IL-1β对体外培养NIT-1β细胞胰岛素分泌的影响

利用小鼠胰岛β细胞系NIT 1细胞,对不同时间、不同浓度IL 1β作用下细胞的生长和胰岛素的分泌进行观察,以研究IL 1β对胰岛β细胞胰岛素分泌的影响,探讨细胞因子对胰岛β细胞功能的抑制作用.结果显示在IL 1β作用下,各组NIT 1细胞分泌胰岛素呈不同程度降低,表明IL 1β对NIT 1β细胞系胰岛素的分泌具有显著抑制作用.     

实验室培养较好的胰岛β-细胞可治疗糖尿病

科学家已找到了一种方法来大量制造胰岛β-细胞,并成功地将此β-细胞移植到Ⅰ型糖尿病患者体中.但是,从供体收集来的这种β-细胞只能少量供应于1%需要移植的患者.建立实验生长的β-细胞系,可克服这种供应不足的缺点.在Ⅰ型糖尿病中,免疫细胞杀灭了β-细胞,从而断绝了体内胰岛素的来源.没有胰岛素,体内组织便不能加工糖类,故而Ⅰ型糖尿病患者依赖胰岛素注射.在2005年10月份的Nature Biotechnology上,研究者报道了一种制造β-细胞的技术,它基本上解决了移植用β-细胞供应短缺的问题.该技术的核心是研究者称之为人β-细胞“可逆性无限增殖化”“reversibly immortalized”细胞系技术.首先,研究者从人尸体收集来的胰脏中抽取β-细胞.由于这些β-细胞在体外趋向于迅速死亡,于是研究者便利用其能保持永久复制能力的基因来做实验.含有这种基因的细胞导致一种危险性,即该细胞可能长出肿瘤来.为了对抗这种危险性,研究者建立了一种关闭这种复制的机制.研究者参入了一种分子标志,可引导一种DNA切割酶到达所增加的基因处.该酶的切割定时发生在制造β-细胞后,而在细胞移植前.下一步,研究者从他们建立的β-细胞系中筛选出271个β-细胞系,再从中找出最适合移植的β-细胞系.他们切除了制造肿瘤的β-细胞系,而不管切除的是否是保持永久复制能力的基因;此外,他们切除了不制造胰岛素的β-细胞或其他β-细胞蛋白质的细胞素.最终,只有1个细胞系通过这两个试验.研究者利用筛选出来的β-细胞系,培养出足够的细胞,引入10个缺乏免疫活性的糖尿病小鼠,每个小鼠引入3百万个细胞.研究者报道,这些小鼠保持正常的血糖浓度达30星期之久.实验室里生长的β 细胞制造的胰岛素仅为正常人体β-细胞制造的40%.于是,人移植所需的β-细胞要多于10亿个细胞.这个巨大的数量明确要求大规模的细胞生长,为此大规模地培养细胞,难免引起发生肿瘤的突变.研究者现在的目标是大量生产可逆性无限增殖化细胞,其安全性与疗效能通过FDA美国食品与药物管理局批准而用于临床.研究者指出,他们所制造的β-细胞在移植于人时,仍有受到免疫攻击的危险性.研究者的目的是最终开发出能抵抗免疫攻击的β-细胞系. (李潇摘译自K.Greene:Science News,October 1,2005,Vol.168,p.212)     

胰岛特异细胞因子PANDER在糖尿病病理生理过程中的作用

胰腺衍生因子(PANcreatic DERived factor,PANDER)是新近克隆的细胞因子,在胰腺的胰岛β细胞中特异性高表达.重组PANDER蛋白预处理或腺病毒过表达PANDER基因均可在体外显著地诱导人、大鼠及小鼠胰岛β细胞及多种β细胞系凋亡, 并抑制其胰岛素分泌.同时,炎症细胞因子IFN-γ能显著地上调β细胞PANDER基因的表达,提示PANDER有可能在炎症细胞因子介导的1型糖尿病病理生理过程中起作用.PANDER蛋白与胰岛素通过Ca2 依赖的方式从β细胞中共分泌进入循环系统,特异性地结合到肝细胞膜上并抑制肝细胞胰岛素信号转导,这提示PANDER可能也介入了机体胰岛素抵抗的形成.本文结合笔者多年从事PANDER的生理学功能研究,对PANDER的发现、最新研究进展及其潜在的生理学功能进行总结与分析.     

TAT-MafA融合蛋白诱导小肠细胞系IEC-6表达胰岛素

借助蛋白质转导技术,利用胰岛β细胞转录因子MafA诱导小肠细胞系IEC-6表达胰岛素,为糖尿病的治疗提供新的方法。将TAT基因与MafA基因一起插入p32a（＋）载体中,构建TAT—MafA融合蛋白原核表达载体,转化BL21获得表达菌株,经IPTG诱导和Ni柱亲和层析纯化TAT-MafA融合蛋白,用1μM浓度的该融合蛋白孵育IEC-6细胞12h和24h后,分别进行进胞检测和胰岛素表迭检测。实验结果表明,细胞免疫荧光和Western-blot方法检测到经TAT—MafA融合蛋白作用12h后的IEC-6细胞中有该蛋白,并经细胞免疫荧光和RT—PCR的方法检测出TAT—MafA作用24h后的IEC-6细胞中有胰岛素的表达。因此,TAT—MafA融合蛋白可以高效进入小肠细胞系IEC-6细胞,并且进胞后仍保持MafA原有的生物学活性,能启动胰岛素基因的表达,诱导IEC-6成为胰岛素表达细胞。     

稳定表达牛催乳素基因的小鼠乳腺上皮细胞系的建立

在乳腺上皮细胞体外培养时,为了使其状态接近泌乳期,需要在培养基中添加催乳素.由于催乳素价格昂贵,使得乳腺上皮细胞的体外培养成本颇高.建立在体外培养过程中不需要添加催乳素蛋白的乳腺上皮细胞系,能为在细胞水平研究乳腺细胞相关基因提供诸多方便.利用慢病毒载体的整合特性,建立稳定整合了牛催乳素cDNA(bPRL)表达盒的小鼠乳腺上皮细胞系(HC11细胞系).经10代次以上的传代以后,通过定量PCR检测,证明平均每个细胞中含有2.6个外源的bPRL基因,其表达量为HC11细胞中管家基因β-肌动蛋白(β-actin)表达量的14%左右.另外,先前的研究结果表明催乳素能在HC11和泌乳期的小鼠乳腺上皮组织中有效促进山羊β-酪蛋白启动子启动外源基因的表达.之后的实验证实整合了催乳素基因的HC11细胞(bPRL-HC11细胞系)也有此功能.因此,bPRL-HC11细胞系可以为体外研究乳腺生物反应器提供良好的细胞模型.     

PGRN和Rev-erbβ双基因敲除HEK 293细胞系的构建及应用

为研究PGRN与Rev-erbβ相互作用可能存在的分子机理及其生理意义,在前期构建的Rev-erbβ基因敲除HEK293 C3-6细胞系的基础上,利用CRISPR/Cas9技术构建PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293细胞系。首先,针对PGRN基因设计了4个不同的sgRNA,经筛选将活性较高的PGRN sgRNA 2和sgRNA 3串联,构建携带双PGRN sgRNA和Cas9的慢病毒打靶载体pLenti/CMV-Loxp-Cas9-sgRNA2-U6-sgRNA3-U6-Loxp-EF1α-Puro。再将包装的携带Cas9和双PGRN sgRNA的慢病毒感染HEK293(Rev-erbβ~(-/-))细胞,通过筛选、克隆化及测序分析获得双基因敲除的HEK293 C3-6/23(Rev-erbβ~(-/-);PGRN~(-/-))单克隆细胞系,并用qRT-PCR和Western blotting检测HEK293(C3-6/23)细胞中PGRN mRNA和蛋白质的表达。最后,在双基因敲除HEK293(C3-6/23)细胞系中,通过回补基因方式研究PGRN介导Rev-erbβ对靶基因启动子转录活性调控研究。在PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293(C3-6/23)细胞系中,PGRN基因的两条DNA链均为缺失突变型,PGRN mRNA和蛋白质的表达均未达到检测水平。同时在HEK293(C3-6/23)细胞系中研究发现PGRN与Rev-erbβ相互作用,可以增强Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控。利用CRISPR/Cas9系统,成功构建了双基因敲除的HEK293(Rev-erbβ~(-/-);PGRN~(-/-))C3-6/23单克隆细胞系。利用该敲除细胞系研究发现PGRN可以影响Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控,但PGRN参与介导Rev-erbβ转录调控的机制还有待进一步研究。     

基因工程胰岛素分泌细胞的研究

在体外构建胰岛素分泌细胞系作为糖尿病患者的胰岛细胞的代用品是国外进行糖尿病基因治疗的主要内容。１．β细胞系工程β细胞是人胰腺郎格罕氏细胞,早已被用来治疗糖尿病［１］,但是用胰腺移植治疗糖尿病有免疫排斥、供体有限以及必须纯化胰腺等困难。β细胞工程则可避...     

sGLP-1对Ⅱ型糖尿病大鼠治疗效果的研究

目的 研究人工合成胰高血糖素样截短肽(sGLP-1)对Ⅱ型糖尿病大鼠的治疗效果.方法 Ⅱ型糖尿病GK大鼠随机分为三组,以合成的GLP-1为阳性对照,观察sGLP-1对Ⅱ型糖尿病GK大鼠血糖水平、胰岛素分泌以及糖耐量的影响,通过MTT法测定sGLP-1对胰岛β细胞系β-TC3增殖作用.结果 与GLP-1相比sGLP-1能够长效控制的血糖水平,明显改善糖尿病大鼠的糖耐量(P<0.01).同时sGLP-1能促进胰岛素分泌和胰岛β-TC3细胞的增殖,使得胰岛体积增大,数量增多.结论 sGLP-1控制血糖的长效能力优于GLP-1,可能从刺激胰岛素分泌和促进胰岛β细胞增殖两个方面对Ⅱ型糖尿病具有治疗作用.     

慢病毒介导SRB-1 受体基因沉默对人脑小胶质细胞吞噬Aβ蛋白能力的影响

目的:利用慢病毒载体筛选人脑小胶质细胞(HM1900)清道夫受体SRB1基因敲减稳定细胞系,检测该细胞系对AD致病蛋白Aβ的吞噬水平变化。方法:采用反转录PCR确认人脑小胶质细胞(HM1900)SRB1(Gene ID:949)基因表达情况,利用软件设计三组不同序列的针对人SRB1基因的慢病毒sh RNA干扰载体,包装为慢病毒感染HM1900细胞,实时荧光定量PCR检测各慢病毒干扰载体的靶基因干扰效率。选用干扰效果最佳的RNA干扰慢病毒筛选并获得SRB1基因敲减细胞系,稳定传代后用realtime-PCR检测SRB1受体表达下调情况。通过蛋白内吞实验测定基因敲减后该细胞系对病理蛋白Aβ的吞噬能力,与正常小胶质细胞进行比较。结果:利用筛选出的干扰载体完成对HM1900细胞系的SRB1基因敲减,荧光定量PCR检测显示SRB1基因在靶细胞HM1900中表达抑制率达83.7%。蛋白内吞实验显示该基因敲减细胞系对病理蛋白Aβ的吞噬能力下降到对照组的57%(P0.05)。结论:通过慢病毒载体成功建立SRB1基因稳定敲减的人脑小胶质细胞系,SRB1受体参与了小胶质细胞对病理蛋白Aβ的吞噬及清除过程。     

利用CRISPR/Cas9系统构建ITGαV及ITGβ3敲除细胞系

本试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得整合素αV(Integrin αV,ITGαV)及整合素β3(Integrin β3,ITGβ3)基因敲除的猪睾丸(Swine testicle,ST)细胞系,进而在细胞水平上研究ITGαV及ITGβ3在猪δ冠状病毒(Porcine deltacorovirus,PDCoV)入侵过程中的作用及相互作用机制。根据GenBank上猪的ITGαV及ITGβ3基因序列分别设计三对引导RNA(sgRNA),并整合到LentiCRISPR‐V2载体上,与辅助质粒pSPA×2及pMD2.G共转染293 T细胞进行慢病毒包装,包装完成后感染ST细胞并用嘌呤霉素进行压力筛选。用T7酶进行酶切检测,选出编辑效率较高的细胞群体,进一步用有限稀释法筛选出单克隆敲除细胞系。对分离出的ST‐ITGαV^KO(敲除ITGαV基因的ST细胞)及ST‐ITGβ3^KO(敲除ITGβ3基因的ST细胞)的单克隆细胞系进行测序和Western Blotting鉴定,结果显示ITGαV与ITGβ3均被成功敲除。采用敲除细胞系进行PDCoV感染试...     

Recent advances in the study of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and pathogenesis

It has now been over twenty years since a novel herpesviral genome was identified in Kaposi's sarcoma biopsies. Since then, the cumulative research effort by molecular biologists, virologists, clinicians, and epidemiologists alike has led to the extensive characterization of this tumor virus, Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus(KSHV; also known as human herpesvirus 8(HHV-8)), and its associated diseases. Here we review the current knowledge of KSHV biology and pathogenesis, with a particular emphasis on new and exciting advances in the field of epigenetics. We also discuss the development and practicality of various cell culture and animal model systems to study KSHV replication and pathogenesis.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.