应用一步PCR法检测并鉴定马疱疹病毒1型和4型

聚合酶链反应（PCR）可作为一种快速检测并鉴别马疱疹病毒1型（EHV－1）和马疱疹病毒4型（EHV－4）的诊断方法。PCR引物是根据编码EHV－1和EHV－4的糖蛋白B（ gB)基因上的共有的核苷酸序列或型特有的核苷酸序列设计的。利用这两种病毒的型特异性混合引物,在一步PCR反应中检测并鉴别EHV－1和EHV－4,而同一疱疹病毒科的单纯疱疹病毒1型（HSV－1）、伪狂犬病毒（PRV）、马立克氏病病毒（MDV）均无特异性扩增。应用建立的PCR方法检测了普氏野马流产胎儿病科,实验结果表明,这种PCR方法是一种直接检测并鉴定EHV－1和EHV－4的快速、敏感的诊断方法,同时,它可在一步PCR反应中直接鉴别这两种病毒,可用于病料中EHV－1和EHV－4检测的初步筛选。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建马立克病病毒超强毒株原癌基因meq缺失株及其鉴定

近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术正迅速应用于大基因组DNA病毒的编辑,尤其是一些致瘤性疱疹病毒。马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)属于甲亚科疱疹病毒,血清I型MDV(MDV-1)感染自然宿主可诱导快速发作的T细胞淋巴瘤。meq基因是MDV-1致瘤的主要原癌基因,在马立克病(Marek’s disease,MD)肿瘤发生中具有重要作用。本文以超强毒MDV(very virulent MDV,vvMDV)国际代表株Md5和我国分离株GX0101为研究对象,设计合成了多组meq基因特异性gRNA,利用CRISPR/Cas9系统成功构建了两个meq基因缺失的毒株Md5△meq-C45和GX0101△meq-C56,并对病毒基因组相关区域进行PCR扩增和测序。结果证实,meq基因被完全编辑并敲除。间接免疫荧光实验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)显示,MEQ蛋白在两个meq基因编辑毒株感染的CEF细胞中均无表达,并且meq基因缺失经连续15次传代仍保持稳定。通过荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)对病毒增殖曲线进行测定,证实meq基因编辑不影响病毒的体外复制。本研究建立了CRISPR/Cas9系统快速编辑MDV-1病毒基因的技术方法,获得了稳定的meq基因缺失毒株,为后续MDV-1的致病及致瘤机制研究、MEQ单抗筛选鉴定及诊断试剂研发等奠定了重要基础。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建马立克病病毒超强毒株原癌基因meq缺失株及其鉴定

近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术正迅速应用于大基因组DNA病毒的编辑,尤其是一些致瘤性疱疹病毒。马立克病病毒（Marek’s disease virus,MDV）属于甲亚科疱疹病毒,血清Ⅰ型MDV（MDV-1）感染自然宿主可诱导快速发作的T细胞淋巴瘤。meq基因是MDV-1致瘤的主要原癌基因,在马立克病（Marek’s disease,MD）肿瘤发生中具有重要作用。本文以超强毒MDV（very virulent MDV,vvMDV）国际代表株Md5和我国分离株GX0101为研究对象,设计合成了多组meq基因特异性gRNA,利用CRISPR/Cas9系统成功构建了两个meq基因缺失的毒株Md5△meq-C45和GX0101△meq-C56,并对病毒基因组相关区域进行PCR扩增和测序。结果证实,meq基因被完全编辑并敲除。间接免疫荧光实验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）显示,MEQ蛋白在两个meq基因编辑毒株感染的CEF细胞中均无表达,并且meq基因缺失经连续15次传代仍保持稳定。通过荧光定量PCR（quantitative PCR,qPCR）对病毒增殖曲线进行测定,证实meq基因编辑不影响病毒的体外复制。本研究建立了CRISPR/Cas9系统快速编辑MDV-1病毒基因的技术方法,获得了稳定的meq基因缺失毒株,为后续MDV-1的致病及致瘤机制研究、MEQ单抗筛选鉴定及诊断试剂研发等奠定了重要基础。     

疱疹病毒的微生态问题

疱疹病毒的分子生物学基础疱疹病毒科在医学领域中熟知已久,可分为三个亚科,α、β和γ。α亚科包括人和动物的疱疹病毒,如人的单纯疱疹病毒1型、2型(HSV—1,2),牛乳腺炎病毒,假狂犬病毒,马流产病毒等,其 DNA 分子量范围为87～105×10~6d。β亚科包括人和鼠的巨细胞病毒(HCMV,MCMV),其DNA 分子量为130～150×10~6d.γ亚科包括人的Epstein-Barr 病毒(EBV)和几种灵长类(猴)病毒,其 DNA 分子量为85～115×10~6d。最近发现的人 B 细胞白血病病毒(HBLV),称为人疱疹病毒—6型(HHV—6),亚科不明。     

表达LacZ基因的重组CVI988病毒的构建及特性研究

马立克氏病(MD)是一种鸡的淋巴增生性肿瘤疾病,是由马立克氏病病毒血清1型(Marek'sdisease virus serotype 1,MDV1)引起的,但是,可以由致弱的或天然不致病的疫苗株进行防制.疫苗株分为三种类型:致弱的血清1型,天然不致瘤的血清2型(MDV2)和天然不致病的火鸡疱疹病毒(HVT).     

表达LacZ基因的重组CVI988病毒的构建及特性研究

马立克氏病（MD）是一种鸡的淋巴增生性肿瘤疾病,是由马立克氏病病毒血清1型（Marek＇s disease virus serotype 1,MDV1）引起的,但是,可以由致弱的或天然不致病的疫苗株进行防制。疫苗株分为三种类型：致弱的血清1型,天然不致瘤的血清2型（MDV2）和天然不致病的火鸡疱疹病毒（HVT）。     

马动脉炎病毒核蛋白基因的克隆与表达

马病毒性动脉炎是危害世界养马业的重要传染病之一,是由动脉炎病毒科动脉炎病毒属的马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)引起的一种以病马发热,步态僵直,躯干及眼周围水肿,并出现粘液脓性鼻炎、结膜炎,外生殖道水肿为特征的传染病,对妊马能引起流产,使易感怀孕母马的流产率达90%以上[1, 8].     

马传染性贫血病毒弱毒疫苗株跨膜蛋白截短突变对其体外复制特性影响

马传染性贫血病毒(EIAV)减毒疫苗是世界首例慢病毒疫苗,但其作用机理尚不明了.研究发现,EIAV疫苗株EIAVFDDV12的跨膜蛋白gp45在马体内发生高频率261W位点翻译终止突变,使该蛋白质C端出现154个氨基酸的截短.为了探讨该截短对EIAV疫苗株生物学特性的作用,以EIAV弱毒疫苗株感染性克隆为骨干,构建了gp45截短型感染性病毒株,检测该截短突变对EIAV疫苗株在体外培养的马外周血单核细胞由来的巨噬细胞(MDM)、驴MDM和驴胎皮细胞(FDD)中的复制.实验结果表明,gp45截短型毒株在马和驴MDM中复制能力比未截短型毒株显著降低(P<0.01),特别是在马MDM中此差异更明显.相反,截短型毒株在FDD中的复制能力则显著高于未截短型毒株(P<0.01).此外,结果显示gp45截短型毒株在马MDM中的低水平复制降低了EIAV对其靶细胞诱导的凋亡.以上结果提示,EIAV疫苗的gp45截短型毒株是适应在体外FDD细胞中传代致弱的变异,该变异导致疫苗株在EIAV体内主要靶细胞巨噬细胞中复制能力的降低,导致毒力进一步减弱.     

马动脉炎病毒核蛋白基因的克隆与表达

马病毒性动脉炎是危害世界养马业的重要传染病之一,是由动脉炎病毒科动脉炎病毒属的马动脉炎病毒(Equinearteritisvirus,EAV)引起的一种以病马发热,步态僵直,躯干及眼周围水肿,并出现粘液脓性鼻炎、结膜炎,外生殖道水肿为特征的传染病,对妊马能引起流产,使易感怀孕母马的流产率     

鸡马立克氏病毒Ⅱ型无毒株Z_4的分离和鉴定

从扬州市郊区土种鸡中分离到一株血清Ⅱ型马立克氏病毒(MDV)Z4株,并进行了鉴定。初次分离时,Z4在鸡胚成纤维细胞(CEF)上生长缓慢,12天后产生以圆形大合胞体为特征的空斑形态。用Z4CEF培养物接种易感鸡,13周内不引起任何马立克氏病临床症状,也无大体的病理变化,显微镜检查仅部分鸡的坐骨神经出现炎性细胞浸润。保护性实验证明,接种Z4株的鸡可抵抗MDV强毒的致瘤作用,表明它是很有希望的疫苗候选毒株。 用型特异性单克隆抗体,对MDV强毒株京-1株、弱毒株K株,以及作者新分离的另外9个分离物进行了血清型鉴定。证实京-1株、K株和5个分离物为Ⅰ型病毒;2个为Ⅱ型病毒;另有2个分离物同时含有Ⅰ型和Ⅲ型病毒。本工作为进一步研究不同血清型MDV在我国鸡群中的流行和分布规律打下了基础。     

一株具有急性致瘤特性的马立克氏病病毒的分离与鉴定

应用鸭胚成纤维细胞(DEF)从免疫过CVI988/Rispens疫苗株患马立克氏病(MD)的三黄鸡中分离到一株马立克氏病病毒(MDV)(命名为YL040920株)。从该分离株蚀斑克隆获得的9个克隆在蚀斑形成时间及其形态大小上均无明显差别,表明它较为单一;应用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增并测定了毒株的致瘤相关基因meq的核苷酸序列,并与其他MDV-1参考毒株的序列进行比较分析,发现其序列具有MDV-1强毒株的特征;用基于抗MDV-1 MEQ蛋白的单克隆抗体3G12E6的免疫荧光试验(FA)对毒株的DEF培养物进行检测,发现有特异性的荧光定位于细胞核内;应用毒株感染霞烟鸡,最早在接种后(PI)21d即可诱发明显的内脏器官,在各器官肿瘤中以心脏、肝脏和皮肤的肿瘤发生率最高;用禽肿瘤病三重PCR鉴别诊断技术对毒株的DEF培养物以及感染鸡的内脏器官组织进行检测,均能扩增到MDV-1强毒株的特异性带,而网状内皮增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV)的检测则均为阴性。研究的结果表明,分离株YL040920为单一的MDV-1强毒株,无REV、ALV以及疫苗株CVI988/Rispens的混杂,并具有以心脏、肝脏和皮肤肿瘤为主的急性致瘤特性。     

乙型脑炎病毒NS2A-C60A位点突变对其生物学特性影响研究*

目的:旨在探索Ⅰ型日本乙型脑炎病毒传代致弱后基因组突变NS2A-C60A对乙脑病毒生物学特性的影响。方法:首先通过对传代致弱及原始乙脑毒株基因组序列进行测序比对、结构预测分析并利用Western blotting(WB)确定了目标研究位点NS2A-C60A;然后使用反向遗传定点突变技术构建拯救了包含NS2A-C60A单点突变的病毒株;最后利用噬斑形态观察、生长曲线、双萤光素酶分析,WB以及炎性因子检测和动物实验研究了该单点突变对于乙脑病毒生物学特性的影响。结果:首次研究发现Ⅰ型乙脑病毒传代致弱会导致NS1'蛋白表达的显著下降以及可能的相关位点NS2A-C60A,并成功拯救获得了NS2A-C60A单点突变毒株rJEV-C60A,研究发现NS2A-C60A突变对乙脑病毒的生长特性及噬斑形成没有显著影响,但是能够显著降低乙脑病毒NS1'蛋白的表达,并且该位点突变能够轻微阻碍乙脑病毒对细胞炎性因子表达的抑制,动物实验结果显示NS2A-C60A点突变病毒与原毒株具有相似的神经毒力,说明该位点突变不是影响乙脑病毒毒力致弱的关键位点。结论:新发现的NS2A-C60A位点突变能够显著减少乙脑病毒NS1'蛋白的表达,但是对其增殖、诱导炎症及神经毒力等生物学特性没有显著影响。     

乙型脑炎病毒NS2A-C60A位点突变对其生物学特性影响研究*

目的:旨在探索Ⅰ型日本乙型脑炎病毒传代致弱后基因组突变NS2A-C60A对乙脑病毒生物学特性的影响。方法:首先通过对传代致弱及原始乙脑毒株基因组序列进行测序比对、结构预测分析并利用Western blotting(WB)确定了目标研究位点NS2A-C60A;然后使用反向遗传定点突变技术构建拯救了包含NS2A-C60A单点突变的病毒株;最后利用噬斑形态观察、生长曲线、双萤光素酶分析,WB以及炎性因子检测和动物实验研究了该单点突变对于乙脑病毒生物学特性的影响。结果:首次研究发现Ⅰ型乙脑病毒传代致弱会导致NS1'蛋白表达的显著下降以及可能的相关位点NS2A-C60A,并成功拯救获得了NS2A-C60A单点突变毒株rJEV-C60A,研究发现NS2A-C60A突变对乙脑病毒的生长特性及噬斑形成没有显著影响,但是能够显著降低乙脑病毒NS1'蛋白的表达,并且该位点突变能够轻微阻碍乙脑病毒对细胞炎性因子表达的抑制,动物实验结果显示NS2A-C60A点突变病毒与原毒株具有相似的神经毒力,说明该位点突变不是影响乙脑病毒毒力致弱的关键位点。结论:新发现的NS2A-C60A位点突变能够显著减少乙脑病毒NS1'蛋白的表达,但是对其增殖、诱导炎症及神经毒力等生物学特性没有显著影响。     

人类疱疹病毒6型

<正>人类疱疹病毒6型(HHV-6)最先是从淋巴细胞增生性疾病患者中分离出来的一种新的疱疹病毒。其抗原性和遗传学特性与疱疹病毒1型,疱疹病毒2型,巨细胞病毒(CMV),水痘一带状疱疹病毒(VZV)及EBV均不相同。后来发现HHV-6是幼儿急疹(ES)的病原体。本文就HHV-6的血清流行病学,从ES患儿中的分离检测,与HHV— 6感染有关的疾病及其病毒学特性等综述如下。     

不同致病型马立克氏病病毒DNA聚合酶基因序列比较

为了分析马立克氏病病毒(MDV)致病型与其DNA聚合酶基因的关系,本研究比较了9个不同致病型的该基因的同源性关系,这包括四种不同致病型的国际参考株即弱毒疫苗株CV1988／Ripens株、强毒株GA、超剜毒株Md5和特超强毒株648A;中国疫苗株814、中国强毒参考株Jing-1及3个中国野毒株。结果表明：MDV的DNA聚合酶基因非常保守,在比较的9个毒株间,该基因上游约369个碱基的调控序列的同源性在96．7％～100％之间,该基因编码的1220个氨基酸序列的同源性在99．2％～100％之间。尽管不同毒株在一些位点上出现了氨基酸的变异,但这些变异与病毒的致病型或地域分布没有明显的关系。     

不同致病型马立克氏病病毒DNA聚合酶基因序列比较

为了分析马立克氏病病毒(MDV)致病型与其DNA聚合酶基因的关系,本研究比较了9个不同致病型的该基因的同源性关系,这包括四种不同致病型的国际参考株即弱毒疫苗株CVI988/Ripens株、强毒株GA、超强毒株Md5和特超强毒株648A;中国疫苗株814、中国强毒参考株.Jing-1及3个中国野毒株.结果表明MDV的DNA聚合酶基因非常保守,在比较的9个毒株间,该基因上游约369个碱基的调控序列的同源性在96.7%～100%之间,该基因编码的1220个氨基酸序列的同源性在99.2%～100%之间.尽管不同毒株在一些位点上出现了氨基酸的变异,但这些变异与病毒的致病型或地域分布没有明显的关系.     

一种快速精确编辑疱疹病毒基因组的方法

为了快速且准确地对疱疹病毒基因组进行基因敲除、插入或者点突变等修饰,通过同源重组将马立克氏病病毒 (MDV) 超强毒株Md5基因组克隆到细菌人工染色体 (BAC)。将筛选的阳性重组体DNA电转进DH10B菌株,用PCR及限制性片段多态分析 (RFLP) 方法鉴定含Md5全基因组的BAC克隆。将阳性重组体DNA转染入鸡胚成纤维细胞 (CEF),拯救出重组病毒,命名为Md5BAC。进一步利用Red酶介导的两步法基因重组技术构建MDVlorf10基因敲除毒株。为了验证被敲除基因功能的特异性,将lorf10插入原位点以构建基因复原毒株。将构建的重组毒株分别感染CEF细胞,用间接免疫荧光试验确认重组病毒均包装成功;病毒生长曲线结果表明,lorf10敲除不影响病毒的体外增殖。总之,这为其他疱疹病毒的基因组编辑提供了技术参考。     

马立克氏病病毒Rispens株B抗原基因的克隆及其重组鸡痘病毒的构建

马立克氏病病毒（Ｍａｒｅｋ’ｓＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ,ＭＤＶ）是马立克氏病（ＭＤ）的病原,是第一个能用实验证明具有致肿瘤作用的疱疹病毒,也是研究病毒性肿瘤特别是疱疹病毒肿瘤的理想的实验模型。ＭＤ还是第一个广泛使用疫苗预防的肿瘤性病毒病。应用免疫扩散...     

致蛋鸡血管瘤J亚群禽白血病病毒cDNA全序列分析

【目的】了解近年来我国商品蛋鸡群中以血管瘤为主要表型的J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus subgroup J,ALV-J)的分子生物学特性,为控制ALV-J在鸡群中流行提供基础资料。【方法】采用PCR扩增和序列分析技术,对分离自血管瘤或者血管瘤与髓样细胞瘤(Myeloid Leukosis,ML)并存的3株蛋鸡ALV-J毒株前病毒DNA的全序列及3株商品蛋鸡血管瘤型分离毒和1株商品蛋鸡ML型分离毒的致瘤关键性序列进行研究。【结果】来自血管瘤或者血管瘤与ML并存的商品蛋鸡分离毒株与来自肉鸡分离毒株的全序列差异明显,在遗传进化树上分属两个大的分支;研究发现商品蛋鸡血管瘤及ML混合病例分离毒JS09GY3与JS09GY6株的引物结合位点(Primer Binding Site,PBS)-Leader中出现极为罕见的连续19bp的插入突变,其与劳斯相关病毒1(Rous Associated Virustype1,RAV-1)、劳斯相关病毒2(Rous Associated Virustype2,RAV-2)及劳斯肉瘤病毒施密特-鲁宾二氏[Rous sarcoma virus(strain Schmidt-RuppinB),RSV-SRB]毒株序列相同;通过对U3区调控元件的分析,发现血管瘤商品蛋鸡病例分离毒NHH与JS09GY5的U3区各发生1处连续序列缺失,出现了极为独特的c-Est-1、TCF11及C/EBP结合位点,这些调控元件可能与病毒的致肿瘤特性相关;所测的5株血管瘤商品蛋鸡分离毒均保留完整E元件,而所有肉鸡分离毒的E元件均发生了几乎相同的大部分序列缺失;首次发现血管瘤商品蛋鸡分离毒JS09GY3的E元件中有11bp的连续插入序列。【结论】商品蛋鸡血管瘤型ALV-J与肉鸡分离毒在全序列上差异明显,U3、DR1和E元件等区域有一部分特殊的突变与毒株的宿主类型和肿瘤表型有一定关系,其功能尚需进一步研究。而血管瘤型、髓细胞瘤型ALV-J可能是ALV-J与其它反转录病毒的重组毒。     

2006年广州登革热病原体的分离鉴定及其生物学性质的观察

目的：对2006年广州流行登革热病原进行分离鉴定及生物学性质研究。方法：采用传代蚊细胞微量培养方法对2006年广州登革热病原进行分离,并通过脑内途径观察其对乳鼠的致病性;经间接免疫荧光和RT-PCR技术,对患者血清标本中的病毒特异抗体及新分离的病原体进行检测和鉴定;将此次分离的病原体与1980年分离的同型毒株进行生物学性质比较。结果：从57份患者血清标本中分离出10株病毒,在传代蚊细胞中可产生稳定的细胞病变并对乳鼠致病;其基因组为登革1型病毒特异的RNA分子,经鉴定为登革1型病毒;此次分离的登革1型病毒与1980年分离的同型毒株在致细胞产生病变的时间和严重程度,蚀斑的大小、形态以及致乳鼠发病的时间等生物学性质上有所不同。结论：2006年广州流行登革热病原为登革1型病毒,且与1980年分离的同型毒株在生物学性质方面存在明显差异。