快速老化鼠脑MT1和MT3 cDNA克隆及mRNA定量条件的建立

金属硫蛋白 (Metallothionein ,MT)基因家族的三种亚型MT1、MT2和MT3在脑组织中均有表达 ,它们在脑组织中具有重要的神经生理和神经调节功能 ,其中MT3可能是老年性痴呆 (Alzheimer′sdisease ,AD)潜在的病因学因子。本研究以快速老化鼠SAMP10脑组织总RNA为模板 ,通过RT PCR扩增出MT1的编码区序列和MT33′非翻译区序列的cDNA片段。将两个片段克隆到pGEM○R TEasy载体上 ,经测序分析确定两个cDNA片段分别为MT1编码区序列和MT33′非翻译区序列。Northern杂交结果表明 ,MT1和MT3mRNA在 2、4、6、8四个月龄的SAMP10和SAMR1脑组织中均有表达。同时建立了MTmRNA的定量条件 ,为进一步研究MTmRNA增龄性变化规律及与老年性痴呆病因学的关系奠定了基础。     

鸡二价金属转运蛋白1 cDNA的克隆与序列分析

鸡二价金属转运蛋白1（divalent metal transporter 1, DMT1）在动物胃肠道锰吸收过程中起重要作用.根据哺乳动物Dmt1同源蛋白氨基酸序列的保守性设计引物,应用3′RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,扩增并克隆获得鸡小肠Dmt1 cDNA 3′端1 289bp和1 092bp的2种片段,发现其3′端翻译区和非翻译区存在差异. 根据鸡Dmt1 cDNA 3′端片段的测序结果设计引物,扩增获得1个与3′端片段部分重叠的鸡Dmt1 cDNA 5′端907 bp片段,并对其进行了克隆测序. 根据鸡小肠Dmt1 3′RACE片段和5′RACE片段序列信息进行拼接,从而获得鸡小肠Dmt1 cDNA全序列信息.结果表明,鸡小肠Dmt1 cDNA有2种形式,1种全长为1 972个核苷酸,其中5′非翻译区为104个核苷酸,编码区1 695个核苷酸,3′非翻译区为173个核苷酸,编码1个含564个氨基酸残基的蛋白质;另1种形式为1 775个核苷酸,其中5′非翻译区为104个核苷酸,编码区1 593个核苷酸,3′非翻译区为78个核苷酸,编码1个含530个氨基酸残基的蛋白质.据鸡Dmt1 cDNA推测出的2种形式蛋白质的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠的Dmt1蛋白具有高度同源性,它们的同源性分别为82%、82%、80%,和 84%、84%、83%. 对推测氨基酸序列进行疏水性和跨膜区分析表明,Dmt1蛋白为1种跨膜整合蛋白,具有膜转运蛋白糖基化位点和底物结合位点的保守序列.     

凡纳滨对虾MT基因序列及其在卵巢发育和低温胁迫中的表达分析

在低温处理仔虾全长cDNA文库的筛选测序中, 获得凡纳滨对虾(Litopenaeus vannmei)金属硫蛋白基因全长cDNA序列, 该序列含有425个碱基, 包含177 bp开放阅读框, 上游98 bp的非编码区及下游150 bp 的非编码区, 编码58个氨基酸, 其中半胱氨酸含量丰富, 富含金属硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys 结构。多序列比对表明, 凡纳滨对虾MT蛋白序列与美洲螯龙虾(Homarus americanus)MT蛋白序列具最高同源性72.4%。Real-time PCR结果表明, 凡纳滨对虾MT基因在卵巢组织中呈优势表达, 在不同发育期的卵巢中的表达量都很高, 在低温处理凡纳滨对虾肝胰腺组织中上调表达。实验所得结果为研究凡纳滨对虾金属硫蛋白基因在生殖发育和低温应激中的功能提供了参考。       

柽柳金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

用木麻黄(Casuarina glauca)的金属硫蛋白基因(metallothionein 1)氨基酸序列对柽柳ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了柽柳金属硫蛋白基因全长cDNA序列,去除polyA后该基因全长366 bp,其中5′非翻译区97 bp,3′非翻译区59 bp,开放读码框(ORF)长210 bp,编码70 个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为6.793 kD,理论等电点为4.99,含10个Cys,集中分布在肽链的N端和C端。BlastP同源性分析表明该基因与花生同源性最高,与小豆同源性最低。该基因的EST序列在GenBank登录(登录号：CV792539)。     

菊芋类金属硫蛋白基因htMT2的克隆及其表达特征分析

从菊芋 (HelianthustuberosusL .)块茎cDNA文库中得到了一个新的植物类金属硫蛋白基因htMT2的cDNA序列 ,全长 5 0 9bp ,包括 2 4 0bp的开放阅读框、6 2bp的 5′端非翻译区、2 0 7bp的 3′端非翻译区。通过PCR获得了 2个htMT2编码区的部分基因组片段htMTG_1及htMTG_2 ,长度分别为 986bp和 982bp。分析表明两个基因组片段均包含 3个外显子及 2个内含子 ,编码一个由 79个氨基酸残基组成的多肽 ,与从htMT2推测的多肽完全一致 ,该多肽具有植物类金属硫蛋白的典型结构特征 ,N端及C端结构域富含Cys ,分别具有 8个和 7个Cys残基 ,上述两个结构域被一个无Cys的中间区分开。Southern杂交结果表明 ,htMT2在菊芋基因组中以小基因家族的形式存在。Northern杂交结果表明htMT2在叶片、叶柄、茎及块茎中均有表达 ,在茎中有较高水平的表达 ,但在根中未检测到杂交信号。经Cu2 处理后 ,htMT2在茎中的表达量显著降低。与其他 2型金属硫蛋白的序列同源性比较及htMT2对金属离子处理的反应均表明 ,htMT2是一种新的植物类金属硫蛋白基因。     

菊芋类金属硫蛋白基因htMT2的克隆及其表达特征分析

从菊芋(Helianthus tuberosus L.)块茎cDNA文库中得到了一个新的植物类金属硫蛋白基因htMT2的cDNA序列,全长509 bp,包括240 bp的开放阅读框、62 bp的5′端非翻译区、207 bp的3′端非翻译区.通过PCR获得了2个htMT2编码区的部分基因组片段htMTG-1及htMTG-2,长度分别为986 bp和982 bp.分析表明两个基因组片段均包含3个外显子及2个内含子,编码一个由79个氨基酸残基组成的多肽,与从htMT2推测的多肽完全一致,该多肽具有植物类金属硫蛋白的典型结构特征,N端及C端结构域富含Cys,分别具有8个和7个Cys残基,上述两个结构域被一个无Cys的中间区分开.Southern杂交结果表明,htMT2在菊芋基因组中以小基因家族的形式存在.Northern杂交结果表明htMT2在叶片、叶柄、茎及块茎中均有表达,在茎中有较高水平的表达,但在根中未检测到杂交信号.经Cu2+处理后,htMT2在茎中的表达量显著降低.与其他2型金属硫蛋白的序列同源性比较及htMT2对金属离子处理的反应均表明,htMT2是一种新的植物类金属硫蛋白基因.     

一个新的二色补血草金属硫蛋白基因LbMT2的克隆及其表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出一个新的金属硫蛋白基因LbMT2全长cDNA序列。该基因全长518 bp, 其中5′非翻译区(UTR)64 bp, 3′非翻译区205 bp, 开放阅读框(ORF)249 bp, 编码由82个氨基酸组成的蛋白质, 编码蛋白的分子量为8.1 kDa, 理论等电点(pI)为4.72。利用实时定量PCR方法研究了二色补血草在CuSO4、CdCl2、NaCl、低温和PEG胁迫下不同时间该基因的表达模式。结果表明, CuSO4、CdCl2、NaCl和低温处理均能诱导LbMT2基因在二色补血草的根和叶中的表达, 而PEG处理则抑制了LbMT2在根和叶中的表达。构建LbMT2基因的原核表达载体pGEX-LbMT2, 通过IPTG诱导在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21中融合表达, SDS-PAGE 电泳获得35 kDa 的蛋白条带, 大小与预期相符。     

香蕉果实特异性ACC合酶的cDNA克隆及序列分析

根据ACC合酶高度保守区氨基酸序列设计两种兼并引物。通过RTPCR,克隆了香蕉果肉ACC合酶1693bp的cDNA片段。再根据其序列测定结果进行5′RACE(RapidamplificationofcDNAends)。最终确定香蕉果肉中ACC合酶的mRNA全长为1752个核苷酸。其中5′非翻译区74个核苷酸,编码区1461个核苷酸,3′非翻译区217个核苷酸,编码产物为486个氨基酸。通过Northern杂交分析,证明此ACC合酶基因的表达具有果实特异性     

星星草cDNA文库构建和金属硫蛋白(MT-1)基因的克隆

以受NaHCO3胁迫后的星星草叶片组织为材料构建了cDNA文库,文库的初始滴度为2.0×106pfu,重组率为95%,平均插入片段长度为0.8kb,扩增后文库的滴度为4.0×109pfu.mL-1.文库克隆随机测序获得了星星草的金属硫蛋白(MT-1)基因的全长cDNA序列,显示文库中含有一定量的全长基因.MT-1基因全长622bp,其中5'非翻译区57 bp,3'非翻译区343 bp,开放读码框长222 bp,编码73个氨基酸,氨基酸序列中具有植物MT-1蛋白特有的金属响应元件(MRE)序列,MT-1蛋白的分子量为7.814 kD,理论等电点为4.72.     

中华蜜蜂蜂毒镇静肽基因的cDNA克隆和表达

从中华蜜蜂 (Apisceranacerana)工蜂毒腺中快速抽提总RNA ,用RT PCR扩增得到大小约为2 5 0bp的cDNA片段 ,测序得到的片段长度为 2 34bp ,为蜂毒前镇静肽原 (preprosecapin)基因编码区的cDNA .以 3′RACE方法 ,扩增和测定了 3′端非编码区 2 19bp序列 .中蜂前镇静肽原cDNA序列与已报道的欧洲意蜂该基因cDNA序列具有 92 %同源性 ,氨基酸序列具有 87%同源性 .代表成熟肽镇静肽的最后 2 5个氨基酸序列 ,中蜂与意蜂同源性为 88% .3′端非编码区cDNA序列与欧洲意蜂序列有 73 1%同源性 .将中华蜜蜂蜂毒镇静肽成熟肽编码区与 3′非编码区部分克隆 ,构建了镇静肽与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX AcSecapin .将载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)进行融合表达 .表达产物与抗GST抗体在 2 9kD处有很强的交叉反应 .大肠杆菌超声破碎后的上清液用SDS PAGE检测到表达的蛋白多为可溶性融合蛋白 ,通过亲和层析柱纯化和凝血酶的切割得到了镇静肽蛋白     

大口黑鲈脂代谢相关基因NPY、UCP2、LPL、HL克隆与分子进化分析

采用RT-PCR和RACE方法克隆了大口黑鲈NPY基因cDNA全序列及UCP2、LPL、HL基因cDNA核心片段。序列分析结果表明,大口黑鲈NPY基因cDNA全序列长664 bp,其中5′端非翻译区(5′-UTR)长53 bp,3′端非翻译区(3′-UTR)长311 bp,开放阅读框(ORF)长300 bp,编码99个氨基酸,即前体NPY。大口黑鲈前体NPY包括三个部分,28个氨基酸组成的信号肽、36氨基酸组成的成熟NPY以及32个氨基酸组成的由Gly-Lys-Arg指示的NPY C端肽（CPON）。大口黑鲈UCP2、LPL、HL基因cDNA核心片段长度分别为737 bp、509 bp和666 bp,各自编码245个氨基酸、169个氨基酸和222个氨基酸。将4个基因的氨基酸序列分别与其他物种的氨基酸序列进行同源性比较,并通过MEGA3构建系统树,对这4个脂代谢相关基因的分子进化特征进行了探讨。     

苹果金属硫蛋白基因MdFjMT2克隆及生物信息学分析

以红富士苹果（Malus domestica CV Red Fuji）浓红型芽变和其条红母株为试材,构建抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization,SSH）文库,差异筛选SSH-cDNA文库,经过大量测序构建成红富士苹果ESTs序列本地数据库,对本地数据库进行Blastn检索,得到42条金属硫蛋白基因MdFjMT2 cDNA片段,通过序列拼接和?逆转录PCR（RT-PCR）方法,获得了红富士苹果金属硫蛋白基因MdFjMT2全长cDNA序列（Genbank登录号为HQ730757）,该基因全长684 bp,其中5′ 非翻译区97 bp,3′ 非翻译区347 bp,开放阅读框（ORF）为240 bp,编码79个氨基酸,推测蛋白分子量为7.7938 kDa,理论等电点为4.75。该基因具有金属硫蛋白基因的典型结构域特征,编码的氨基酸序列中含有14个半胱氨酸残基Cys（C）,Cys 残基的排列特征是以CC、CXC和CXXC集中分布在肽链的N端和C端。系统进化分析表明MdFjMT2与砂梨（Pyrus pyrifolia）、苹果（Malus domestica）和小金海棠（M. xiaojinensis）等植物金属硫蛋白保持了较近的亲缘关系,与扁桃（Prunus dulcis）、旱柳（Salix matsudana）、美味猕猴桃（Actinidia deliciosa）等植物的亲缘关系较远。生物信息学分析结果表明,MdFjMT2主要位于叶绿体中,没有信号肽,是非跨膜亲水性蛋白,其蛋白质二级结构的主要元件是无规则卷曲,没有功能结构域。这些结果为MdFjMT2的结构与功能挖掘提供一定的参考。本研究结果有助于研究该基因在苹果着色中的作用,阐明苹果着色的分子机制。     

斧文蛤金属硫蛋白基因的克隆与表达分析

金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质,参与机体重金属解毒、维持金属元素代谢平衡以及清除自由基等生理功能。为了解斧文蛤金属硫蛋白（Ml-MT）的分子生物学特征及其在重金属Cd2+胁迫下的响应机制,本文采用RACE技术从斧文蛤（Meretrix lamarckii）总RNA反转录产物中获得了636 bp的Ml-MT cDNA基因序列。该序列包含65 bp的5非编码区（UTR）和340 bp的3非编码区（UTR）以及231 bp的开放阅读框（ORF）,可编码76个氨基酸;其中半胱氨酸占27%,不含芳香族氨基酸,含16个MT所特有的Cys-Xn-Cys结构,预测的分子量约为7.704 kD,理论等电点7.138。MT氨基酸序列比对分析表明:斧文蛤金属硫蛋白（Ml-MT）与丽文蛤（Meretrix lusoria）的相似性高达88%,与文蛤（Meretrix meretrix）的同源性为87%。实时荧光定量（qRT-PCR）检测MT在斧文蛤5种组织中均有表达,但存在组织特异性,其中内脏团表达量最高,其次依次为鳃丝、闭壳肌、外套膜、斧足。在Cd2+（0.13 mg/L）胁迫0、6h、12h、24h、48h、72h和96h下,斧文蛤内脏团MT呈现出不同程度的上调表达,具体表现为高-低-高-低的波浪式变化,除6h以外,其他时间点均与对照组存在极显著差异（P0.01）。本研究表明:MT基因在维护机体正常生理功能及斧文蛤抵御重金属Cd2+胁迫过程中发挥着重要的分子调控作用。     

鸡含锰超氧化物歧化酶cDNA克隆及序列分析

 为弄清鸡含锰超氧化物歧化酶 (manganese containingsuperoxidedismutase ,MnSOD)的cDNA序列 ,以开展动物锰营养学的深入研究 ,根据已知鸡MnSOD的N端氨基酸序列设计简并引物 ,应用 3′RACE(rapidamplificationofcDNAends)技术 ,扩增克隆了鸡心肌MnSOD 990bp的 3′cDNA片段 .再根据 3′RACE片段测序结果设计引物进行 5′RACE ,结果获取了一个与 3′RACE片段相互重叠的鸡心肌MnSOD 52 1bp的 5′RACE片段 ,并对其进行了克隆测序 .最后根据 3′RACE片段和 5′RACE片段序列信息进行拼接 ,从而获取鸡MnSODcDNA的全序列信息 .研究结果表明 :鸡MnSODcDNA全长为 110 8个核苷酸 ,其中 5′非翻译区 2 5个核苷酸 ,编码区 675个核苷酸 ,3′非翻译区 4 0 8个核苷酸 ,编码一个长 2 2 4个氨基酸残基的蛋白质前体 .其中信号肽长 2 6个氨基酸残基 ,成熟肽长 198个氨基酸残基 ,分子量为 2 2kD .与人、大鼠、线虫、果蝇等真核生物MnSOD氨基酸序列的同源性分别为82 4 %、84 .7%、62 .4 %、59.3% .     

扩展青霉PF898碱性脂肪酶cDNA的克隆及序列分析

扩展青霉 (Penicilliumexpansum)PF898可产生一种具有工业价值的碱性脂肪酶 (PEL) .在测定了其N端 12个氨基酸残基序列的基础上 ,通过RT PCR、5′RACE、基因克隆及序列测定 ,获得了PEL完整的cDNA序列 (GenBank登录号为AF2 84 0 6 4 ) .cDNA全长 10 5 0bp ,包括PEL编码区、3′非翻译区和部分 5′非翻译区基因的序列 .编码区cDNA由 85 5个碱基组成 ,编码 1个由 2 85个氨基酸残基组成的酶蛋白 ,其信号肽及前肽部分由 2 7个氨基酸残基组成 ,成熟肽部分由 2 5 8个氨基酸残基组成 .根据氨基酸组成推导该脂肪酶蛋白的分子量为 2 7 3kD .该脂肪酶的氨基酸序列 130～ 134位上有各类脂肪酶中普遍存在的G X S X G保守序列     

镉中毒大鼠睾丸与肝脏金属硫蛋白表达的时相研究

啮齿目动物睾丸对镉毒性较肝脏更敏感.为阐明睾丸的镉毒性分子机制,比较了肝脏与睾丸金属硫蛋白（MT）表达的时相变化.mRNA采用RT-PCR技术分析并用光密度扫描定量;蛋白质定量用ELISA方法.结果显示,睾丸中存在MT,镉中毒后MT1与MT2 mRNA明显升高,但MT没有相应增加;肝脏镉中毒后MTmRNA与MT均明显升高.结果提示：镉虽然能诱导睾丸MTmRNA的转录,但没有促进其MT的合成,这可能是睾丸对镉毒性与致癌作用较肝脏更敏感的重要原因.     

牦牛MT-I/-Ⅱ cDNA分子克隆及其蛋白质结构分析

利用基因特异引物YMTSP1和YMTSP2,通过RT-PCR从牦牛肝脏组织RNA中克隆出了牦牛MT-Ⅰ(Genbank Accession NoAY513744)和MT-Ⅱ(Genbank Accession NoAY513745)基因编码区全长.将牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ cDNA序列在CBI上进行同源性搜索发现,牦牛MT-Ⅰ/-Ⅱ编码区序列在不同哺乳动物中相当保守.牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ编码的MT-Ⅰ和MT-Ⅱ蛋白分别由61个氨基酸组成,其具有保守的短肽结构如C-X-C,C-C-X-C-C,C-X-X-C等,其决定MT蛋白分子的整个三维结构,在分子进化上十分保守.同时对牦牛MT的疏水性和跨膜区分析表明,牦牛MT蛋白可能不存在跨膜区,也不存在信号肽,是1种非分泌蛋白.并通过同源比较模建,预测和构建了牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ蛋白的分子空间结构,表明牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ由α-和β-两个结构域组成,在α-结构域含有5个Cys短肽结构,β-结构域有4个Cys短肽结构,且2个结构域由保守的三肽序列KKS相连.     

鲢鱼解偶联蛋白2全长cDNA序列的克隆及其组织表达

从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)肝脏,通过简并引物克隆解偶联蛋白2(un-couplingprotein2,UCP2)cDNA核心序列,应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得鲢鱼肝脏UCP2cDNA全序列。序列分析结果表明,鲢鱼肝脏UCP2cDNA全长1452bp,其中5′-UTR长337bp,3′-UTR长182bp,编码区933bp,编码310个氨基酸,推测的氨基酸序列包含线粒体内膜载体蛋白3个特征结构及解偶联蛋白(UCPs)的特征序列。对鲢鱼不同组织UCP2的表达调控研究发现,鲢鱼组织UCP2基因在肠道、肝脏、肌肉、脂肪组织均大量表达,而在脑组织表达量较低,这与鲢鱼体内微囊藻毒素在这几个组织的分布完全一致,表明UCP2的功能可能与抑制微囊藻毒素引发过量活性氧(ROS)生成有关。     

噬菌体显示法克隆RNA结合蛋白cDNA——表达文库的构建

试图用噬菌体显示法(phage display)克隆编码与人白细胞介素6核转录因子的3′非翻译区(NF-IL6 3′UTR)特异结合的蛋白的cDNA.构建了回复系RR细胞的cDNA的噬粒(phagemid)表达文库,并设法除去了cDNA的大部分终止密码子.鉴定表明,该文库中含有各种大小的cDNA插入片段,并能够表达外源cDNA,为用噬菌体显示法克隆RNA结合蛋白基因或cDNA做好了准备.     

鲢鱼解偶联蛋白2全长cDNA序列的克隆及其组织表达

从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)肝脏，通过简并引物克隆解偶联蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2) cDNA核心序列，应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列，最后通过序列拼接获得鲢鱼肝脏UCP2 cDNA全序列。序列分析结果表明，鲢鱼肝脏UCP2 cDNA全长1 452 bp，其中5′-UTR长337 bp，3′-UTR长182 bp，编码区933 bp，编码310个氨基酸，推测的氨基酸序列包含线粒体内膜载体蛋白3个特征结构及解偶联蛋白(UCPs)的特征序列。对鲢鱼不同组织UCP2的表达调控研究发现，鲢鱼组织UCP2基因在肠道、肝脏、肌肉、脂肪组织均大量表达，而在脑组织表达量较低，这与鲢鱼体内微囊藻毒素在这几个组织的分布完全一致，表明UCP2的功能可能与抑制微囊藻毒素引发过量活性氧(ROS)生成有关。