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相似文献
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1.
本文利用PCR技术建立一种对HSV直接基因分型的方法。在HSV-Ⅰ、Ⅱ两型的DNA多聚酶基因上设计了一条两型共同的上游引物(HDP-B)和两条型特异的下游引物(HDP-1、HDP-2)。三条引物共同组成一个扩增反应体系,在HSV-Ⅰ产生543bp条带,HSV-Ⅱ产生372bp条带,据此在基因水平上对HSV进行分型。5株不同来源的HSV(2株Ⅰ型,3株Ⅱ型)分型结果与病毒分离及血清学方法完全一致。该反应体系与其它来源的DNA不产生特异反应,敏感性可达1fg。应用该法对151份临床可疑HSV感染的标本进行检测并分型,结果与免疫学方法完全一致。  相似文献   

2.
用抗单纯疱疹病毒(HSV)型共同性gC和gD单克隆抗体(McAb),包被Eppendorf管,捕捉HSV,同时加入3个引物:一个是HSV-1/HSV-型共同性上游引物,另两个分别是HSV-1和HSV-2型特异性下游引物。借此建立了能直接分型检测HSV的抗原捕获聚合酶链式反应(AC-PCR)。HSV-1的扩增产物为477bp,HSV-2的为399bp,两型病毒经AC-PCR扩增后产生分子量不同的DN  相似文献   

3.
利用PCR方法对单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D(HSV-2gD)基因进行了修饰,在其5'端删去约500bp的非编码区,仅保留ATG上游7个bp。将修饰后的HSV-2gD基因插入到带有痘苗病毒天坛株TK基因区段的痘苗表达质粒pJSA1175,置于痘苗病毒P7.5k早/晚期启动子控制下。将此重组质粒用脂质体Lipofectin方法转染已受野型TK ̄+痘苗病毒天坛株感染的TK ̄-143细胞,通过同源重组机制和标志基因LacZ产物的蓝斑显色作用,以及BudR试剂对TK表型的选择压力,筛选出整合有HSV-2gD基因的重组痘苗病毒。Southem杂交表明,HSV-2gD基因已正确地插入痘苗病毒TK基因区内;间接免疫荧光检测显示,HSV-2gD蛋白已得到有效表达,且主要分布于细胞膜。重组病毒免疫家兔可产生明显的抗HSV-2gD中和抗体。用重组病毒免疫小鼠,3周后可使94%(17/18)的小鼠对抗HSV-2的致死量攻击,表明重组病毒具有明显的免疫保护作用。  相似文献   

4.
用抗单纯疱疹病毒(HSV)型共同性gC和gD羊克隆抗体(McAb),包被即Eppendorf管,捕捉HSV,同时加入3个引物:一个是HSV─1/HSV─2型共同性上游引物,另两个分别是HSV─1和HSV─2型特异性下游引物。借此建立了能直接分型检测HSV的抗原捕获聚合酶链式反应(AC─PCR)。HSV─1的扩增产物为477bp,HSV─2的为399bp两型病毒经AC─PCR扩增后产生分子量不同的DNA片段,致使AC─PCR能直接分型检测HSV。HSV─1和HSV─2扩增产物的克隆和序列分析表明,本方法特异性好。用本法检测Balb/c幼鼠中枢神经系统HSV感染的脑标本,进一步证实本方法不仅敏感、特异,而且分型准确。  相似文献   

5.
以来自哈尔滨传染性法氏囊病病毒(IBDV) 强毒株(Harbin 毒株,H) 的基因组RNA为模板,用反转录聚合酶链反应(RT- PCR) 的方法得到了其A 节段的全长cDNA 片段,分5'端(1 659bp) 和3'端(1 444bp) 上下两段分别克隆到pGEMB○R - T 载体上,测定了其核苷酸顺序,在长为3 101 bp 中含有两个阅读框ORFA1 和ORFA2 ,分别编码1 012 个氨基酸的前体蛋白(VP2 - 4 -3) 和145 个氨基酸的VP5,ORFA1 和ORFA2 有部分的重叠。将核苷酸序列及推测出的氨基酸序列与已报道的IBDV 血清Ⅰ型和Ⅱ型毒株的相应序列进行了比较,结果表明:H 毒株与其它血清Ⅰ型毒株之间,在核苷酸水平上存在25bp - 267bp 的差异;在氨基酸水平上存在17 ~40 个氨基酸的差异。在VP2 - 4 - 3 内比较显示,H 毒株与P2 、Cu- 1 之间氨基酸的差异最小为1 .7% ,H 毒株与UK661 之间氨基酸的差异最大为3 .9 % 。变异主要发生在VP2 的可变区(206 - 350 位氨基酸) ,在H 毒株所特有的12 个氨基酸当中,该区就占5 个,代表1 .76 % 的变异。VP4、VP3 和VP5区各有  相似文献   

6.
从我国分离到的一株单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1-168株)病毒基因组中,分离出含有糖蛋白D(gD)基因的1.2kb片段,插入带有痘苗病毒天坛株TK区的质粒pJSB1175P7.5k启动子下游,转染无白血病鸡胚原代细胞,获得带有HSV-1-168gD基因的重组痘苗病毒。此株重组病毒在感染细胞膜上表达HSV-1-168gD糖蛋白抗原,能与特异性单克隆抗体反应。在感染细胞中表达的膜抗原经SDS-PAGE分析,表达分子量为54kD糖蛋白。用Southern杂交分析了重组病毒DNA中特异的gD基因,对作为活疫苗的重组痘苗病毒株进行了一些微生物学活性、免疫原性和毒力等方面的研究。  相似文献   

7.
PCR和生物素探针对HFRSV的检测和分型的探讨   总被引:2,自引:0,他引:2  
分析比较肾综合征出血热病毒(HFRSV)76/118株和R_(22)株的核苷酸序列,根据引物设计原则及检测分型的目的,设计并合成了3对引物。1对引物取于两毒株间的高同源区段,作为共同引物和外引物;另两对引物取于两毒株间的低同源区段,分别作为野鼠型引物、家鼠型引物和内引物。建立了DNA聚合酶链反应(PCR)和NestPCR方法,并用NcstPCR合成了两种型特异的生物素探针。PCR检测76/118、A_9、陈、R_2、R_225个毒株,用外引物时均扩增出1条约300bp的条带;用内引物的野鼠型引物时,除R_(22)株之外,其余4株均扩增出1条约70bp的条带。斑点杂交试验证实了PCR检测分型的准确性。NestPCR和生物素探针斑点杂交试验可以测出1-10bg的目的cDNA。  相似文献   

8.
伪狂犬病毒蛋白激酶基因的PCR扩增及其克隆鉴定   总被引:9,自引:0,他引:9  
以BHK-21细胞单层上增殖的伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV),经离心浓缩后,用SDS-蛋白酶K消化法分离纯化PRV基因组DNA。参照PRVKa株和NIA-3株蛋白激酶(PK)基因的DNA序列,设计并合成了一对长度为26bp和32bp的引物,以纯化的PRV基因组DNA为模板,用PCR技术成功地扩增出我国伪狂犬病毒地方株的PK基因,并将它克隆于pUC19载体。酶切分析结果表明,所获PK基因克隆在PstI、SmaI、XhoI和SalI上的切点与PRVNIA-3株相同。为下一步进行PK基因的体外缺失和重组,以构建减毒的PK缺失疫苗株奠定了基础。  相似文献   

9.
单纯疱疹病毒(HSV)Ⅰ型及Ⅱ型之间有很多共同抗原,能引起血清学交叉反应,鉴别诊断比较困难。本实验利用重组DNA技术,将部分HSV-2DNA的PstI片段克隆到载体质粒PSK中,并筛选出两个重组质粒(P和P)只与HSV-2反应,与HSV-1不反应,这两个重组质粒中所含的HSV-2DNA片段大小分别是3.1和4.3kb,另外,还筛选了一个重组质粒(PHSV2-1,含5.8kbHSV-2DNA片段)与HSV-1和HSV-2均反应。将4.3kb的片段用光生物素标记后作为探针检测了159份人阴道拭子,其中23份样品呈阳性反应,其余均为阴性,从23份阳性样品中挑选12价涂片用间接荧光抗体法检测也都呈阳性反应,随机挑选的几份杂交反应阴性样品在间接荧光试验中也是阴性。本实验制备的HSV通用及HSV-2型特异性探针将比常规的血清学方法诊断和鉴别HSV-1和HSV-2感染更为可靠。  相似文献   

10.
中国河南株丁型肝炎病毒全基因组的cDNA克隆和序列分析   总被引:3,自引:0,他引:3  
从我国河南-抗丁型肝炎病毒抗原(anti-HDAg)及丁型肝炎病毒(HDv)RNA双阳性的HBsAg携带者血清中提取RNA,采用人工合成的引物进行逆转录和聚合酶链反应(PCR),获得了贯穿HDV全基因组的6个相互重叠的cDNA片段。经双脱氧末端终止法进行核苷酸序列分析,得到了长度为1674bp的我国人河南株HDVcDNA全序列。计算机分析表明,该株与我国台湾株(HDVIA型)、美国-1株(HDVIB型)、日本-1株(HDVⅡ型)和秘鲁-1株(HDVⅢ型)的核苷酸同源性分别为的94.3%、86.8%、75.4%和66.3%,氨基酸序列的同源性分别为89.7%、85.1%、71.9%和64.6%,并在核苷酸和推导的HDAg氨基酸序列中分别发现了5个和2个集中保守的区域。这些区域均与HDV的某些重要功能密切相关。  相似文献   

11.
两种泥鳅中Sox基因的检出(英文)   总被引:1,自引:0,他引:1  
性别决定基因SRY都具有一个高度保守的基因序列──HMG-box,编码Sox蛋白,在胚胎发育过程中起重要作用。本文利用两种引物检测了泥鳅和大鳞副泥鳅的Sox基因。第一对引物特异扩增人类SRY基因的保守区。在扩增泥鳅的基因组DNA时可见长度分别为200、550、940和1000bp的四条扩增带。在大鳞副泥鳅中可以扩增出200、550、900bp三条带(Fig.1)。Southern杂交表明200和550bp两条带可以和SRY基因探针杂交(Fig.2)。第二对引物是兼并引物,可以特异扩增Sox基因的HMG-box区域。以基因组DNA为模板可以在大鳞副泥鳅中扩增出220、550、700和1500bp四条带(Fig.3);而在泥鳅中则为220、530、570和1500bp四条带(Fig.4)。PCR产物的长度差异被认为是由于部分Sox基因的HMG-box区域中存在着内含子。没有发现性别特异扩增带。以上结果说明哺乳动物与性决定有关的组分在脊椎动物中是广泛存在的。但这些组分在鱼类中是否与性决定有关,或仅是哺乳动物性决定因子的进化前体尚不得而知。无论如何广泛深入研究鱼类的Sox基因对于揭示性决定系统和因子的进化方式是十分  相似文献   

12.
通过反转录- 聚合酶链反应( R T- P C R) 获得了轮状病毒地方株 T114 V P6 全基因的c D N A 片段,将其克隆入转移载体质粒p V L1393 中,构建成重组质粒p V L1393 - V P6 。对克隆的 V P6 基因进行序列测定,并用它和杆状病毒( Ac M N P V) 野毒株 D N A 共转染 Sf9 细胞,筛选纯化得到含 V P6 基因插入片段的重组杆状病毒,并进行了表达重组蛋白 V P6 的检测。测序结果显示 V P6 基因全长1 356bp ,序列分析显示与 Wa 株非常接近,提示 T114 为亚组Ⅱ病毒株。用高价免疫血清经 Western blot 检测表达产物,结果显示,重组病毒感染细胞裂解液样品中可见大小约45k D 的特异条带;亚组Ⅱ特异性单抗检测到大小约120k D 的条带,提示重组蛋白 V P6 获得了表达,具有正常的抗原反应性和天然 V P6 的三体结构。  相似文献   

13.
应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从HCV感染者血清中扩增编码HCV病毒蛋白酶的NS2-NS3cDNA片段,在其5′和3′端分别引入EcoRⅠ和XbaⅠ限制性内切酶位点,定向克隆至真核表达载体pcDNA3,构建重组载体pcDNA-NS23,重组表达载体经限制性内切酶消化鉴定.用SP6和T7通用引物对目的基因片断进行序列分析.序列同源性分析结果表明,与HCV-J、HC-C2有高度的同源性,与HCV-1、HCV-J6、HCV-J8同源性差,提示所克隆的基因属HCVⅡ型.该区内重要的功能位点如Zn2+依赖性金属蛋白酶催化中心、丝氨酸蛋白酶催化中心等均高度保守  相似文献   

14.
参考汉坦病毒(HV)的基因文库软件设计M片段G-1区型特异性引物,以HV 76/118、H-114、A-9及R-{22}株RNA为阳性模板,建立HV的分型方法──逆转录一半巢式聚合酶链反应(RT-heminested PCR),对湖北省不同地区分离的30株HV进行分 型。结果显示:(1)建立的RT-heminested PCR分型方法对HV两型的代表株76/118(HTN)、A-9(HTN)、H-114(HTN)及R-{22}(SEO)RNA进行了特异性扩增,其大小与理论值一致;此 法只能检测HV RNA,不能检测其它病毒RNA。(2)分离于湖北省不同地区的30株HV的分型结果 为汉滩型21株、汉城型9株,其中长江以南汉滩型12株、汉城型2株;长江以北汉滩型9株、 汉城型7株。这表明建立的RT-heminested PCR用于HV的检测特异性好;分析湖北省不同 地区分离的30株HV,显示湖北省HFRS流行为混合疫区;且在湖北地区具有一定的地理聚集性。  相似文献   

15.
为研究我国不同地区不同人群中HDV毒株的感染分子特征,从我国河南、内蒙、北京、四川、广西、西藏、新疆、辽宁、上海等地的HDV健康携带者、慢性丁肝病人与重症肝炎病人中筛选获得10余份HDV-RNA阳性血清。经逆转录一多聚酶链反应(RT-PCR)交叉扩增获得HDV抗原编码区的cDNA片段并克隆到PGEM-3Zf(-)或PGEM-T载体上,经序列分析研究其基因结构特点,结果表明:中国的HDV毒株基因型均为Ⅰ型,但至少存在ⅠA、ⅠB两个亚型,HDV毒株在不同地区间存在异质性,其中河南-1、-2、-3株及新疆株与台湾株同源性较高(核苷酸与氨基酸同源性分别大于92.1%与86.9%).当为ⅠA型;内蒙-1、四川、广西、西藏-1、辽宁、北京株与美国-1株同源性较高(核苷酸与氨酸同源性分别大于94.3%与88.8%),当为ⅠB亚型;上海株与意大利株的核昔酸同源性最高,为98.1%。研究证明我国新疆、内蒙、西藏等地区抗HD阳性率比其他省市高并不是由于存在其他基因型所致。  相似文献   

16.
早期收集保藏的6株A型口蹄疫病毒(FDMV)(AL1-AL6),适应BHK21单层细胞后,提取6株细胞增殖病毒的RNA。用一对FMDV通用引物经反转录(RT)-PCR法扩增了约500bp的期望的DNA片段。克隆目的的基因后,采用双脱氧DNA链末端终止法测得了6株病毒的VP1基因210-639核苷酸序列。分析表明,3株病毒缺失3个核苷酸,从推导的氨基酸序列比较,确定缺失的3个核苷酸正好是一个密码子,  相似文献   

17.
根据猪瘟病毒C株的序列,以计算机辅助设计,化学合成1对引物(PF5648/PR6604),应用RTPCR技术从感染猪血中成功地扩增了我国猪瘟病毒强毒石门株NS23基因片段,大小为957bp,位于NS3基因的中部NTPase和Helicase活性区。克隆后测序,结果表明该段基因产物具有解旋酶超家族全部七个特征性保守序列,包括共同的NTP结合基序A位点(GXGKT/S)和B位点(3hy,2x)D。序列同源性比较表明,石门株与日本的ALD和GPE-株同源性最高,与其它3株猪瘟病毒(C株、Brescia株和Alfort株)的同源性也很高,并与2株牛病毒性腹泻病毒(BVDV)(NADL株和SD1株)也有较高的同源性,尤其是由核苷酸序列推导的氨基酸序列,同源性均大于90%,是瘟病毒属基因组中最保守的区段,这与该基因产物在病毒复制及聚蛋白前体加工过程中所具有的重要功能是一致的  相似文献   

18.
应用亲和层析法是纯鸡马立克氏病病毒PP38基因重组产物   总被引:3,自引:0,他引:3  
利用鸡马立氏病病毒(MDV)I型特异单克隆抗体H19致敏Sepharose4B-CNBr,从感染重组病毒BP38Ⅱ的昆虫细胞中提纯鸡马立克氏病毒PP38基因重组产物,获得良好效果,提纯的蛋白质的SDS-PAGE中表现出一条分子量约为38kDa的蛋白质条带,在免疫印迹试验中该蛋白质带也能被单克隆抗体H19识别。利用该提纯的重组PP38免疫小鼠,所制备的小鼠抗血清在免疫荧光染色试验中不仅能与感染重组病  相似文献   

19.
中国脊髓灰质炎病毒疫苗株基因变异的分析   总被引:12,自引:0,他引:12  
李杰  张礼璧 《病毒学报》1996,12(4):291-298
从急性弛缓性麻痹(AFP)病例分离的32株脊髓灰质炎(脊灰)病毒,在VP1编码区,经PCR-RFLP方法鉴定,并经核酸测序进一步证实力疫苗株,其中5株为I型疫苗,16株Ⅱ型疫苗株,11株Ⅲ型疫苗株,以同样的分析方法检测这些毒株基因组的3D聚合酶编码区,发现2株I型疫苗株在3D区的431个核苷酸序列为野毒序列,即这2株Sabin1基因型(VP1)与野毒基因型(3D)重组株;其余3株I型疫苗株未发现基  相似文献   

20.
鲁瑞芳  李毅 《微生物学报》1999,39(4):305-314
从水稻矮缩病毒(Ricedwarfvirus,RDV)中国福建分离物中克隆分离了最外层外壳蛋白基因(S2)全长cDNA并对其进行序列分析,结果表明RDVS2cDNA全长3512bp,仅含一个3348bp的阅读框架,编码一人含有1116个氨基酸的蛋白(P2)。与基因库中已知基因序列比较,发现它与日本RDVH株系相应片段的核苷酸和氨基酸同源率分别为94.6%和95.4%与轮状病毒VP2氨基酸序列有一定  相似文献   

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