重组人干扰素ω在对数生长期毕赤酵母中的高效表达特性研究

用不同比生长速率μ的毕赤酵母探讨其表达外源重组蛋白的差异性,通过起始pH值、甲醇诱导浓度和周期、菌体浓度、装液量等实验,优化具有较高μ的对数生长期毕赤酵母表达rhIFNω的摇瓶条件。结果表明,μ对毕赤酵母表达rhIFNω有显著影响。μ为0.1612h-1的毕赤酵母表达rhIFNω最高为558mg/L,较μ为0.1321、0.0505和0.0052h-1的毕赤酵母分别提高50%、68%和99%。对数生长期的毕赤酵母表达rhIFNω的最适摇瓶表达条件为:250mL摇瓶装入30mL BMMY,控制菌体浓度达到200~300g/L(WCW),起始pH值自然,每24h添加甲醇15g/L一次,诱导表达周期为4d。通过表达条件的优化,rhIFNω的表达量达到1070mg/L,较优化前提高149%。     

碱性果胶酶在重组毕赤酵母中高效表达的关键因素研究

为提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的产量和生产强度,在摇瓶条件下优化了重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的关键因素。结果表明,以下条件：初始甘油浓度40g／L、初始甲醇浓度3.1g甲醇／gDCW、每24h添加0.51g甲醇／gDCW、诱导表达周期72h、250mL三角瓶诱导培养基装液量30mL、初始pH6,0,最适于菌体生长与产物表达。在此基础上,7L罐上通过恒速流加甘油进一步提高细胞密度,诱导阶段甲醇采取前期恒速流加和后期DO-stat,发酵结束菌体干重达80g／L,酶活为217U／mL,比摇瓶结果提高了66.2％。     

碱性果胶酶在重组毕赤酵母中高效表达的关键因素研究

为提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的产量和生产强度, 在摇瓶条件下优化了重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的关键因素。结果表明, 以下条件：初始甘油浓度40 g/L、初始甲醇浓度3.1 g甲醇/g DCW、每24 h添加0.51 g甲醇/g DCW、诱导表达周期72 h、250 mL三角瓶诱导培养基装液量30 mL、初始pH 6.0, 最适于菌体生长与产物表达。在此基础上, 7 L罐上通过恒速流加甘油进一步提高细胞密度, 诱导阶段甲醇采取前期恒速流加和后期DO-stat, 发酵结束菌体干重达80 g/L, 酶活为217 U/mL, 比摇瓶结果提高了66.2%。     

重组人巨细胞病毒嵌合肽基因在毕赤酵母中的克隆和表达

为了在毕赤酵母中表达带有组氨酸纯化标记的重组人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp),根据 其基因序列,设计引物从pPIC9K2rHCMVp 上扩增得到目的基因片段,并导入毕赤酵母诱导型表达 载体pPICZαA 中。通过电击将线性化的重组质粒转化到毕赤酵母X33 细胞中,筛选获得表达量 较高的重组菌株,研究了该菌株生长的培养条件,包括不同诱导时间、甲醇浓度、pH 值对人巨细 胞病毒嵌合肽表达的影响。2L 发酵罐进行了高密度发酵,经1 %的甲醇、pH610 的条件下诱导 48h,最终菌体密度OD600达到180,每升发酵液中含目的蛋白7817mg,产量比摇瓶提高了418 倍。 rHCMVp 可通过高密度发酵大量获得。     

氨离子浓度对重组毕赤酵母的生长和血管生长抑制素表达的影响*

本研究采用流加补料培养方式培养重组巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）,表达血管生长抑制素（Angiostatin）。整个培养过程分为以甘油为碳源的生长阶段和以甲醇为碳源的诱导阶段。全过程用氨水调节pH时,诱导阶段菌体生长受到抑制,蛋白的最大表达量为9.08mg/L。进行不同氨离子浓度的摇瓶培养,证实在以甲醇为碳源时,氨离子浓度对菌体的生长有明显的影响。高密度培养中改用 2 mol/L的 KOH溶液调节 pH,诱导阶段菌体有缓慢的生长,蛋白最大表达量增为20mg/L。     

人三叶因子3在毕赤酵母中表达条件的研究

为提高人三叶因子 3 (HumanTrefoilfactor 3 ,hTFF3 )在毕赤酵母中的表达量 ,研究了转化子生长的培养条件 ,包括不同碳源对转化子生长的影响和接种量、甲醇浓度、pH值、摇瓶转速及不同诱导时间对人三叶因子 3表达的影响。结果表明转化子在生长阶段加入葡萄糖生长旺盛 ,培养 14h后OD₆₀₀ 就可达到 50。在 100mL生长培养基上的菌液以 1∶1接入诱导培养基时蛋白表达量最高 ;转化子在 1%的甲醇、pH60、摇瓶转速240r/min的条件下诱导4 8h ,菌体密度OD₆₀₀为 15 ,目的蛋白表达量达到 20mg L。用 5L发酵罐进行了高密度发酵 ,经2%甲醇32h诱导 ,最终菌体密度OD₆₀₀ 达到 120 ,每升发酵液中含目的蛋白100mg。     

重组人抗凝血酶发酵条件的优化

目的:通过实验室发酵条件优化工作,实现在巴斯德毕赤酵母中高效表达重组人抗凝血酶。方法:在摇瓶培养条件下,应用正交实验方法考查人抗凝血酶重组毕赤酵母菌pPIC9K-AT-02的培养温度、培养基pH值、接种比例、甲醇补加间隔时间及甲醇补加浓度等5种因素对重组人抗凝血酶活性的影响,确定最优发酵条件。结果与结论:筛选出的最终发酵条件为培养温度30℃、培养基pH6.0、接种比例20%、甲醇补加间隔时间24 h、甲醇补加浓度2%,重组人抗凝血酶在巴斯德毕赤酵母中表达活性为4098 U/L,比原始活性提高了150%。     

重组毕赤酵母产青霉素G酰化酶的分批发酵动力学研究

构建了重组毕赤酵母产青霉素G酰化酶的分批发酵动力学模型。实验考察了分批发酵过程中甘油消耗、甲醇浓度、菌体浓度、溶氧、补料时间对青霉素G酰化酶活力的影响。应用Matlab软件,对菌体生长、基质消耗和产物生成方程进行最优参数估算和非线性拟合,得到相应的动力学模型。模型的计算值与实验值能较好地拟合,表明所建模型能较好反映重组毕赤酵母产青霉素G酰化酶的分批发酵过程。     

多拷贝毕赤酵母重组菌表达GCL摇瓶优化和高密度发酵

目的:构建高效表达白地霉脂肪酶的毕赤酵母重组菌株,并对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵条件优化和分批补料高密度发酵工艺研究。方法:将诱导型表达载体pPIC9K-gcl电转化至毕赤酵母GS115。通过橄榄油-罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组菌株,运用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR 法确定其拷贝数,并对菌株进行摇瓶发酵条件优化。在此基础上,研究重组菌在3L 发酵罐中的高密度发酵工艺。结果:筛选得到一株具有3 个白地霉脂肪酶基因拷贝的菌株GS115/pPIC9K-gcl 78#,初始酶活力为220 U/ml。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96 h,每24 h甲醇添加量1 %,接种量2 %,培养基初始pH 7.0,500 ml摇瓶装液量50 ml,甲醇诱导温度25℃ 时酶活力达735 U/ml。3L 发酵罐高密度发酵176.5 h,酶活力达到3360 U/ml,总蛋白含量达到4.30 g/L,且发酵过程中细胞活性一直保持在96 % 以上。结论:基因拷贝数与重组菌株的产酶水平呈正相关,摇瓶优化可显著提高重组菌株的产酶能力,为白地霉脂肪酶的工业化生产奠定了技术基础。     

毕赤酵母高密度表达重组猪胰岛素前体的研究

对摇瓶和50L罐上的重组菌毕赤酵母(Pichia pastoris)表达猪胰岛素前体(PIP)的发酵过程进行了研究。摇瓶发酵中,最佳诱导周期为60 h左右,诱导期甲醇的最佳加入量为每日2．0%～2．5%。50L发酵过程分为批发酵、补料和诱导表达3个阶段。生长期(批发酵和补料阶段)细胞干重与培养时间的关系可用模型y= 0．6525e~(0．1909t)来描述。在批发酵阶段和补料阶段,流加的氨水和甘油几乎全部用来合成菌体和维持,没有其他副产物产生。诱导表达阶段流加的氨水和甲醇分别约有80%和70%被菌体利用。将摇瓶与发酵罐的实验结果进行了比较,发现摇瓶发酵的限制因子很可能是溶氧,而罐发酵的限制因子为碳源,因此,将摇瓶实验的结果放大到发酵罐时调整了控制策略,加大了甲醇的补料速率,最终PIP浓度达到1．72g/L。     

重组毕赤酵母生产β-葡萄糖苷酶发酵条件初步研究

为提高重组毕赤酵母(P.pastoris KM71/pPIC9K-bgl)生产β-葡萄糖苷酶的产量,在摇瓶条件下对重组P.pastoris产β-葡萄糖苷酶的发酵过程进行了优化,得到最佳的条件:生长阶段甘油浓度为30 g/L,接种量为10%,诱导阶段甲醇的初浓度为4%,过程补加甲醇0.5%,诱导温度30℃,pH7.5,诱导周期120 h,酶活可达到245 U/mL。在此基础上,在3 L发酵罐上进行初步放大,流加甘油提高细胞密度至OD_(600)为170,开始流加甲醇诱导,最终BGL酶活达到1 175 U/mL。比摇瓶提高了4.8倍,为β-葡萄糖苷酶工业化生产打下了坚实的基础。     

毕赤酵母高密度发酵工艺的研究

高密度发酵是毕赤酵母提高蛋白表达量的一种重要策略,发酵工艺是高密度发酵的一个重要因素。采用下列措施均可以有效地提高表达水平：调节基础培养基,采用变pH和变温发酵,提高DO,选择最适的诱导前菌体密度和比生长速率并降低甘油初始浓度和采用分段式指数流加进行调控。选择合适的甲醇补料策略：甲醇限制补料（MLFB）、氧气限制补料（OLFB）、甲醇不限制补料（MNLFB）和温度限制补料（TLFB）。采用两种方式调控补料：诱导阶段菌体生长时,甲醇比消耗速率(qMeOH)为0.02-0.03gg-1h-1,而菌体不生长时,qMeOH采用较高值。     

费希尔曲霉脂肪酶在毕赤酵母中的优化表达及高密度发酵

【背景】脂肪酶广泛应用于纺织、食品、药品、皮革等工业领域,其在微生物中的异源表达研究进一步促进了脂肪酶产品的生产和应用。【目的】实现来源于费希尔曲霉的脂肪酶在毕赤酵母中的高效异源表达,探究其合适的表达及发酵条件,提高产量,降低成本。【方法】对费希尔曲霉的脂肪酶编码基因进行密码子优化后,应用pPIC9k质粒整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高产脂肪酶Lip605的毕赤酵母工程菌;并通过响应面发酵条件优化、筛选最适伴侣蛋白和高密度发酵相结合的方法,综合提高脂肪酶表达量。【结果】确定高产脂肪酶毕赤酵母工程菌的最优摇瓶发酵产酶条件为:甲醇3.103%(体积比),生物素0.4 mg/L,酵母粉11.5 g/L,酵母基础氮源培养基(yeast nitrogen base,YNB) 13.4 g/L,初始pH 6.4,装液量50 mL/250 mL,转速220 r/min,温度24°C,培养时间40 h。优化后的胞外脂肪酶酶活达到72.34 U/mL,较优化前提高了5.8倍;进一步选择12个伴侣蛋白分别与脂肪酶Lip605进行共表达,其中共表达伴侣蛋白Rpl10(pPICZA-RPL10)效果最佳,可使Lip605表达量进一步提高46.8%;在此基础上,经过10 L发酵罐分批补料的高密度发酵,工程菌株发酵142 h,胞外脂肪酶酶活最高达到680 U/mL,蛋白浓度为15.89 g/L。【结论】应用复合策略有效提高了脂肪酶Lip605在毕赤酵母中的发酵产量,为其进一步工业化生产奠定了良好的基础。     

重组巴斯德毕赤酵母产米根霉α-淀粉酶发酵条件的研究

为了提高重组菌的淀粉酶表达量,以可分泌表达米根霉α-淀粉酶的甲醇快速利用型巴斯德毕赤酵母重组菌为基础,采用摇瓶发酵方式对影响重组菌表达淀粉酶的多个因素进行了研究和优化。摇瓶发酵条件确定为:温度为30℃,pH值为6.0,接种量为2.0(OD_(600)),甲醇补加方式采用前72 h发酵时间内每隔12h添加至终浓度为1.0%,72 h以后每隔24 h添加至终浓度为1.0%,在此条件下获得的淀粉酶最高表达量为47.5 U/mL,且在无机盐培养基中和有机氮源培养基中获得的淀粉酶发酵单位相当。以摇瓶发酵数据为基础确定15 L发酵罐放大实验条件为:无机盐培养基,温度为30℃,pH值为6.0,接种量为10%,甲醇流加方式采用DO—Start法控制,在此发酵条件下获得的淀粉酶表达量为440 U/mL,约为摇瓶发酵方式获得的淀粉酶表达量的9倍。     

重组巴斯德毕赤酵母发酵生产几丁质酶的条件优化研究

研究了利用重组巴斯德毕赤酵母诱导表达重组几丁质酶的条件。在摇瓶水平上研究了诱导时间、pH、甲醇流加量、油酸等因素对重组几丁质酶表达的影响。结果发现诱导108h蛋白表达量最高;偏酸性环境不利于蛋白表达,维持在pH5.5～6.0最佳;甲醇最佳诱导浓度为1%;添加0.05%的油酸有助于提高蛋白表达量。在此基础上通过正交试验设计优化了培养基配方,在优化条件下,蛋白表达量达171.99mg/L,酶活达49.58U/mL。     

来源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因的高效表达

高效表达高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的一个有效途径。对源于Escherichiacoli的高比活植酸酶基因appA ,按照毕赤酵母 (Pichiapastoris)密码子的偏爱进行了密码子优化改造。该改造后的基因appA m按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9上的α 因子信号肽编码序列 3′端 ,通过电击转化得到重组转化子。对重组毕赤酵母的Southernblotting分析证实植酸酶基因已整合到酵母基因组中 ,并确定了整合基因的拷贝数。Northernblotting分析证实植酸酶基因得到了正常转录。SDS PAGE分析和表达产物的研究表明 ,植酸酶得到了高效分泌表达 ,在 5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到 2 5mg mL发酵液 ,酶活性 (发酵效价 )达到 7 5× 10 6 IU mL发酵液以上 ,大大高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。