E.coli木糖异构酶基因的克隆及表达条件的优化

采用PCR技术以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板扩增得到木糖异构酶基因xylA,连接到载体pET-22b( ),得到重组质粒pET-22b( )-xylA。将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,重组菌株经IPTG诱导后,通过半胱氨酸-咔唑法测得木糖异构酶活力。每mL发酵液中重组菌株显示出酶活力约为0.84 U。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的5×104(相对分子质量)特异性蛋白质条带。     

Bacillus Stearothermophilus IAM 11001 L-阿拉伯糖异构酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究

L-阿拉伯糖异构酶是生物法生产新型功能性因子D-塔格糖最为有效的酶。本文获得了一种新型耐热L-阿拉伯糖异构酶的编码基因araA,来源于Bacillus stearothermophilis IAM 11001,经NCBI Blastn分析,与GenBank中Thermus sp. IM6501 araA序列的同源性为95%,并将该新基因提交到GenBank,获得登陆号：EU394214。以pET-22b(+)为载体质粒,E. coli BL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的蛋白的过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析,约在59 kDa处出现显著的特征蛋白条带;同时对重组L-AI的活性进行了初步研究,全细胞反应24小时D-塔格糖的转化率为39.8%。     

Bacillus Stearothermophilus IAM 11001 L-阿拉伯糖异构酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究球

L-阿拉伯糖异构酶是生物法生产新型功能性因子D-塔格糖最为有效的酶。一种新型耐热L-阿拉伯糖异构酶的编码基因araA,来源于Bacillus stearothermophilis IAM 11001。经NCBI Blastn分析,与GenBank中Thermus sp．IM6501 araA序列的同源性为95％,并将该新基因提交到GenBank,获得登陆号：EU394214。以pET-22b（＋）为载体质粒,E．coli BL21（DE3）为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的蛋白的过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析,约在59kDa处出现显著的特征蛋白条带;同时对重组L-AI的活性进行了初步研究,全细胞反应24小时D-塔格糖的转化率为39．8％。     

高温乳糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达

来源于嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus)的β-半乳糖苷酶基因bgaB经克隆,测序后,转入大肠杆菌高效表达载体pET-20(b)中,重组菌在IPTG诱导下,表达出的重组蛋白比酶活量为6.66U/mg。比出发菌株高50倍。     

肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶基因在大肠杆菌中的表达

以肠膜明串珠菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到1 581 bp的蔗糖磷酸化酶(SPase)DNA片段.将该基因克隆到表达载体pET-22b(+)上,构建获得重组质粒pET-SPase.测序结果与GenBank上已公布的基因序列比较,有1个碱基发生变化,但该碱基的改变未引起氨基酸序列的改变.将pET-SPase转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态中,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析,目的蛋白条带约为55 kD,与预期大小一致,结果表明SPase基因在大肠杆菌中进行了表达.酶活分析,产物的比活为1.8 U/mg,证明了表达产物具有预期的酶活性.进一步考察了IPTG浓度、诱导温度和时间等因素对重组菌表达的蔗糖磷酸化酶的影响.在优化条件下,该蔗糖磷酸化酶的比活可以达到16.6 U/mg,比优化表达条件前的酶比活提高了9.2倍,比已报道的肠膜明串殊菌粗酶液比活(7.1 U/mg)提高了2.34倍.     

节杆菌A.pascens DMDC12锰超氧化物歧化酶基因的克隆和表达

利用PCR技术对自行筛选的高度耐盐节杆菌Arthrobacter pascensDMDC12中的超氧化物歧化酶基因进行克隆,获得了节杆菌A.pascensDMDC12的SOD新基因(GenBank收录号为DQ779150)。将该基因与原核表达质粒载体pET-22b( )连接,构建重组质粒pET-sodAP,将质粒转化至表达宿主菌E.coliBL21(DE3),构建基因工程菌BL21/pET-sodAP。用异丙基硫代--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导重组SOD蛋白表达,用酶活和SDS-PAGE分析表达产物,表达产物的相对分子质量为2.4×104,与sodAP推测的长度相同。表达目的蛋白占菌体可溶性蛋白的23%,比酶活达915.07 IU.mg-1,是对照菌株的8.73倍,具有较高的表达。本研究为进一步进行重组Mn-SOD的研究和应用奠定了基础。     

地芽孢杆菌Y565-5分离鉴定及其木糖异构酶基因xylA的克隆表达和酶学性质

从甘肃玉门油田地表土中分离到一株嗜热木糖利用菌,地芽孢杆菌Y565-5。利用PCR方法从该菌株中克隆得到一个木糖异构酶基因,xylA。该基因开放阅读框长1182 bp,编码394个氨基酸,XylA氨基酸序列与Geobacillus sp.Y412MC52相似性达到99%。将xylA基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,得到重组质粒pET-28a(+)-xylA,然后将此重组质粒转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE电泳检测出明显的45 kD(相对分子质量)特异性蛋白质条带,并且通过半胱氨酸咔唑法检测出表达产物具有木糖异构酶的活性。对其酶学性质的研究发现,XylA最适温度为90°C,最适pH值为8.0。     

利用重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶

将来源于软化类芽孢杆菌（Paenibacillus macerans）的α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-CGT）基因插入含pelB信号肽的质粒pET-20b（＋）中,构建了表达载体pET-20b（＋）／cgt,并将其转化表达宿主E.coli BL21（DE3）。对重组菌E．coli BL21／pET-cgt进行摇瓶发酵条件的优化,确定了其胞外表达α-CGT酶的最适条件：葡萄糖8g/L,乳糖0．5g/L,蛋白胨12g/L,酵母膏24g/L,K2HPO472mmol／L,KH2PO417mmol／L,CaCl2 2．5mmol／L;初始pH为7．0,诱导温度为25℃。在该条件下培养90h后最终α-CGT酶的胞外比活达到22．1u／mL,与来源菌Pmacerans所产天然酶比活相比提高了42倍,实现了α-CGT酶的高效生产。将基因工程菌在上述条件下于3L发酵罐中发酵,90h后胞外酶比活达到22．6U／mL,证实了工业化放大的可能性。     

人分泌磷蛋白2基因的克隆、原核表达与活性检测

提取人肝癌组织RNA,通过RT-PCR扩增人SPP2成熟蛋白编码区基因并克隆至原核表达载体pET-22b（＋）,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL2l（DE3）,IPTG诱导重组蛋白表达,用Ni-NTA柱进行纯化,SDS-PAGE电泳及Western blot检测并证实目的蛋白的表达,通过重组蛋白对木瓜蛋白酶的抑制作用验证其生物学活性。重组质粒测序和酶切结果显示SPP2成熟蛋白基因已成功克隆到pET-22b（＋）。IPTG诱导重组菌后有25kDa大小的目的蛋白表达。优化诱导表达条件,获得可溶性表达的目的蛋白,纯化后纯度达90%,western blot表明其具有His标签抗原活性。重组SPP2成熟蛋白可抑制木瓜蛋白酶的水解作用（酪蛋白为底物）,重量抑制比为1∶3.1,抑制比活性为2511U/mg。     

分散泛菌蔗糖异构酶在大肠杆菌中的表达及发酵优化

为了提高分散泛菌Pantoea dispersa UQ68J来源的蔗糖异构酶产量,研究了不同信号肽及发酵条件对蔗糖异构酶在大肠杆菌中重组表达的影响。将携带天然信号肽的蔗糖异构酶基因优化后,转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)构建重组表达菌株——ORI菌株,摇瓶发酵总酶活和胞外酶活分别为85 U/m L、65 U/m L。从天然信号肽开始第22位氨基酸作为成熟蛋白的起始,连接Pel B或Omp A信号肽构建P22和O22菌株,其中P22菌株发酵总酶活提高至138 U/m L,是ORI菌株总酶活的1.6倍;而O22菌株发酵总酶活和ORI菌株无明显差别。采用3.0 g/L的乳糖诱导,P22菌株的蔗糖异构酶总酶活提高至168 U/m L。在3 L发酵罐中,研究甘氨酸浓度和诱导时间对蔗糖异构酶分泌的影响,当补加0.5%甘氨酸,DCW为18 g/L(OD_(600)=30)开始诱导,P22菌株的蔗糖异构酶胞外酶活最高达1 981 U/m L,同时蔗糖异构酶总酶活达到2 640 U/m L,是已报道大肠杆菌重组表达蔗糖异构酶的最高水平。     

Novel method for expression and purification of human pigment epithelium-derived factor with biological activities in Escherichia coli

We developed a novel method for the expression and purification of recombinant human PEDF in Escherchia coli, and proved it to be simple, convenient, and cheap to obtain this protein with biological activity intact. Human PEDF gene, amplified by PCR from human retinal cNDA library, was cloned into the prokaryotic expression vector pET-22b(+). The recombinant pET-22b(+)/PEDF was expressed in E. coli strain BL21(DE3). The recombinant protein showed a molecular weight of about 50 kDa and was mainly in the form of inclusion bodies according to SDS-PAGE and Western blot analysis. The insoluble rPEDF was solublized from inclusion bodies by denaturation using 6 M urea, purified by His-tag affinity chromatography, and renatured to natural structure by dialysis in the presence of DTT. The rPEDF could cell-type-specifically inhibit HRCEC proliferation in a dose-dependent manner and induce HRCEC apoptosis.     

蜡样芽胞杆菌M22铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及表达

采用PCR技术 ,从蜡样芽胞杆菌M2 2基因组DNA扩增到长 132 0bp的基因片段 .该片段含编码 179个氨基酸残基的开放阅读框 ,推定蛋白序列与报道的BacillusanthracisCu ,Zn SOD序列有96 %同源性 ,其中N端 16个氨基酸残基推定为信号肽序列 .将Cu ,Zn SOD编码区插入载体pET 2 2b(+ )构建表达载体pET 2 2b sodC ,转化E .coliBL2 1(DE3) ,IPTG诱导融合蛋白表达 .SDS PAGE显示 ,融合蛋白表观分子质量约 2 4kD ,占菌体裂解液中总蛋白的 2 1 3% .将此表达载体转入SOD缺陷型大肠杆菌PN132 ,赋予了该菌株对paraquat的抗性 .NBT光抑制法测定SOD活性显示 ,与PN132无SOD活性相比 ,重组子在IPTG诱导前SOD活性极低 (1 79U/mg) ,诱导后活性高达 6 9 76U/mg .非变性电泳结果显示 ,该酶活性不同程度地受到 5mmol LH2 O2 和 5mmol LKCN的抑制     

Immobilization of a recombinant strain producing glucose isomerase on SiO2-xerogel and properties of prepared biocatalysts

An original method of immobilization of nongrowing microorganism cells on xerogel of silicon dioxide containing insoluble hydroxyl compounds of cobalt(III) has been developed. A recombinant strain producing glucose isomerase has been constructed on the basis of Escherichia coli with the use of a gene of Arthrobacter nicotianae. It was revealed that glucose isomerase activity and stability of biocatalysts prepared on the basis of the recombinant E. coli strain was 3-5 times greater compared with the biocatalysts prepared with the use of the donor strain A. nicotianae. Under conditions of continuous hydrolysis of 3 M fructose at 62-65 degrees C in a fixed bed reactor, time of half-inactivation of the biocatalysts prepared from the recombinant strain and A. nicotianae was -60 and -25 days, respectively.     

磷脂酰丝氨酸合成酶基因pss的克隆与表达

磷脂酰丝氨酸合成酶能催化转酯反应,是定向合成特定磷脂类物质特别是磷脂酰丝氨酸的工具酶,但出发菌株产量低,很大程度上限制了酶法合成磷脂酰丝氨酸的工业化应用。利用表达载体pET-22b,实现了大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的同源高效表达。利用镍亲和柱对表达产物进行纯化,并用HPLC法对纯化后的重组酶的活力进行检测。结果表明,目的蛋白可在短时间内进行大量表达,蛋白含量是出发菌株的100倍,同时经6h的转酯反应转化率达到33%,重组磷脂酰丝氨酸合成酶活力达到69U/mg蛋白。     

Expression of Bombyx mori 30Kc19 protein in Escherichia coli and its anti-apoptotic effect in Sf9 cell

The silkworm hemolymph has an anti-apoptotic activity in insect, mammalian, and human cell systems. The protein from silkworm hemolymph with the highest apoptosis inhibiting activity was found to be 30Kc19 protein, which was one of the ‘30K proteins’. In this study, 30Kc19 protein encoded by the 30Kc19 gene of the silkworm was expressed in Escherichia coli with (pET-22b(+)) and without (pET-3a) pelB leader sequence. 30Kc19 protein was over-expressed largely as a soluble form by pET-3a and both as soluble and insoluble forms by pET-22b(+). The medium was supplemented with each of the recombinant 30Kc19 proteins, and their presence was found to inhibit nuclear fragmentation and apoptotic body formation in actinomycin D-induced Sf9 cell apoptosis. Moreover, 30Kc19 protein repressed the activation of Sf-caspase-1. The 30Kc19 protein obtained from periplasm showed the most effective anti-apoptotic activity. This protein holds great potential for industrial and pharmaceutical applications since mass production and easy purification of this protein is possible.     

用E．coli表达Canstatin—N及其表达条件优化

以重组质粒DET—CN为模板设计引物CASN1N和CASN2,PCR方法扩增约267bp的人血管能抑素N端1～89氨基酸基因片段,用EcoRI和Sal I双酶切将其克隆进pET-22b（＋）载体获得重组表达质粒pET-22b（＋）一CN,转化E．coliBL21（DE3）,用IPTG诱导表达Canstatin-N,产物以包涵体形式存在。本文在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导培养时间对目标蛋白表达的影响,结果表明IPTG的最佳诱导浓度为0．1mmol／L;37℃下诱导培养2h时产物表达量最高。纯化获得的融合hiS6的重组Canstatin—N具有免疫和抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成活性。