一起。我们利用尿素变性的Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析分离了此凝集素的两条链。氨基酸组成测定与其他３种肽链作一比较,它们都含有较多的酸性和羟基氨基酸。蛋白质印迹显示ＴＫＬ的抗血清不仅能与ＴＫＬ－１的两条链分别分应,也能与天花粉毒蛋白及蓖麻毒蛋白的Ａ链起作用。溴化氰裂解的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ肽谱表明天花粉凝集素的     

利用合成肽进行丙型肝炎病毒（HCV）的线性抗原表位分析

首先利用固相多肽合成技术对ＨＣＶ多蛋白中可能含有优势抗原表位的１４个肽段进行了化学合成,并用合成肽作包被抗原进行间接ＥＬＬＳＡ试验来分析它们的抗原性,结果表明,所有合成肽中除ＮＳ３区的Ｐ７、Ｐ８和ＮＳ５区的Ｐ１３无抗原性外,其余肽段均具有抗原活性,其中Ｃ区的Ｐ１,ＮＳ４区和Ｐ９和ＮＳ５区的Ｐ１２三个肽段的抗原性较好,与相应的重组蛋白Ｃ２２,Ｃ１００和ＮＳ５Ａ比较,它们之间的抗原性比较接近,随后选择抗原性较好的几个肽段合成了含八分支的多抗原肽（ＭＡＰ）ＭＰ１、ＭＰ２、ＭＰ３、ＭＰ１０和嵌合多肽ＣＰ１５等工程肽抗原,前者不仅保持了相应单体肽的抗原性,而且与抗体反应的敏感性有显著提高;后者含双表位改善了常规合成肽抗原表位单一的缺陷,为研究ＨＣＶ工程肽抗原进行了有益的尝试。     

利用合成肽进行丙型肝炎病毒（HCV）的线性抗原表位分析

首先利用固相多肽合成技术对ＨＣＶ多蛋白中可能含有优势抗原表位的１４个肽段进行了化学合成,并用合成肽作包被抗原进行间接ＥＬＩＳＡ试验来分析它们的抗原性,结果表明,所有合成肽中除ＮＳ３区的Ｐ７、Ｐ８和ＮＳ５区的Ｐ１３无抗原性外,其余肽段均具有抗原活性。其中Ｃ区的Ｐ１,ＮＳ４区和Ｐ９和ＮＳ５区的Ｐ１２三个肽段的抗原性较好,与相应的重组蛋白Ｃ２２,Ｃ１００和ＮＳ５Ａ比较,它们之间的抗原性比较接近。随后选择     

兔胚泡肽合成片段及其与着床有关的生理功能

本研究测定了兔胚泡肽（ＲＢＰ２）的氨基酸序列,它由５４个氨基酸组成,其序列的第４位氨基酸至第３４位氨基酸与兔子宫珠蛋白Ｎ端氨基酸序列完全相同。用计算机软件系统模拟分析,从５４个氨基酸中选取了抗原性最高的一段氨基酸（ａａ２０－ａａ３４）,然后人工合成了含有１５个氨基酸的小肽片段（ＳＰＦ）。研究表明：用溴脱氧尿嘧啶掺入淋巴细胞的方法测定了ＳＰＦ对细胞增殖作用的影响,当浓度范围在８０μｇ／ｍｌ至３２０μ     

大熊猫基因指纹探针F2ZGP96060801的研制及比较实验分析

利用ＡＢＩ－３９４型ＤＮＡ合成仪合成的寡核苷酸５－「Ａ（Ｘ）ｎ－ｘＴＣＣＡＣ」ｎ－３,经高效液相色谱仪纯化后,制备成了命名为为Ｆ２ＺＧＰ９６０６０８０１的大熊猫基因指纹探针,用同位素标记法标记Ｆ２ＺＧＰ９６０６０８０１,ＬＺＦ－Ｉ、朋５、３３．６和（ＣＡＣ）６／ＧＴＧ）５等５种基因指纹探针,比较检测了大熊猫随机个体的被毛、大熊猫３雄配Ｉ雌所产１个双胞胎计６只个体的福尔马林固定的肝组织和粪便中的胃肠     

兔肝金属硫蛋白β结构域的制备和鉴定

制备一定量的Ｃｄ、Ｚｎ兔肝金属硫蛋白（ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ,ＭＴ）,然后脱掉其中的金属,获得不含金属的硫蛋白（ａｐｏＭＴ）．用一价金属ＣｕＣｌ或ＡｇＮＯ３以５．８１的金属蛋白摩尔比与ａｐｏＭＴ结合,将其β结构域用金属饱和,在３７℃,ｐＨ７．０下用枯草杆菌蛋白酶水解掉未结合金属的α结构域,获得Ｃｕ（Ⅰ）、Ａｇ（Ⅰ）结合的兔肝ＭＴ－Ｉ、ＭＴ－Ⅱ的β结构域．通过ＨＰＬＣ、羧甲基化后的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、氨基酸组成分析、金属定量、Ｎ末端分析和紫外扫描等鉴定,证明确实得到了Ｎ末端为Ｍｅｔ,分子量３０００左右,金属蛋白摩尔比为５～５．５１的ＭＴβ结构域,其氨基酸组成与理论值基本相符     

传染性法氏囊病病毒中国强毒株A节段cDNA基因的克隆和序列分析

以来自哈尔滨传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ） 强毒株（Ｈａｒｂｉｎ 毒株,Ｈ） 的基因组ＲＮＡ为模板,用反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ ＰＣＲ） 的方法得到了其Ａ 节段的全长ｃＤＮＡ 片段,分５＇端（１ ６５９ｂｐ） 和３＇端（１ ４４４ｂｐ） 上下两段分别克隆到ｐＧＥＭＢ○Ｒ － Ｔ 载体上,测定了其核苷酸顺序,在长为３ １０１ ｂｐ 中含有两个阅读框ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ ,分别编码１ ０１２ 个氨基酸的前体蛋白（ＶＰ２ － ４ －３） 和１４５ 个氨基酸的ＶＰ５,ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ 有部分的重叠。将核苷酸序列及推测出的氨基酸序列与已报道的ＩＢＤＶ 血清Ⅰ型和Ⅱ型毒株的相应序列进行了比较,结果表明：Ｈ 毒株与其它血清Ⅰ型毒株之间,在核苷酸水平上存在２５ｂｐ － ２６７ｂｐ 的差异;在氨基酸水平上存在１７ ～４０ 个氨基酸的差异。在ＶＰ２ － ４ － ３ 内比较显示,Ｈ 毒株与Ｐ２ 、Ｃｕ－ １ 之间氨基酸的差异最小为１ ．７％ ,Ｈ 毒株与ＵＫ６６１ 之间氨基酸的差异最大为３ ．９ ％ 。变异主要发生在ＶＰ２ 的可变区（２０６ － ３５０ 位氨基酸） ,在Ｈ 毒株所特有的１２ 个氨基酸当中,该区就占５ 个,代表１ ．７６ ％ 的变异。ＶＰ４、ＶＰ３ 和ＶＰ５区各有     

兔肝金属硫蛋白结合铅离子的圆二色性光谱研究

从锌诱导的家兔肝脏中分离纯化得到金属硫蛋白两种亚型：ＺｎＭＴ－Ⅰ和ＺｎＭＴ－Ⅱ．在酸性条件下脱金属,经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５柱层析得到脱金属硫蛋白（ａｐｏＭＴｓ）．用圆二色性（ＣＤ）光谱法研究,发现两种亚型ａｐｏＭＴｓ 与Ｐｂ２＋ 的结合依赖于Ｐｂ２＋ 的加入比例及ｐＨ 值．ａｐｏＭＴ－Ⅰ在ｐＨ３～５之间,ａｐｏＭＴ－Ⅱ在ｐＨ４～６之间与Ｐｂ２＋ 结合形成特征簇合物Ｐｂ７ＭＴｓ,其ＣＤ谱图特征峰位于３１６ｎｍ （－ ）,２７０ ｎｍ （＋ ）,２４５ ｎｍ （＋ ）及２２５ ｎｍ （－ ）,提示解铅中毒的最佳条件应控制在弱酸性环境．不同亚型ａｐｏＭＴｓ 与Ｐｂ２＋ 的结合方式各不相同：Ｐｂ２＋ 与ａｐｏＭＴ－Ⅰ的结合采取平均分配的方式,而与ａｐｏＭＴ－Ⅱ则为选择性结合方式,表明这两种亚型在解铅毒功能上存在差异．     

重组人骨形成蛋白—3羧基端肽在大肠杆菌中表达及其诱骨活性

以双顺反子表达载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了人骨形成蛋白－３羧基端肽段（ｈＢＭＰ－３Ｃ）,表达量占菌体总蛋白量的１８．５％。目的蛋白为２５ｋＤ、含ｈＢＭＰ－３Ｃ端２１５个氨基酸残基组成的肽段,包括ｈＢＭＰ－３成熟肽和一部分前肽。表达产物以包涵体的形式存在,用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的洗涤液和５ｍｏｌ／Ｌ以下脲溶液连续涤,可获得较高纯度的重组人骨形成蛋白－３Ｃ端肽,经复性处理成可溶性蛋白,植     

大熊猫乳酸脱氢酶同工酶H_4的分离纯化和某些性质的研究

采用８－（６－氨己基）－氨基－５＇－ＡＭＰＳｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析法和ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析法从大熊猫心肌中分离纯化出了乳酸脱氢酶同工酶Ｈ４．纯化的大熊猫ＬＤＨ－Ｈ４,比活为４４５Ｕ／ｍｇ蛋白,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ＰＡＧＥ,等电聚焦电泳鉴定均为一条带,其亚基分子量为３６０００,等电点为５．４５．经测定大熊猫ＬＤＨ－Ｈ亚基Ｎ端被封闭,Ｃ端氨基酸残基经测定为Ｌｅｕ．氨基酸组成分析表明每个亚基含有５个Ｃｙｓ,９个Ｍｅｔ．     

树载脂蛋白CIcDNA序列及其组织表达

分离提取树（ｔｒｅｅｓｈｒｅｗ,ＴＳ）肝组织ｍＲＮＡ,以此为模板,反转录构建了ＴＳ肝组织ｃＤＮＡ文库。利用制备的兔抗ＴＳ载脂蛋白ＣＩ多抗血清为探针筛选该文库,获得两个阳性克隆。测序及序列分析表明：两个克隆均为ＴＳａｐｏＣＩｃＤＮＡ基因。大的克隆由３８０个核苷酸构成,包括２１ｂｐ、９５ｂｐ组成的５′和３′非编码区,２６４ｂｐ组成的一个完整开放阅读框架,编码８８个氨基酸的ａｐｏＣＩ前体,含２６个氨基酸构成的信号肽和６２肽的成熟蛋白。其成熟肽长度与大鼠、小鼠和狗的相应结构一致,但较人和狒狒ａｐｏＣＩ的成熟肽多５个氨基酸。并对其功能域进行了初步预测。ＲＮＡ印迹显示ＴＳａｐｏＣＩｍＲＮＡ不仅主要在肝组织表达;而且不同于人和其他哺乳类动物,亦可少量在小肠表达。上述结果为进一步研究ＴＳａｐｏＣＩ基因组结构、功能和体外表达奠定了基础。     

长时间给予高选择性δ阿片受体激动剂抑制δ受体mRNA表达

我们采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,观察了δ阿片受体肽类激动剂「Ｄ－Ｐｅｎ＾２．５」ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ（ＤＰＤＰＥ）及非肽类激动剂ＢＷ３７３Ｕ８６对δ受体ｍＲＮＡ表达的影响,并比较了两者作用的差异性。结果如下：（１）ＤＰＤＰＥ作用２４及４８ｈ可使δ受体ｍＲＮＡ表达水平显著降低,则ＢＷ３７３Ｕ８６只在２４ｈ有显著抑制作用;（２）ＤＰＤＰＥ在１０＾－６ｍｏｌ／Ｌ时即可使δ受体的ｍＲＮＡ     

兔肝金属硫蛋白β结构域的制备和鉴定

制备一定量的Ｃｄ、Ｚｎ兔肝金属硫蛋白,然后脱掉其中的金属,获得不含金属的硫蛋白,用一价金属ＣｕＣｌ或ＡｇＮＯ３以５．８：１的金属：蛋白摩尔比与ａｐｏＭＴ结合,将其β结构域用金属饱和,在３７℃,ＰＨ７．０下用枯草杆菌蛋白酶水解掉未结合金属的α结构域,获得Ｃｕ（Ⅰ）、Ａｇ（Ⅰ）结合的兔肝ＭＴ－Ⅰ、ＭＴ－Ⅱ的β结构域,通过ＨＰＬＣ、羧甲基化后的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、氨基酸组成分析、金属定量、Ｎ末端分析和紫外     

重组人骨形成蛋白-3羧基端肽在大肠杆菌中表达及其诱骨活性

以双顺反子表达载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了人骨形成蛋白－３羧基端肽段（ｈＢＭＰ－３Ｃ）,表达量占菌体总蛋白量的１８．５％．目的蛋白为２５ｋＤ、含ｈＢＭＰ－３Ｃ端２１５个氨基酸残基组成的肽段,包括ｈＢＭＰ－３成熟肽和一部分前肽．表达产物以包涵体的形式存在,用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的洗涤液和５ｍｏｌ／Ｌ以下脲溶液连续洗涤,可获得较高纯度的重组人骨形成蛋白－３Ｃ端肽．经复性处理成可溶性蛋白,植入小鼠肌肉内,第１４ｄ组织切片显示有软骨细胞和软骨基质形成,第２１ｄ可见成骨细胞和骨基质形成．将ｒｈＢＭＰ－３Ｃ与脱矿去免疫原性异种骨粒复合后作小鼠肌肉植入试验,２１ｄ组织切片上可见硬质骨形成．结果表明：大肠杆菌表达的ｈＢＭＰ－３Ｃ经复性后具有诱骨活性,糖基化并非ＢＭＰ－３活性所必需．