促髓细胞分化的锌指基因单向PCR扩增直接测序的研究

锌指基因是一种造血调节基因,编码锌指结构蛋白,主要在髓细胞中表达,促进髓细胞分化,在急性早幼粒白血病维甲酸治疗中,促使病情缓解。本文报道了我们从基因分子上研究锌指基因作用中,探索并建立了单向聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增特定单链ＤＮＡ,直接测序的新方法。它能产生质和量均佳的单链ＤＮＡ,无需纯化即可直接用于测序,使复杂的测序研究简便易行,可在２,３天内完成。这种单向ＰＣＲ扩增特定单链ＤＮＡ直接测序的方法,经对锌指基因的ｃＤＮＡ测序,得到验证。此法不仅适用于疾病研究中的ＤＮＡ测序,还可制各单链ＤＮＡ探针,更利于基因结构组成的研究。     

线型扩增法测定DNA序列

线型扩增法测定ＤＮＡ序列ＳｈｅｉｌａＭ．ＡｄａｌｍｓＲｏｂｅｒｔＢｌａｋｅｓｌｅｙ著／李络红译／申宗候校就象流行的Ｍ１３单链ＤＮＡ测序一样现有一种ＤＮＡ双链的双脱氧测序法。直接从质粒克隆测序节时省功,既勿需用Ｍ１３为载体制备亚克隆又不必生产噬质粒斑来...     

17个新的C2H2型锌指基因片段的分离与克隆

按照Ｃ２Ｈ２型锌指基因保守结构域的ＤＮＡ序列设计一对简并引物,以人基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ同源扩增,将由此获得的锌指基因片段为探针,从人胎肾、骨骼肌、骨骼组织的ｃＤＮＡ分子库中筛选到２２个Ｃ２Ｈ２型锌指蛋白ｃＤＮＡ片段,经国际ＮＣＢＩ数据库查询检索,其中１７个为新的锌指基因片段。对从胎肾ｃＤＮＡ分子库中分离到的Ｋ３－４和Ｋ５－１２克隆进行了表达谱分析,发现Ｋ３－４在肾脏中的表达量明显高于其他几     

利用锌指基序的保守性从人脑组织分离新的C_2H_2型锌指蛋白基因表达序列

本文利用锌指基序的保守性设计引物,在低严谨条件下扩增人基因组总DNA,获得8个长度呈梯度的PCR扩增产物电泳条带。取其中第2和第3电泳条带,回收DNA片段并将它们克隆,经测序和查新比较,共获得60个含有锌指蛋白基因基序的单一的序列,其中23个为新的锌指蛋白基因DNA片段。以它们为探针,杂交筛选人脑组织cDNA文库,得到初筛cD-NA克隆44个。对其中28个初筛cDNA克隆进行复筛之后,得到20个cDNA单克隆。对这些阳性克隆进行测序,读出18个含有锌指蛋白基因基序的序列,国际联网查新之后,证明其中16个是新的锌指蛋白基因片段。这些新的锌指蛋白基因片段为今后克隆有意义的全长锌指蛋白cDNA提供了重要的实验材料。     

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆与真核表达载体的构建

根据Ｇｅｎｂａｎｋ中大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶（ＰＮＰ）基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以大肠杆菌基因组ＤＮＡ为模板,进行ＰＣＲ扩增,并将扩增产物定向连接到克隆、测序及真核表达载体ＰＣＤＮＡ３中,进行酶切鉴定、测序及序列分析。结果表明ＰＣＲ扩增出７４１ｂｐ大小的片段,通过酶切和序列分析证明含完整的ＰＮＰ基因序列且基因插入方向正确,此序列与文献报道的ＰＮＰ基因的同源性为９９．７％。说明克隆的ＰＮＰ基因与文献报道的基本一致,ｐｃＤＮＡ３－ＰＮＰ的构建成功为今后用其进行基因转染来研究ＰＮＰ／Ｍｅｐ－ｄＲ自杀基因系统在肿瘤基因治疗中的应用打下了基础。     

一种鉴别差异表达基因的新方法：———cDNA示差分析技术

ｃＤＮＡ示差分析技术是继ｍＲＮＡ差异显示技术之后又一种鉴别差异表达基因的方法。该技术利用双链ＤＮＡ模板在ＰＣＲ时呈指数扩增,而单链ＤＮＡ模板为线性扩增原原理,先用常见的限制性内切酶将实验组与对照组消化成平均长度为２５６ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,再用ＰＣＲ技术使用组的ｃＤＮＡ片段富集,随后进行３次差减杂交去除共有基因,最后扩增实验组中的特异表达的基因。本概述了该技术的原理、基本方法及其应用前景。     

人IgG Fc基因克隆及人源抗HBsAg全分子抗体在CHO …

利用ｍＲＮＡ提取试直接从健康人外周血白细胞中提取ｍＲＮＡ,逆转寻为 ｃＤＮＡ,合成引物扩增人抗体分子ＩｇＧＩ亚型Ｆｃ基因,克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ中并测序。合成引物扩增人抗体分子轻,重链信号肽序列,分别克隆并测序将轻链信号肽和轻链（ｋａｐｐａ）ＶＬ－ＣＬ基因进行重组形成轻链全分子基因,再将其克隆到哺乳细胞表达载全ｐｃＤＮＡ３．１中。将重链信号肽、重链（ｇａｍｍａ）ＶＨ－ＣＨ１和Ｆｃ基因进行     

RAPD技术及其在微生物学方面的应用

198 0年 ,Ｂｏｔｓｅｉｎ提出ＤＮＡ限制性片段长度多态性 (ＲＦＬＰ)可以作为遗传标记 ,从此开创了直接应用ＤＮＡ多态的新阶段。 80年代后 ,ＤＮＡ多聚酶链式反应 (ＰＣＲ)的发展 ,使直接扩增ＤＮＡ的多态性成为可能 ,并在此基础上产生了许多种新型分子标记 ,诸如扩增片段多态性 (ＡＬＦＲ)、串联重复序列(ＶＮＴＲ)、单链构型多态性 (ＰＣＲ ＳＳＣＰ)、序列特异扩增区域 (ＳＣＡＲ)、随机扩增多态性ＤＮＡ(ＲＡＰＤ)等。而ＲＡＰＤ是较为突出的一种。ＲＡＰＤ是由Ｗｉｌｌｉａｍｓ和Ｗｅｌｓｈ在 1 990年各自独立发现的一种ＤＮＡ多态检…     

苎麻疫霉激发蛋白基因断裂现象初探

苎麻疫霉可分泌具有诱抗作用的激发蛋白（α－ｅｌｉｃｉｔｉｎ）,根据α－ｃｌｉｃｉｔｉｎ第２４￣３０和５６￣６３位保守区氨基酸推导的寡核苷酸引物序列,对苎麻疫霉基因组ＤＮＡ进行特异ＰＣＲ扩增反应,发现其扩增的ＤＮＡ片段大于预计的片段。回收纯化的特异扩增ＤＮＡ,并进行克隆和测序分析,结果表明特异扩增的ｃｌｉｃｉｔｉｎ基因亚克隆ＤＮＡ为５７０ｂｐ,大于预计的１１７ｂｐ。在特异片段中,存在３个内含子将基因     

破伤风霉素C片段基因克隆,重组表达及免疫原性研究

应用ＰＣＲ技术从破伤风梭状芽孢杆菌ＤＮＡ中扩增出１．４ｋｂ ＤＮＡ基因,将其克隆到ｐＣＵ１８质粒中,经测序证明该ＤＮＡ片段为破伤风片段Ｃ的基因,并将此基因片段亚克隆到时ｐＧＥＸ－４５－２,构建成表达质粒ｐＧＥＸ－ＴＣ,在Ｅ．ｃｏｌｉ中进行表达。     

真核生物基因组DNA多态性

对真核生物基因组中小卫星ＤＮＡ多态性,微卫星ＤＮＡ多态性,限制性酶切片段长度多态性,随机扩增多态ＤＮＡ以及单链构象多态性的形式机理和表现形式进行了概述。     

不同样本前处理方法对高通量测序检测HBV、HCV、TTV结果的影响

目的:探索不同样品前处理方法对于不同类型病毒检测的效果。方法:分别将携带乙肝病毒(双链环状DNA病毒)、丙肝病毒(单正链RNA病毒)、TTV(Torque teno virus)(单链环状DNA病毒)的血清等比例混合,模拟混合感染,然后分别采用多重置换扩增(MDA)和随机锚定PCR扩增并进行高通量测序,同时以原始样品(未扩增)直接高通量测序作为对照。结果:原始样品(未扩增)直接测序,产出的数据大部分为人类的序列;MDA方法中绝大部分数据为TTV、乙肝病毒;随机锚定PCR扩增方法中绝大部分数据为乙肝病毒。结论:MDA方法适合扩增环状病毒,随机锚定PCR扩增适合含量高的病毒,不做任何处理直接高通量测序检测病毒效果最差。本研究可为指导不同类型病原体如何选择扩增方案提供借鉴。     

幽门螺旋杆菌单链抗体的筛选及鉴定

为了获得幽门螺旋杆菌特异性单链抗体scFv,通过噬菌体展示技术,首次直接用幽门螺旋杆菌细胞Hp对噬菌体单链抗体文库Tomlinson进行单链抗体的筛选,经5轮筛选后,通过ELISA方法检测,从随机挑选的96个克隆中获得了8株阳性克隆。再分别将阳性克隆与10种常见菌进行ELISA的交叉反应,最终得到1株特异性表达抗Hp的scFv的噬菌体JH1。随后又进一步对JH1所表达的scFv基因进行PCR扩增,分别得到scFv的VH片段、VL片段,全长基因分别为527bp、368bp和935bp,这些包含着部分载体序列的DNA片段与理论值相符。通过对scFv全长基因进行测序,在NCBI中进行基因序列比对,与已报道的一种植物RNA病毒的复制酶单链抗体基因序列有96％同源性。     

人工锌指核酸酶突变EGFP基因的功能分析

锌指核酸酶技术在基因定点修饰中具有效率高和特异性好等特点,并成功应用于数十种生物。目前,该技术是否能应用羊上尚未报道。为了敲除转基因山羊标记基因 (EGFP),构建了一对针对EGFP外显子上的锌指核酸酶表达载体,将其电转染至转EGFP基因胎儿成纤维细胞中,研究了锌指核酸酶突变EGFP基因的效率和方式,利用基因显微注射单细胞获得获得的转基因 (EGFP) 细胞系作为锌指核酸酶的靶细胞。结果显示,通过锌指核酸酶的突变作用,转染后的细胞发绿色荧光比例下降,测序结果显示在EGFP外显子中插入1个碱基G,导致编码EGFP基因的阅读框改变,从而起到基因突变的作用。结果表明,文中构建的锌指核酸酶对EGFP基因有突变作用,可以为以后获得无标记基因供核细胞进行体细胞核移植生产克隆羊奠定基础。     

人造锌指蛋白的应用

C2H2锌指是真核细胞中最常见的DNA结合模体。由于C2H2锌指域靶位点特异性与结构和功能的模块性构成,使得C2H2锌指域成为构建特定的DNA结合蛋白的常用骨架。保持C2H2锌指的基本骨架不变,替换锌指特定位点的氨基酸残基,并融合表达其他功能域就可以得到具有靶向性的人造锌指蛋白(ZFP)。ZFP可以介导靶基因的转录调控,抑制或激活特定基因的表达与配体依赖的靶基因激活或抑制;对DNA进行修饰,如人造限制性内切酶,重组酶,整合酶;抗病毒感染等。因此,人造锌指蛋白应用前景广阔,研究价值显著,是未来人类基因治疗的革命性的工具。     

岸蟹（Carcinus maenas）金属硫蛋白cDNA及其基因的克隆

利用已知的Ｃ．ｍａｅｎａｓ金属硫蛋白氨基酸序列资料,用全简并的ＰＣＲ引物,从鳃组织总ＲＮＡ中扩增出两种金属硫蛋白ｃＤＮＡ片断,并将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体中,序列测定表明,其中一种ｃＤＮＡ片断核苷酸序列和推知的Ｃ．ｍａｅｎａｓ金属硫蛋白核苷酸序列完全吻合;另一种ｃＤＮＡ片断则在３’端有较大变异。根据前者ｃＤＮＡ片段序列设计特异性引物,扩增并克隆了其编码区全长ｃＤＮＡ和其编码基因,测序结果表明,岸蟹     

大肠杆菌His6融合表达载体及其表达产物的一步变化

构建了Ｔ７启动子控制下的融合表达载体,使外源蛋白以Ｎ端与６个连续的组氨酸残基融合的形式表达。这些载体含有强Ｔ７启动子,终止子,翻译起始区,多克隆位点以及噬菌体ｆ１复制起始区,使外源基因不仅可以得到高效表达而且可以利用ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ包装单链ＤＮＡ,从而不需亚克隆玉可以直接进行测序及点突变。     

一种简便的双链DNA测序法

ASimpleMethodforSequencingDouble-sterandedDNATemplatesYuanHanyingLiWenLiYuyang(StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,InstituteofGenelics,FudanUniversity,Shanghai200433)随着分子生物学和基因工程研究的不断发展,快速而精确地测定DNA的序列是人们了解基因结构与功能的一项重要技术。在DNA测序技术中,口前用得较多的是利用M13、pBS系统重组单链DNA为模板,用双脱氧终止法[3]测序,对于许多不能得到单链DNA的亚组质材载体。通常以正纷双链DNA为模板进行测序,但这样就比单链DNA测序复杂得多了,首先要将双…     

鼠源抗HFRSV衣壳蛋白McAbF3株单链抗体基因克隆构建及表达

为了获得原抗ＨＦＲＳＶ衣壳蛋白ＭｃＡｂＦ３＾１株轻链可变区基因,由连接肽体外连接获得单链抗体基因,在大肠杆菌中表达,从鼠源抗ＨＦＲＳＶ衣壳蛋白ＭｃＡｂＦ３株细胞中分离总ＲＮＡ,以ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８为引物逆转录成ｃＤＮＡ,通过ＰＣＲ扩增出抗体的轻链（ＶＬ）和重链可变区（Ｖ１１）基因,由连接本外连接获得单链抗体（ＳｅＦｖ）基因。将此单链抗体（ＳｅＦｖ）基因插入原核表达载体ＰＥＴ２８ａ,经大肠杆菌（     

平胸龟Sox基因的克隆和序列分析

本文采用ＰＣＲ技术扩增和克隆了平胸龟的Ｓｏｘ基因,并通过银染测序进行了序列分析。结果显示,平胸龟雌雄个体均能扩增出相同长度的片段,其ＤＮＡ序列与人ＳＲＹ基因的ＨＭＧ－ｂｏｘ同源性达７２．７％,推测的氨基酸序列与ＳＲＹ基因的ＨＭＧ－ｂｏｘ序列同源性为４６．５％,充分显示出Ｓｏｘ基因在系统进化上的保守性。本文为Ｓｏｘ基因的起源和进化研究提供了资料。