利用IABS模型筛选L－异亮氨酸高产菌株

IABS模型是本研究中确立的理性化菌种选育方法,可用于高效率地筛选多种调控变株。大大减少摇瓶筛选工作量。利用IABS模型以L－异亮氨酸产生菌Brevibacterium flavumAslll为出发菌株,有目的地活化PC、HD和AHAS等酶,筛得变株23—10(α—AB rrt+Suc g+Eth rr),23—10在优化的培养条件下可产生20mg／ml以上的L-异亮氨酸,且无L-亮氨酸积累。23—10变株25代后,产酸能力毫不下降。     

L-异亮氨酸产生菌XQ-4在连续培养中的动力学特性

以黄色短杆菌（Brevibacterium flavum)ATCC14067诱变选育获得的L-异亮氨酸高产菌XQ－4（AHV^rSuc^gSG^rEth^rα-AB^rIleHx^r）在连续培养中进行动力学特性研究,以葡萄糖为限制性底物时,XQ－4菌株的生长符合Monod方程,其最大比生长速率μmax=0.265h^-1,饱和常数Ka=0.789g/L.XQ-4菌株L-异亮氨酸发酵时菌体最大实际转化率Yx=0.499g/g,产物最大实际转化率Yp=0.379g/g。     

L-异亮氨酸高产菌选育及其培养基优化

旨在诱变选育L-异亮氨酸高产菌,并探索突变株最佳发酵条件。利用传统化学诱变结合常压室温等离子体生物诱变体系对实验室保藏的Brevibacterium flavum I-12进行逐级诱变,选育2-噻唑丙氨酸(2-TA)和磺胺胍(SG)高抗性和在琥珀酸平板上能快速生长的突变菌株。随后,在单因素实验的基础上,利用响应面设计优化出目的突变株摇瓶发酵培养基组分的最佳参数水平。结果显示,经过一系列诱变和筛选,成功选育出一株在40 g/L的2-TA和5 g/L的SG,且以琥珀酸为唯一碳源的培养基上快速生长突变株,命名为B. flavum TA-6,该菌株产酸达26.2±0.5 g/L,比出发菌株提高了44.75%,而副产物L-缬氨酸和L-亮氨酸积累量明显降低。经响应面法优化发酵条件后,突变株产酸可达27.8±0.5 g/L,比优化前提高了6.1%。通过传统化学诱变结合ARTP生物诱变体系,成功选育出一株杂酸降低的L-异亮氨酸高产菌TA-6,该菌株具有潜在生产应用价值。     

产L-异亮氨酸新菌株选育及其发酵产物提纯和鉴定

以谷氨酸产生菌Corynebactelium SP·Hu7251为出发菌株,经NTG多次诱变,获得一株多标记突变株Am142—302(AHV~r,AHC~r、2-TA~r、Mef~-),可产9.6mg/mlL异亮氨酸。复将Am142-302经紫外线诱变和单菌落分离筛选,选得突变株Am1423—56。该菌在比较合适的摇瓶发酵条件下,可积累L-异亮氨酸达15.1mg/ml。发酵产物经提纯鉴定,确证是L-异亮氨酸。     

α-核突触蛋白基因突变小鼠脑组织中内源性代谢产物的变化

目的:明确α-核突触蛋白与帕金森病的病理生理相关性及其临床意义。方法:采用相色谱-质谱联用(UPLC-MS)检测野生型小鼠和基因突变型小鼠脑组织中内源性代谢性产物,通过mzcloud法对小鼠脑组织中内源性代谢物质进行鉴定,将相应数据进行主成分分析(PCA)和聚类分析,分析其相关差异表达代谢物,并构建通路图和互作网络图。结果:(1)基于LC/MS法的代谢组分析结果显示两组间差异代谢物以氨基酸类及磷脂类等为主,包括β-丙氨酰-L-组氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-天门冬氨酸、L-丙氨酸、磷脂酰胆碱等;(2)构建的代谢通路主要涉及酮体的合成和降解、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、组氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、甘油磷脂代谢等,从中发现18个具有标志性的代谢成分。结论:α-核突触蛋白基因突变后,酮体的合成和降解、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、组氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、甘油磷脂代谢等代谢通路发生了变化,涉及β-丙氨酰-L-组氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-天门冬氨酸、L-丙氨酸、磷脂酰胆碱等的生物学标志性代谢产物变化。     

运用重组细菌生产L-异亮氨酸

用遗传工程细菌进行好气发酵,生产出了L-异亮氨酸,比传统用的人工诱变法获得的突变株的产率高。本专利提供的方法,是把含有短杆菌(Breoibacterium)或棒状杆菌(Corynebacterium)L-异亮氨酸产生菌染色体DNA的重组质粒,插     

合成阿斯巴甜菌种的筛选

为了探索酶法合成阿斯巴甜的新思路和新方法,从富含蛋白的土样中筛选出能够分解二肽阿斯巴甜的菌种。利用其可逆性的特点,以L-天门冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯为主要合成原料,以菌体酶作为催化剂进行合成实验。经高效液相色谱检测,结果表明筛选到一株菌(ASPD1)能够合成阿斯巴甜;通过单因素实验法探讨了反应时间、温度、pH值等诸因素对产物形成的影响。     

产生L-异亮氨酸的黄色短杆菌的代谢途径分析

目的:代谢工程要解决的主要问题是改变某些途径中的碳架物质流量或改变碳架物质流在不同途径中的流量分布,其目标就是修饰初级代谢,将碳架物质流导入目的产物的载流途径,以获得产物的最大转化率。方法:利用途径分析方法对黄色短杆菌生产L-异亮氨酸的途径进行了分析。结果:建立了9种基础模型,确定L-异亮氨酸理论最高摩尔产率是1;确定了黄色短杆菌生产L-异亮氨酸的最佳途径的通量分布,并以此为依据进行发酵溶氧控制优化,溶氧分阶段控制发酵生产L-异亮氨酸比溶氧恒定控制方式发酵的产率提高了8.2%。结论:根据途径分析结果,通过改变发酵过程有关参数,可使目的产物产率得到提高。     

四种氨基酸原料细菌内毒素检查法的研究

依据中国药典2000年版“细菌内毒素检查法”,通过鲎试剂的干扰试验,研究注射用氨基酸原料中细菌内毒素检查法的可行性。结果在2~16倍稀释级下,L-缬氨酸(c=2.5%)和L-异亮氨酸(c=2.5%)对鲎试剂无干扰,检测细菌内毒素的鲎试剂灵敏度≤5.0×102EU.L-1,而在16倍稀释级范围内,L-脯氨酸(c=4.5%)和L-亮氨酸(c=2.0%)对鲎试剂检查法有抑制作用。结论为注射用L-异亮氨酸和L-缬氨酸用灵敏度为5.0×102EU.L-1的鲎试剂检查其细菌内毒素方法可行,可以代替家兔法检查热原。     

木糖醇大规模发酵生产策略

<正>发酵工艺是木糖醇生产的发展方向,其通过生物选择性催化,大幅度简化了原料预处理步骤和产物分离过程,有效提高从原料到产物的收率。文章对木糖醇大规模发酵生产中的主要技术环节,包括原料选择、水解方法、水解物脱毒与净化、微生物菌种选择、发酵过程与产物分离等问题进行了系统评述,并对这些关键环节的工艺策略选择提出了笔者的观点。     

双组份转运系统BrnFE的过表达和表面活性剂的添加对谷氨酸棒杆菌发酵生产L-异亮氨酸的影响

为了提高L-异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum LD320的产酸水平,通过改善其分泌系统,在C. glutamicum LD320中分别过表达突变型和野生型的双组份转运系统BrnFE操纵子,构建了重组菌LD320/pXMJ19-brnFE和LD320/pXMJ19-brnFE1。通过对两株重组菌的L-异亮氨酸生产分析比较,发现突变型比野生型能更有效地提高 L-异亮氨酸产量。同时对 LD320/pXMJ19-brnFE1进行表面活性剂添加实验,发现Tween-80为最佳选择,其最佳添加量为0.5 g/L,最佳添加时间为对数期的16 h。最后通过7 L发酵罐放大实验,LD320/pXMJ19-brnFE1的L-异亮氨酸产量由18.53 g/L提高到25.45 g/L,比对照组提高了37%。     

用吸附柱和离交柱层析法从猪血粉水解液中连续分离七种氨基酸

<正> 本文介绍了采用国产活性炭及阳离子交换树脂两种柱体巧妙地组合,并应用不同类型的洗脱剂,变换其浓度和洗脱速度,相互配合,能成功地从猪血粉水解液中一次连续分离和制取L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸和L-精氨酸。多次提取试验表明,工艺操作简单、稳定可靠,苯丙氨酸与酪氨酸、亮氨酸与缬氨酸分离良好,     

丙酮酸和乙酰-CoA协同促进L-亮氨酸的合成

【目的】通过理性改造柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)、丙酮酸脱氢酶系E1p (pyruvate dehydrogenase complex,PDHC,编码基因aceE)和ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-Citrate lyase,ACL),有效供应胞内丙酮酸和乙酰-CoA,以提高L-亮氨酸产量。【方法】以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为底盘细胞,分析不同CS和PDHC酶活水平对L-亮氨酸合成的影响。随后,考查协同改造CS和PDHC或引入绿硫菌(Chlorobium tepidum)中ACL对L-亮氨酸合成的影响。【结果】低强度的CS酶活(即重组菌XL-3 P_(dapA-R2)gltA)有利于L-亮氨酸的合成,L-亮氨酸产量达到17.5±0.6 g/L。而改变PDHC酶活水平不利于L-亮氨酸的合成。此外,以启动子P_(dapA-R2)控制CS表达,而以启动子P_(gapA)控制PDHC表达时(即重组菌XL-4),可实现胞内丙酮酸和乙酰-CoA的有效供给,L-亮氨酸产量达到20.2±1.7 g/L,且显著降低副产物产量。若在重组菌XL-4中引入C.tepidum,ACL会显著抑制菌体生长而不利于L-亮氨酸合成,而引入到出发菌XL-3中因胞内丙酮酸和乙酰-CoA得到有效供给,目标重组菌XL-5L-亮氨酸产量达到18.5±1.2 g/L,比出发菌株XL-3增加了14.2%。【结论】重组菌XL-4中因协同控制CS和PDHC酶活,从而实现胞内丙酮酸和乙酰-CoA有效供给,促进L-亮氨酸的合成。该研究结果对后续利用代谢工程技术强化微生物合成L-亮氨酸等支链氨基酸具有重要的参考价值。     

L-异亮氨酸产生菌黄色短杆菌的选育

以黄色短杆菌BF420为出发菌株,经过紫外线和亚硝基胍(NTG)复合诱变处理后,获得一株甲硫氨酸缺陷(Met-)及抗α-氨基丁酸(α-AB)的L-异亮氨酸产生菌BM2610,该菌株在未进行优化的发酵条件下能够积累L-异亮氨酸的量为7.12g.L-1,比出发菌株BF420提高了122.5%。     

通过谷氨酸棒状杆菌由α-酮异已酸生产L-亮氨酸的微生物生产法

本文研究用谷氨酸棒状杆菌(Co-rlnebacterium glutamicum)将α-酮异巳酸转化为L-亮氨酸的生产过程。在α-酮异已酸的浓度为20克/升的培养基中,经57小时的发酵大约有16克/升的L-亮氨酸被合成,其克分子产量为91%。若采用流加补料分批培养法时,在23小时内就可能从32克/升的α-酮异巳酸中产生出24克升的L-亮氨酸。有关的酶学研究表明,在这种谷氨酸生产菌中a酮异巳酸是经过转氨酶B的作用被转化为亮氨酸的。转氨作用所需的L谷氨酸则通过谷氨酸脱氨酶的作用再生。α-酮异巳酸加入培养基中后,转氨酶B的比活性提高三倍。     

L-乳酸的发酵生产和聚L-乳酸的化学加工

L-乳酸广泛应用于食品、医药、日化和工业等各个领域。近年来随着石化资源的不断紧缺,众多化学合成的高分子材料的生产受到了限制。以生物质资源为基础的L-乳酸因此被大量用于加工生产成聚L-乳酸等环境友好型生物可降解材料。正是由于L-乳酸需求量的增大,如何高效低成本地生产L-乳酸显得尤为重要。系统综述了L-乳酸生产菌株的选育,用于L-乳酸发酵生产的廉价资源的开发利用,L-乳酸的发酵生产和L-乳酸的分离纯化等方面的研究进展。目前研究的热点和难点正是基于上述四个部分:菌种方面,以可以高效代谢利用廉价底物,且营养需求低的选育目标获得了多个优良的生产菌种,然而具备综合代谢优势的菌种还有待进一步选育;发酵底物方面,已开发利用多种廉价,来源丰富且易于菌种代谢并高效转化成乳酸的底物,但是对这些底物工业规模应用还有待进一步研究;发酵工艺方面,建立了环境友好型,劳动强度低的发酵工艺,然而实际应用中仍然存在成本高的问题;后提取方面,通过选育低营养需求的生产菌种和采用新型发酵工艺有效地简化了后提取过程,但是实际应用方面仍受发酵工艺成本高的制约。最后对聚L-乳酸的化学加工以及聚L-乳酸的生物降解进行了探讨并提出了一些建议。     

信息库

1 费氏丙酸杆菌将L-亮氨酸转化为异戊酸 费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)是瑞士硬干酪上的次生菌群中的主要组成菌之一,在亮氨酸分解代谢时产生风味化合物。本研究的目的就是测定费氏丙酸杆菌在亮氨酸分解代谢中的作用。将费氏丙酸杆菌TL34和ITGP23菌株的细胞提取物和静止细胞,分别保温在含有L-亮氨酸,α-酮戊二酸,和辅助因子的溶液中。     

卡伍尔氏链霉菌NA4突变株ΔbafAI的次级代谢产物研究

链霉菌产生的次级代谢产物是农用和医药抗生素的重要来源。为了更深入挖掘卡伍尔氏链霉菌NA4潜在多样的次级代谢产物,对阻断NA4主产物bafilomycins的突变株ΔbafAI随机激活的代谢产物进行分离和鉴定。采用HP20固相萃取、硅胶柱色谱、凝胶柱色谱以及半制备HPLC等方法对ΔbafAI代谢产物进行分离纯化;使用NMR和MS确定化合物结构,并对单体化合物进行了生物活性测定。共分离鉴定6个化合物:环(L-异亮氨酸-L-脯氨酸)(1)、环(L-缬氨酸-L-脯氨酸)(2)、环(L-脯氨酸-L-亮氨酸)(3)、环(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)(4)、(2E, 4E)-5-(3-羟苯基)-戊-2, 4-二烯酰胺(5)和5′-脱氧-5′-甲硫肌苷(6)。6个化合物均是阻断NA4主产物后非特异激活的或产量显著提高的化合物,均为该菌中首次分离;化合物5和6是第二次从天然提取物中分离得到;化合物1和2显示出抗白色念珠菌活性,并首次报道了化合物5的抗氧化活性。进一步丰富了卡伍尔氏链霉菌NA4次级代谢产物研究,为激活沉默或低表达次级代谢产物合成基因簇提供了有益借鉴。     

氨基酸制备色谱——丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸制备柱柱效率研究

现代液相色谱已从分析色谱发展到制备色谱,为了研究氨基酸制备色谱柱柱效率,我们从液相色谱理论的十几个基本关系式中归纳出五个基本方程式,用以评价丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸制备柱柱效率。初步试验结果表明,对强酸性阳离子交换树脂柱而言: 1.凝胶型离子交换树脂柱柱效率高于普通大孔型离子交换树脂柱柱效率,而与本室合成的Dpsc大孔型离子交换树脂柱柱效率相当。 2.凝胶型离子交换树脂中,低交联度离子交换树脂有利于提高缬氨酸和亮氨酸制备柱柱效率,可较好地分离缬氨酸和亮氨酸;较高交联度离子交换树脂有利于提高丙氨酸和缬氨酸制备柱柱效率,可较好地分离丙氨酸和缬氨酸。将不同的离子交换树柱组合起来,可以提高丙氨酸,缬氨酸和亮氨酸的分离度,提高氨基酸的回收率。这项研究成果已应用到从猪血粉、猪毛等天然蛋白质酸水解物中系统分离多种氨基酸,以及分别从缬氨酸、亮氨酸(异亮氨酸)发醇液中分离纯化缬氨酸、亮氨酸(异亮氨酸)。     

L—谷氨酰胺高产菌株的选育

本文着重介绍了以野生型谷氨酸产生菌ATCC14067为亲株,经过亚硝基胍处理,筛选对磺胺胍具有抗性的突变株,再经过生长试验及稳定性试验,最后选育出两株稳定性好、付产物谷氨酸少的L—谷氨酰胺高产菌株。 L—谷氨酰胺(L—2—氨基戊二酸—酰胺)是L-谷氨酸的r-羧基酰胺化,在医药上是一种极有价值的氨基酸。自1952年用X光衍射确定了其分子结构后,对它的应用日益引起人们的关注。目前国外临床上主要用于治疗精神萎靡、酒精中毒及胃和十二指肠溃疡等疾病;它又是合成脑功能改善药N—乙酰谷酰胺的重要中间物。从谷氨酸产生菌的野生型菌株ATCC14067通过改变发酵条件直接发酵生产L-谷氨酰胺,我们以前曾有过报导。我们通过诱变选育到两株对磺胺胍具有抗性的变异株。变异株的谷氨酰胺产量提高,发酵付产品谷氨酸的量也有减少,为以后提取分离提供了方便。