亲和层析纯化HepG_2细胞分泌的PAI－1

本文报道用抗ＰＡＩ－１单克隆抗体（ＭｃＡｂ）亲和层析建立了纯化ＰＡＩ－１的简便方法。经免疫亲和层析,ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００凝胶过滤,从ＨｅｐＧ２细胞培液中分离到糖基化和非糖基化两种形式的ＰＡＩ－１,回收率为８４％,ＰＡＩ－１比活性６．１×１０４ＩＵ／ｍｇ。糖基化ＰＡＩ－１分子量为５０ｋＤ,比活性５．８×１０４ＩＵ／ｍｇ。非糖基化ＰＡＩ－１分子量４３ｋＤ,占总ＰＡＩ－１３０％,仍具有ＰＡＩ－１活性。用ＣｏｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析进一步纯化得到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纯的糖基化ＰＡＩ－１。     

抗人PAI—1单克隆抗体制备,鉴定和应用

以重组PAI-(rPAI-1)为抗原,通过杂交瘤技术获得6株阳性杂交瘤细胞(AP1、AP2、AP3、AP4、AP5和AP6),并用SPA亲和层析纯化了抗PAI-1单克隆抗体(McAb)。所有McAb均能识别rPAI和天然PAI-1,腹水滴度均为10~6以上。6种McAb对PAI-1亲和常数在3.45×10~7—1.05×10~9mol/L之间。AP2、AP3 McAb能完全抑制PAI-1活性,AP4、AP和AP6只能部分抑制PAI-1活性,AP1则不抑制PAI-1活性。6种McAb中只有AP1、AP4和AP5能识别PAI-1/t-PA复合物。利用AP1、AP3、和AP4 McAb制备免疫亲和柱一步纯化HepG_2细胞分泌的PAI-1,纯度大于98％,回收率92％,纯化倍数51倍。利用抗PAI-1 McAb建立了夹心法ELISA,测定了人血浆PAI-1水平,正常人血浆PAI-1平均含量(±D)为24.7±7.75ng/ml。     

半衰期延长获得PAI－1抗性的t—PA突变体的构建、表达及特性分析

用基因重级及定位突变技术成功地构建了ｔ－ＰＡ的Ｋ１区缺失突变体ｔ－ＰＡｄｅｌＫ１、ＰＡＩ－１结合位点缺失突变体ｔ－ＰＡｄｅｌ（２９６－３０２）及两的组合突变全ｔ－ＰＡｄｅｌ（Ｋ１,２９６－３０２）,并在ＣＯＳ－７细胞中实现三的暂时性表达,在ＣＨＯ细胞中实现了ｔ－ＰＡｄｅｌ（Ｋ１,２９６－３０２）的稳定性表达。对表达产物的生物学特性分析表明,ｔ－ＰＡｄｅｌ（２９６－３０２）及ｔ－ＰＡｄｅｌ（Ｋ１     

抗人PAI－1单克隆抗体制备、鉴定和应用

以重组PAI－（rPAI－1)为抗原,通过杂交瘤技术获得6株阳性杂交瘤细胞(Apl、AP2、AP3、AP4、AP5和AP6),并用SPA亲和层析纯化了抗Pal－1单克隆抗体(McAb)。所有McAb均能识别rPAI和天然PAI－1,腹水滴度均为10　6以上。6种McAb对PAI－1亲和常数在3．45×10⁷--1.05×10⁹mol／L之间。AP2、AP3McAb能完全抑制PAI－1活性,AP4、AP和AP6只能部分抑制PAI－1活性,Apl则不抑制PAI-1活性。6种McAb中只有Apl、AP4和AP5能识别Pal－1／t－PA复合物。利用Apl、AP3、和AP4 McAb制备免疫亲和柱一步纯化HepG2细胞分泌的PAI－1,纯度大于98％,回收率92％,纯化倍数51倍。利用抗PAI－1 McAb建立了夹心法ELISA,测定了人血浆PAI－1水平,正常人血浆PAI－1平均含量(X士D)为24．7±7．75ng／ml。     

纤溶酶原激活物抑制因子—1突变体E350G,E351K的构建及性质研究

利用ＰＣＲ扩增和合成突变引物的方法,将ＰＡＩ－１的Ｇｌｕ３５０和Ｇｌｕ３５１分别突变为Ｇｌｙ和Ｌｙｓ在大肠杆菌中表达并分离纯化突变体ＰＡＩ－１（Ｅ３５０Ｇ,Ｅ３５１Ｋ）有 酸胍激活并以ＥＬＩＳＡ法确定它与野生型ｒＰＡＩ－１的相对含量,通过对ｕ－ＰＡ抑制的动力学研究表明,突变体与野生型ｒＰＡＩ－１相比,对ｕ－ＰＡ和ｔ－ＰＡ的抑制活性都有明显下降,由活性态向潜伏态转变的半寿期也由０．８３ｈ缩短为０．５     

表达人PAI-1的重组腺病毒的制备及检测

人纤溶酶原激活剂抑制物1（PAI-1）基因与复制缺陷型腺病毒载体AdCMVHSgD重组,与pJM17质粒共转染293细胞,采用不铺琼脂的方法产生重组病毒.PCR证实PAI-1基因重组进入腺病毒.进一步感染B16（F10）细胞,细胞表面洗提物和上清分别经纤维显示胶和反向纤维蛋白显示胶检测PAI-1抑制纤溶酶原激活剂（PA）的活性.     

纤溶酶原激活剂抑制物2型抑制细胞凋亡的研究进展

纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）是一种多功能蛋白质,除了能有效抑制尿激酶（ｕＰＡ）和双链组织型纤溶酶原激活物（ｔＰＡ）而调节纤溶活性外,还参与了很多其它的生理病理过程,例如组织重建、胚胎发育、感染、免疫系统发育、肿瘤浸润和迁移等。更有研究表明胞内型ＰＡＩ－２在抑制细胞凋亡方面也发挥着重要作用。本文就近年来ＰＡＩ－２抑制细胞凋亡的研究进展作一综述。     

大鼠卵巢细胞分泌纤溶酶原激活因子抑制因子（PAI—1）的...

Rat ovarian cells produce not only plasminogen activator (tPA) but also plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1), and their coordinated geneexpression induced by gonadotropins are thought to be responsible for follicular rupture. In this study, it was demonstrated that (1) theca-interstitial compartment synthesizes the majority of PAI-1 activity in the ovary before ovulation, the follicular wall may therefore serve as a specific barrier to prevent the secretion of PA into the extrafollicular compartment; (2) Granulosa cells contribute only small amount of ovarian PAI-1 activity, but synthesize most of tissue-type plasminogen activator activity involved in the process leading to ovulation: (3) Since only matured cumulus-oocyte complexes secrete high level of tPA and PAI-1, both tPA and PAI-1 activity in the conditioned medium may be used as reliable markers for evaluating oocyte quality for in vitro fertilization.     

人组织型纤溶酶原激活剂（t－PA）突变体FrGGI的构建、表达及特性分析

为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有ＰＡＬ－１抗性的新型ｔ－ＰＡ溶栓剂,利用基因重组及定位突变技术构建了ｔ－ＰＡ的Ｋ１、Ｋ２区糖基化位点消除,ＰＡＩ－１结合位点缺失,Ｆ与Ｅ区连接序列Ｈｉｓ４４～Ｓｅｒ５０置换为纤粘蛋白Ⅰ型Ｆ区间连接序列ＧｌｕＳｅｒＬｙｓＰｒｏＧｌｕＡｌａＧｌｕＧｌｕ的ｔ－ＰＡ组合突变体ＦｒＧＧＩ,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达。对表达产物的生物学特性分析表明,ＦｒＧＧＩ在大鼠血浆中的半衰期延长了１５倍,并获得了ＰＡＩ－１抗性,是一株很有希望的新型溶栓剂候选株。     

半衰期延长获得PAI－1抗性的t—PA突变体的构建、表达及特性分析

用基因重组及定位突变技术成功地构建了t·PA的Kl区缺失突变体t—PAdelKl、PAI-1结合位点缺失突变体t—PA del(296—302)及两者的组合突变体t—PA del(Kl·296—302),并在COS－7细胞中实现三者的暂时性表达,在cHO细胞中实现了t·PA deI(K1．296—302)的稳定性表达．对表达产物的生物学特性分析表明,t—PA del(296—302)及t-PA del(K1,296—302)获得了Pal－1抗性．因时t-PA del(K1．296—302)在大鼠体内的半衰期延长约5倍,而与纤维蛋白的亲和力只略有下降。因此,此组合突变体有可能成为优于野生t—PA的新型溶栓剂候选株．     

重组PAI－2对肿瘤细胞降解细胞外基质的影响

重组ＰＡＩ－２对肿瘤细胞降解细胞外基质的影响曹祥荣（南京师范大学生物系,２１００２４）关键词纤溶酶原激活剂抑制剂－２,基因重组,细胞外基质降解肿瘤细胞转移过程中最重要的因素是肿瘤细胞侵袭能力,其生化过程即为细胞外基质（ＥＯＭ）降解作用。纤溶酶系统（纤...     

人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在大肠杆菌中的表达和分离纯化

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）ｃＤＮＡ,与ｐＵＣ１８重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人ＰＡＩ－２ｃＤＮＡ．ＰＡＩ－２ｃＤＮＡ与原核表达载体重组,构建原核表达质粒并转化大肠杆菌．经温度诱导表达,重组ＰＡＩ－２占全菌总蛋白的１４％,以可溶性形式存在,具纤溶抑制活性．工程菌发酵、压榨后,用硫酸铵分级沉淀,沉淀物经分子筛、离子交换和疏水性色谱的分离,每升菌液可获得约３０ｍｇ纯度达９０％的蛋白质,比活性为１１８６６ＡＩＵ／ｍｇ蛋白质,得率为１９．２％．     

人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在Pichia pastoris中的表达

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）基因,与ｐＰＵＣ１８重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人ＰＡＩ－２基因．ＰＡＩ－２基因与表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建受乙醇氧化酶１基因（ＡＯＸ１）启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化ＧＳ１１５宿主菌,经表型筛选和ＰＣＲ扩增筛选阳性克隆,用甲醇诱导表达,重组ＰＡＩ－２以分泌型表达,占分泌总蛋白的３０％,具ＰＡＩ－２抗原性,与低分子量尿激酶形成了抗ＳＤＳ复合物,具抑制纤溶的活性（９１．４ＡＩＵ／ｍｌ）．对培养条件也进行了探讨．     

去卵巢大鼠血浆组织型纤溶酶原激活物(t-PA)与其抑制物(PAI)的变化

了解性激素对血栓形成的影响。方法：用发色底物方法测定去卵巢大白鼠及对照组血浆组织型纤溶酶原激活物（ｔＰＡ）与其抑制物（ＰＡｌ）活性。结果：去卵巢组大白鼠血浆ｔＰＡ与对照组比较无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。而去卵巢组大白鼠血浆ＰＡＩ比对照组明显降低,两组比较有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。结论：去卵巢组血浆中ＰＡＩ降低,可能与卵巢激素的减少有关。卵巢激素会促使ＰＡＩ合成释放增加,这可能是服用雌激素等避孕药者纤溶活性降低,血液呈高凝状态的重要机制之一     

纤溶酶原激活物抑制因子—1蛋白分子的结构与功能

纤溶酶原激活物抑制因子－１（ＰＡＩ－１）是组织型纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）和尿型纤溶酶原激活物（ｕ－ＰＡ）的特异性抑制剂。对ＰＡＩ－１分子的结构与功能的认识,有助于了解ＰＡＩ－１作用的机理。本综述了近年来对ＰＡＩ－１蛋白分子结构与功能研究的进展,介绍了ＰＡＩ－１分子中一些区域的作用以及影响ＰＡＩ－１抑制活性的一些因子。