雌激素干扰亚急性MPTP小鼠PD模型黑质纹状体DRP1表达

探究1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的亚急性帕金森病(PD)模型小鼠黑质纹状体神经元动力相关蛋白1(DRP1)的表达以及在雌激素的干预下所发生的变化,从而进一步探讨雌激素对帕金森病的保护作用以及在线粒体动力学方面的作用机制和原理。本研究将C57/BL小鼠随机分配为4组:模型组(MPTP)、对照组(生理盐水)、干预组(Estrogen+MPTP)、干预对照组(Estrogen),腹腔注射一定浓度的MPTP,造模成功后,灌胃给药戊酸雌二醇,一段时间后观察小鼠行为学变化,采用双标免疫荧光检测各组的DRP1和GFAP在小鼠脑黑质纹状体神经元的表达差异,以及采用免疫组织化学和免疫蛋白印迹法检测PD小鼠黑质纹状体DRP1表达的变化以及给予雌激素干预后对上述变化的影响。研究显示,与对照组相比,模型组(MPTP)小鼠表现出典型的PD症状,脑黑质纹状体神经元DRP1明显增多;经雌激素干预处理后,小鼠PD症状有所减轻,免疫组织化学和免疫蛋白印迹法检测的各组脑黑质纹状体DRP1的表达的变化趋势一致,干预组的DRP1表达量明显低于模型组,高于干预对照组,并且对照组和干预组的DRP1表达量无显著性差异。说明一定浓度的雌激素对正常的小鼠无明显作用,而对患PD的小鼠,雌激素能明显改善其病症,因此,雌激素对帕金森病起着一定的保护作用,其潜在的机制可能与雌激素降低了黑质纹状体神经元DRP1的表达从而减少了线粒体异常分裂有关,但是具体的原理还需要进一步的深入研究。     

MPTP诱导的帕金森病小鼠模型黑质脑组织DNA甲基化研究

为研究DNA甲基化在帕金森病发病机制中的作用,本研究用环境毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)连续腹腔给药诱导小鼠帕金森病(Parkison's disease,PD)模型,应用ELISA检测小鼠黑质脑组织总体甲基化水平,应用实时荧光定量PCR方法检测DNA甲基转移酶表达水平,探讨MPTP诱导的小鼠PD模型黑质部位是否存在DNA甲基化异常.进一步应用甲基化DNA免疫共沉淀结合DNA甲基化芯片方法,构建MPTP诱导的小鼠PD模型黑质脑组织DNA甲基化谱,并寻找DNA甲基化修饰异常的PD相关基因对其进行验证.结果表明,模型组小鼠黑质脑组织DNA总体甲基化水平较对照组显著降低,Dnmt1的表达水平显著增高.利用DNA甲基化芯片在全基因组内筛选出甲基化差异修饰位点共48个,涉及44个基因,这些甲基化差异基因参与信号转导、分子转运、转录调控、发育、细胞分化、凋亡调控、氧化应激、蛋白质降解等生物学过程.在甲基化差异修饰基因中,对Uchl1基因及Arih2基因进行了甲基化水平以及表达水平的验证.结果表明,模型组小鼠黑质脑组织Uchl1启动子区域甲基化水平较对照组增高,m RNA及蛋白质表达水平降低,Arih2启动子区域甲基化水平较对照组降低,m RNA及蛋白质表达水平增高.实验结果进一步证实,DNA甲基化修饰异常在帕金森病发病机制中有重要作用,环境因素(如MPTP)可以通过改变DNA甲基化修饰参与帕金森病的发生发展.     

应用基因表达数量性状基因座定位（eQTL）研究PINK1表达调控

Pink 1基因编码定位于线粒体上的丝/苏氨酸激酶（即PARK6）,为常染色体隐性遗传性帕金森病（Parkinsons disease, PD）连锁的基因．该基因在遗传性和散发性PD的发病中起重要作用,但其发病机理尚未明确．本研究以近交系C57BL/6J (B6) 和DBA/2J (D2)小鼠制作MPTP诱导的PD鼠为模型,借助基因表达数量性状基因座(eQTL),结合分子生物学方法,分析Pink1的表达调控．结果显示,Pink 1基因在PD模型组中表达显著升高．区间连锁分析检测显示,引起Pink 1基因表达水平差异的染色体区域,定位于4号染色体上,距Pink 1基因自身5 Mb范围之类,属于顺式调节eQTL．Pearson相关分析表明,在BXD 基因重组近交系（recombinant inbred,RI）小鼠脑中,Camk2n等30个基因的表达与Pink 1基因高度相关,相互间可能存在一定的协同作用．Pink 1基因在行使特定生物学功能时,很可能协同这些基因一起发挥相应的作用,这部分基因是深入研究Pink 1基因在PD发病中分子机制的重要靶点．     

帕金森病患者脑脊液蛋白质组学分析

帕金森病（Parkinson′s disease,PD）是一种中枢神经系统慢性进展性疾病.本研究采用双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）分离脑脊液（cerebrospinal fluid,CSF）蛋白,获得2-DE图谱,通过ImageMaster 2D Elite软件分析寻找两组的差异蛋白点.结果显示,PD患者CSF中有4个蛋白点丰度下降,22个蛋白点丰度上升.还利用电喷雾质谱（electrospray ionization-tandem mass spectrometric,ESI-MS）对差异蛋白点进行鉴定,发现丰度上升的蛋白点有电压依赖性钙通道α2/δ1亚基,结合珠蛋白,β2-微球蛋白和阿朴脂蛋白A-IV前体,丰度下降的蛋白点为转铁蛋白和转甲状腺蛋白.研究发现,PD患者与对照组CSF蛋白质表达有明显差异,对差异蛋白进行质谱鉴定并了解它们的功能,为以后进一步研究他们在PD发病机制和病程进展中的作用奠定基础.     

MPTP诱导小鼠黑质区铁摄取和DMT1表达增加

铁在帕金森病(Parkinson‘s disease,PD)的发病机制中起着非常关键的作用,为了探讨PD中铁升高的机制,本实验观察了1-甲基4-苯基—1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)处理小鼠黑质(substantia nigra,SN)内铁摄取及新的铁转运蛋白二价金属离子转运蛋白1(DMT1)的表达变化。结果表明：(1)MPTP处理组小鼠SN内铁染色增高,注射MPTP7d组明显高于3d组。(2)MPTP处理组小鼠,酪氨酸羟化酶(TH)免疫阳性细胞数目显著减少。(3)MPTP处理组小鼠,“-IRE”型DMT1表达在各组中均增加,而“ IRE”型DMT1仅在MPTP处理后7d才出现变化。上述结果提示,这种新发现的哺乳动物跨膜铁转运蛋白表达增加可能是引起MPTP处理小鼠SN中铁升高的关键因素,铁的升高进一步导致DA神经元的死亡。     

星形胶质细胞在MPTP帕金森小鼠脑内的变化研究

目的：研究神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahy-dropyridine,MPTP）对小鼠脑内星形胶质细胞及肿瘤坏死因子-α（Tunlomecrosis factor alpha,TNF-α）的影响,了解MPTP致帕金森病发病机制。方法：将神经毒素MPTP注入C57BL／6小鼠腹腔内,制备帕金森病动物模型。观察注药后小鼠行为学变化,免疫组化检测各时间点多巴胺能神经元缺失和星形胶质细胞增生与激活情况,以及TNF-α表达水平的变化。结果：MPTP组黑质多巴胺（dopamine,DA）能神经元的数量随注射天数增加而持续减少,星形胶质细胞数量明显增高,GFAP及TNF-α在模型组黑质内有中强阳性表达,与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：MPTP可诱导星形胶质细胞的激活和增生,启动脑内炎症反应而介导DA神经元死亡。     

帕金森病小鼠模型行为学检测方法的比较研究

目的比较目前常用的5种帕金森病(PD)小鼠模型行为学检测方法在PD研究中的作用。方法用MPTP建立C57BL小鼠PD模型,通过行为学检测(自主活动计数、滚轴实验、游泳实验、爬杆实验、悬挂实验)、免疫组织化学和荧光分光光度法,对比5种行为学检测方法的平均数与变异系数,观察MPTP对PD小鼠模型的行为学、黑质多巴胺(DA)神经元和纹状体酪氨酸羟化酶免疫反应阳性(TH-ir)神经纤维以及纹状体DA水平的影响。结果给与MPTP后,小鼠行为学计数降低,爬杆实验未能得到检测结果,悬挂实验变异系数很高,结果有明显的偶然性,滚轴实验结果变异系数中等,平均数呈现一定的上升趋势,自主活动计数中移动与站立和游泳实验的平均数则呈现明显的下降趋势,变异系数很低,而黑质DA神经元数目减少约58%,纹状体TH-ir神经纤维密度减低,纹状体DA水平明显降低约88%,两组相比差异有显著性(P<0.01)。结论MPTP所致的C57BL小鼠的神经病理、生化改变与PD患者近似,自主活动计数和游泳实验优于其他行为学检测方法。     

Parkin、PINK1、DJ-1和线粒体功能障碍与帕金森病

帕金森病(Parkinson’s disese,PD)是一种常见的神经退行性疾病,但到目前为止发病机制尚不明确,环境和遗传等因素与其发病有密切关系。研究表明,蛋白质异常积聚(泛素/蛋白酶体途径)和线粒体氧化损伤(线粒体途径),可能是导致PD患者发病的关键分子机制。Parkin、PINK1和DJ-1等基因突变与常染色体隐性的家族性PD有关,这些相关基因编码的蛋白对于维持线粒体形态和功能起着重要的作用。本文将主要从Parkin、PINK1、DJ-1和线粒体功能障碍与帕金森病的关系进行综述。     

心力衰竭大鼠心肌线粒体蛋白质组学研究

通过差速离心分离大鼠心肌线粒体,利用蛋白质组学技术构建正常大鼠心肌线粒体蛋白质组表达图谱;选用心肌梗死诱导的心力衰竭大鼠模型,分析比较心力衰竭时心肌线粒体蛋白质表达谱的改变.与正常对照组相比,心力衰竭大鼠心肌线粒体共有188个蛋白点的表达量发生了变化,其中有120个蛋白点表达上调2倍以上,有68个蛋白点表达下调1/2以上（P〈0.05）.对差异表达的蛋白点行胶内酶解后质谱鉴定和数据库检索,对蛋白质进行功能注释、亚细胞定位和生物信息学分析,其中有27个蛋白质涉及能量代谢和氧化应激,其中参与糖酵解及三羧酸循环的蛋白质（酶）表达上调,而参与OXPHOS复合体和脂肪酸代谢的蛋白质（酶）表达下调.研究结果表明,心力衰竭时心肌能量代谢模式发生了改变,底物选择从倾向于脂肪酸转为葡萄糖利用增加,糖酵解增强而脂肪酸氧化能力减低;为心肌缺血性损伤时线粒体结构和功能改变提供了分子依据,在蛋白质水平上阐述了线粒体在心力衰竭发展中的可能机制.     

AAV介导的α-synuclein基因过表达致多巴胺能神经元损伤-一种制作轻度帕金森病大鼠模型的新方法

目的：研究过表达α-synuclein基因是否导致大鼠黑质纹状体选择性损伤,为帕金森病（parkinson’s disease, PD）大鼠模型的制备提供一种新的方法。方法:用腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)做载体,将人野生型α突触核蛋白(α-synuclein, NACP)引入大鼠脑内,观察大鼠行为学的改变,通过免疫组织化学染色观察其对黑质多巴胺能神经元细胞的影响,高效液相色谱（HPLC）检测纹状体多巴胺（DA）的含量。结果:α-synuclein基因过表达后大鼠出现自发性活动减少、爬行活动减慢、暂时性躯干震颤、竖毛等类似PD初期的症状和体征;大鼠脑黑质TH阳性神经元细胞随时间的延长出现数目减少,并且纹状体DA含量也出现减少,并且出现α-synuclein的积聚。结论:上述结果表明α-synuclein基因的过表达引起黑质多巴胺能神经元细胞的死亡,对大鼠的运动行为有一定的影响,产生类似于PD早期的症状与体征,与化学毒素（如6-OHDA, MPTP）诱导的动物模型相比,此法制作的动物模型可模拟PD缓慢发展的进程,为研究PD的病程进展及发病机制提供一个理想的动物模型。     

鱼藤酮帕金森大鼠多脑区铁积聚与胶质细胞激活

目的观察鱼藤酮帕金森病（Parkinson＇s disease,PD）大鼠铁积聚脑区胶质细胞是否激活。方法雄性Wistar大鼠予颈背部皮下注射鱼藤酮（2 mg/kg）葵花油乳化液,每日一次,连续注射4~6周制备PD模型,8周时做冰冻切片,行免疫组化染色观察PD大鼠铁积聚脑区小胶质细胞（OX42）和星形胶质细胞（GFAP）。结果 PD大鼠黑质致密部、海马齿状回颗粒细胞层、纹状体苍白球、小脑齿状-间位核及小脑面神经核中铁染色显著积聚区域内小胶质细胞和星形胶质细胞染色积分光密度值较正常组明显增加（P〈0.05）。结论鱼藤酮PD大鼠铁积聚脑区小胶质细胞、星型胶质细胞均呈激活状态。     

骨髓间充质干细胞黑质内移植对帕金森病大鼠的治疗作用

目的探索骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植到帕金森病（Parkinson’s disease,PD）大鼠毁损侧黑质内,PD模型大鼠的姿势不对称性和黑质及纹状体内酪氨酸羟化酶（tyrosinehy droxylase,TH）表达的改变,以及BM—SCs在大鼠脑内的存活、分化情况。方法黑质、前脑内侧束两点法注射6一羟多巴胺（6-OHDH）并行为学分析筛选PD模型大鼠。将PD模型大鼠随机分为移植组和对照组。BMSCs移植术后4周和8周,观察大鼠姿势不对称性,免疫组织化学及免疫荧光显色方法检测黑质和纹状体酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）的表达变化以及BMSCs在大鼠体内的存活、迁移及分化情况。结果BMSCs黑质内移植可使PD模型大鼠的转动频率由（10．62±2．97）r／min降至（4．65±1．08）r／min（P〈0．01）,显著增加毁损侧黑质TH阳性细胞数量和纹状体内TH阳性纤维密度。BMSCs在大鼠黑质内可以存活至少8周,部分细胞分化为神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。结论黑质内移植BMSCs对PD模型大鼠有一定的治疗作用。     

α-synuclein致病机制和转基因帕金森疾病模型研究进展

α-synuclein是一种位于突触前末梢的蛋白,是遗传性和散发性帕金森病的特征性包涵体———路易小体的主要成分。α-synuclein基因突变或者遗传改变可导致帕金森病。大量研究揭示α-synuclein参与了神经元的变性过程。本文对α-synuclein在帕金森疾病中的神经元毒性机制以及α-synuclein转基因帕金森病动物模型研究进展进行了综述。     

骨髓间充质干细胞源神经细胞移植治疗帕金森病大鼠模型

目的探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）源神经细胞脑内移植对帕金森病（Parkinson s disease,PD）大鼠的治疗作用。方法贴壁培养法分离、培养大鼠骨髓MSCs,脑匀浆上清诱导第3代MSCs向神经细胞分化,采用免疫细胞化学法鉴定诱导分化后细胞的性质,激光共聚焦显微镜检测诱导前后细胞Ca2＋浓度变化,6只PD大鼠行纹状体内MSCs源神经细胞移植作为细胞移植组,6只PD大鼠作为对照组。细胞移植术后4周检测PD大鼠的行为变化,观察移植细胞在脑内的分布情况。结果倒置显微镜下可见MSCs呈纺锤形和多角形,有1～2个核仁,MSCs经脑匀浆上清诱导后其胞体折光性增强,发出数个细长突起,互相交织成网,有的似轴突。诱导后细胞表达神经元特异性标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经丝蛋白（NF）,胞质Ca2＋荧光强度显著增强,可推测诱导后的细胞为MSCs源神经细胞,将BrdU标记的MSCs源神经细胞移植到PD大鼠纹状体治疗4周后,可见细胞散在分布于注射侧脑组织,有少量细胞可迁移到对侧脑组织,PD大鼠的旋转行为得到显著改善。结论MSCs源神经细胞移植治疗帕金森病大鼠可使其旋转行为得到改善。     

多巴胺能神经元线粒体的氧化损伤与帕金森病

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的一个主要病理特征就是中脑黑质多巴胺能神经元的丧失,目前研究认为该病理变化与多种因素有关,包括蛋白质异常积聚、泛素蛋白酶体系统功能异常、神经炎症、线粒体损伤和氧化应激。在帕金森病人和动物模型中,中脑黑质有着明显的氧化改变。帕金森病的遗传和环境因素均会作用于线粒体,尤其对线粒体呼吸链复合体I有着抑制作用,造成线粒体损伤,产生活性氧(ROS)。活性氧的大量产生造成脂类、蛋白质和DNA的氧化,从而加剧多巴胺能神经元的线粒体和细胞损伤。多巴胺代谢过程中会产生活性氧,该自身代谢特点决定了多巴胺能神经元存在有较高的氧化应激,易受环境因素的影响。因而,线粒体的氧化损伤在帕金森病病理发生中起着重要作用。     

帕金森大鼠黑质和纹状体BMP4及其mRNA表达的时程变化

目的：探讨帕金森（PD）大鼠模型体内脑黑质和纹状体内骨形成蛋白4（BMP4）及其mRNA表达的变化规律。方法：用六羟基多巴胺（6-OHDA）建立PD模型后,第2、4、6、8和10周时处死大鼠,取左侧黑质、纹状体,用免疫组化、酶联免疫、荧光定量PCR技术从蛋白水平和基因水平检测BMP4及其mRNA表达。结果：BMP4及其mRNA表达基本一致,其BMP4及mRNA表达均呈双峰,其蛋白表达在纹状体内第2周和6周时达高峰、在黑质内第2周和8周时达高峰,其mRNA表达在纹状体内第2周和8周时达高峰、在黑质内第4周和8周达高峰,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：PD大鼠模型体内,BMP4及其mRNA不呈现稳定的低表达,而是有波动性,明确BMP4及其mRNA处于稳定低表达的时间后,为下一步的治疗实验时间点的选择上奠定了基础。