G15V点突变对水稻OsRacD基因蛋白产物效应的影响

在水稻OsRacD基因编码GTPase结构域处,采用PCR方法引入G15V点突变模拟GTP结合形式的OsRacD.原核表达并纯化了突变前后的OsRacD蛋白,用于蛋白生化活性的分析.结果显示,突变后的OsRacD蛋白在GTP水解活性上有显著的提高,提示OsRacD在激活前后具有不同的蛋白生化特性,而且可能通过不同的胞内互作蛋白,引发不同的信号传递,证实了OsRacD在Rho信号转导通路中“分子开关”的重要作用.     

水稻OsRacD蛋白G15V、T20N点突变对其细胞定位的影响及其与靶蛋白的相互作用

OsRacD是水稻小GTP结合蛋白Rho家族成员,功能之一是作为“分子开关",通过控制花粉管的延伸生长,参与光敏核不育水稻光周期育性转换过程. 为研究该蛋白的作用机制,采用重叠延伸PCR方法,分别在其GTPase结构域中引入G15V、T20N点突变,模拟GTP和GDP结合形式的OsRacD. 进一步构建了受控于CaMV35S的与绿色荧光蛋白融合表达的双元植物表达载体;采用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞,在荧光显微镜下观察蛋白在活细胞内定位的特点. 结果显示,野生型蛋白在细胞质和细胞膜都有分布,组成型激活的蛋白主要分布在细胞膜上,而失活型蛋白则大都集中到细胞核周围. 蛋白相互作用的酵母双杂交体系分析显示,OsRacD及其2个突变体具有不同的靶蛋白结合特性. 研究证实,水稻OsRacD蛋白G15V和T20N点突变不仅影响其在活细胞内的定位,而且也影响了与靶蛋白的相互作用.说明处于不同鸟苷酸结合状态的OsRacD具有不同的胞内定位方式,可能通过结合不同的靶蛋白,引发不同的细胞应答事件.     

金属离子对GTP结合蛋白Cdc42Hs的内源性GTP酶活性的影响

不同的金属离子会对GTP结合蛋白Cdc42Hs的内源性GTP水解酶活性产生不同的影响。相对于生理条件下的辅基Mg^2 而言,Mn^2 对Cdc42Hs酶活力有所激活,表现在饱和浓度时,实验曲线指数项的表观速率常数kobs有2倍左右的提高,而其稳态反应速度要低于Mg^2 。Mg^2 和Mn^2 的实验曲线在本质上没有什么差别,都是一个指数项和一个一次项的叠加,说明Mn^2 和Mg^2 以相似的机制结合于Cdc42Hs。在Ca^2 存在时,实验曲线无明显的指数项出现,Ca^2 的存在仅使稳态反应速度有所,说明Ca^2 以不同于Mg^2 和Mn^2 的机理与Cdc42Hs结合,随着Mg^2 和Mn^2 离子浓度的增大,指数项的表观速率常数kobs逐步升高,稳态反应速度vs逐渐降低,进一步的动力学模型分析得到了这一反应的微观动力学数学和Mg^2 、Mn^2 与蛋白的结合常数。     

拟南芥乙酰羟酸合成酶(AHAS)点突变原核表达与活性测定

拟南芥乙酰羟酸合成酶(AHAS)参与支链氨基酸合成。为考察AHAS不同结构域对支链氨基酸合成的影响,分别对其大小亚基上特定位点进行点突变后进行原核表达,体外重组后对其全酶活性进行测定,并对其终端产物之一——缬氨酸对AHAS全酶活性的影响进行探讨。结果显示:AHAS小亚基G88D突变将解除其终端产物的反馈抑制作用,而大亚基E305D与E482D的突变降低AHAS全酶活性,且2种不同突变大亚基对AHAS全酶活性影响存在差异。AHAS大亚基E482D突变较E305D突变影响更大。研究结果表明:AHAS大小亚基间存在着相互作用,且大小亚基不同结构域突变对AHAS全酶活性具有不同的影响。     

调宁蛋白T184的定点突变、表达、纯化和鉴定

为增强调宁蛋白对平滑肌收缩的抑制作用,用PCR重叠延长法使调宁蛋白基因中编码第184位苏氨酸的ACT突变为编码丙氨酸的GCC,将此PCR的突变产物装入到质粒载体pAED₄后,转化至E.coli BL₂₁(DE₃)中, 构建的重组转化子用酶切和测序鉴定.诱导含有重组转化子的E.coli获得高效表达,经SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定后,采用反复冻融法及葡聚糖凝胶层析柱分离,初步纯化出调宁蛋白突变体T184A.     

人组氨酸磷酸酶PHP14的原核表达及其体外互作蛋白的研究

目的:表达和纯化人组氨酸磷酸酶PHP14蛋白,并寻找与其存在体外相互作用的蛋白。方法:PCR扩增PHP14的全长cDNA,并将其克隆至pGEX4T原核表达载体,构建重组表达质粒。用重组表达质粒转化大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导后,使用Glutathione Sepharose 4B凝胶颗粒进行亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳确定融合蛋白的表达。进行GST-Pulldown实验,寻找体外与PHP14相互作用的蛋白,并进行质谱鉴定。结果:在大肠杆菌BL21中成功了表达出了PHP14的可溶性融合蛋白;经Glutathione Sepharose4B凝胶颗粒纯化后,获得了纯化的GST-PHP14融合蛋白,GST-Pulldown实验和质谱鉴定结果发现PHP14与HSP90在体外存在相互作用。结论:实现了PHP14的原核表达和纯化,发现PHP14与HSP90在体外可能存在相互作用。     

人类重组PIF1蛋白的表达纯化和解螺旋酶活性的分析

Pif1解螺旋酶家族在酵母到人的进化中非常保守, 在生物体内具有很多重要的生理作用。为了从生物化学水平研究人类PIF1的功能, 从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到人类PIF1全长基因, 通过共转化一个携带稀有遗传密码tRNA1的质粒和一个编码分子伴侣的质粒, 增加了PIF1蛋白在大肠杆菌中的表达, 最后通过快速液相色谱纯化系统, 采用亲和层析和凝胶过滤, 纯化了人类重组PIF1蛋白。生物化学活性检测证明了纯化的人类PIF1蛋白具有ATP酶及解螺旋酶活性。人类PIF1蛋白的纯化为我们从分子水平理解PIF1在体内的功能奠定了基础。     

硒蛋白Sep15基因克隆、定点突变及其原核表达

克隆鉴定猪硒蛋白Sep15基因( Sep15 ),将其突变实现原核表达,为以猪为模型研究Sep15功能奠定基础。实验以RT-PCR从猪脾总RNA扩增出含开放阅读框(ORF)至poly(A)共1230 bp的 Sep15 cDNA,3'-非翻译区Sec插入元件为2型,489 bp的ORF及对应氨基酸序列与人相应序列的相似度分别为85.1%和92.7%,ORF含一个硒代半胱氨酸(Sec)密码子TGA,定点突变为半胱氨酸(Cys)的TGC后,经载体pET30转入大肠杆菌BL21(DE3),0.4 mmol/L IPTG诱导表达3 h获得融合表达产物;该产物在Western blot检测中与人Sep15 Sec下游肽段的商品化多抗产生特异性免疫印迹。猪 Sep15 被首次成功克隆并鉴定,其Cys突变体的原核表达产物与人Sep15 C-端抗体存在交叉免疫反应。     

水稻生长素结合蛋白ABP1的原核表达及纯化

生长素结合蛋白能够与生长素特异性结合,因而有可能直接被用作生长素免疫分析和生物传感测定中的高特异性、高亲和力识别分子.本研究通过RT-PCR获得水稻生长素结合蛋白1(ABP1)cDNA,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,成功构建pET-32a-ABP1 重组表达载体.经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性...     

鸡传染性支气管炎病毒纤突蛋白的目的基因点突变对其免疫原性的影响

反转录聚合酶链反应扩增鸡传染性支气管炎病毒中国流行株的主要免疫原纤突蛋白Ｓ１基因,将其插入载体ｐＵＣ１８的ＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ位点,在大肠杆菌中实现目的的基因的分子克隆。经克隆化Ｓ１基因的限制性酶切片多段多态性分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交之后,双脱氧链终止法测定其５‘端高变区核苷酸序列,并以此与ＧｅｎｅＢａｎｋ中的参考毒株Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ４１相应序列作比较,分析其同源性。     

水稻OsMY1和OsRacD基因互作的分子鉴定

OsRacD是光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换信号通路中的重要分子开关,通过酵母双杂交筛选,从水稻幼穗中分离到一种与OsRacD 互作的新的肌球蛋白重链编码基因的cDNA片段,命名为OsMY1。本文在酵母双杂交体系鉴定的基础上,构建了OsMY1和OsRacD的原核表达载体,表达和纯化了融合蛋白GST-OsMY1 和His6-OsRacD, 通过pull down实验进一步确认了上述互作关系。本研究提示OsMY1和OsRacD可能在功能上相关,为深入研究二者在水稻生理功能上的联系提供了重要线索和依据。     

Molecular Docking and Site-directed Mutagenesis of a Bacillus thuringiensis Chitinase to Improve Chitinolytic,Synergistic Lepidopteran-larvicidal and Nematicidal Activities

Bacterial chitinases are useful in the biocontrol of agriculturally important pests and fungal pathogens. However, the utility of naturally occurring bacterial chitinases is often limited by their low enzyme activity. In this study, we constructed mutants of a Bacillus thuringiensis chitinase with enhanced activity based on homology modeling, molecular docking, and the site-directed mutagenesis of target residues to modify spatial positions, steric hindrances, or hydrophilicity/hydrophobicity. We first identified a gene from B. thuringiensis YBT-9602 that encodes a chitinase (Chi9602) belonging to glycosyl hydrolase family 18 with conserved substrate-binding and substrate-catalytic motifs. We constructed a structural model of a truncated version of Chi9602 (Chi9602_35-459) containing the substrate-binding domain using the homologous 1ITX protein of Bacillus circulans as the template. We performed molecular docking analysis of Chi9602_35-459 using di-N-acetyl-D-glucosamine as the ligand. We then selected 10 residues of interest from the docking area for the site-directed mutagenesis experiments and expression in Escherichia coli. Assays of the chitinolytic activity of the purified chitinases revealed that the three mutants exhibited increased chitinolytic activity. The ChiW50A mutant exhibited a greater than 60 % increase in chitinolytic activity, with similar pH, temperature and metal ion requirements, compared to wild-type Chi9602. Furthermore, ChiW50A exhibited pest-controlling activity and antifungal activity. Remarkable synergistic effects of this mutant with B. thuringiensis spore-crystal preparations against Helicoverpa armigera and Caenorhabditis elegans larvae and obvious activity against several plant-pathogenic fungi were observed.     

枯草蛋白酶E的定点突变及其对酶性质的影响

用定点突变的方法研究S221C/P225A,N118S/S221C/P225A,D60N/S221C/P225A和Q103R/S221C/P225A突变对蛋白酶活性,酯酶活性与蛋白酶活性之比的影响。结果表明：S221C/P225A突变使蛋白酶活性比枯草蛋白酶E低73000多倍,酯酶活性与蛋白酶活性之比是Subtiligase的3倍;N118S/S221C/P225A突变使蛋白酶活性和酯酶活性分别比S221C/P225A突变下降3.6倍和15倍,酯酶与蛋白酶活性之比下降4倍,同时增加变体酶的热稳定性;D60N/N118S/S221C/P225A突变使蛋白酶活性比N118S/S221C/P225A突变体下降15倍,但对酯酶活性几乎没有影响,酯酶与蛋白酶活性之比增加14倍,分别是S221C/P225A突变体和Subtiligase的3.3倍和10.3倍;但是,Q103R/N118S/S221C/P225A突变使蛋白酶活性比N118S/S221C/P225A突变体增加5倍,酯酶活性下降55倍,酯酶与蛋白酶活性之比下降1000倍。     

Cloning and high-level production of a chitinase from <Emphasis Type="Italic">Chromobacterium</Emphasis> sp. and the role of conserved or nonconserved residues on its catalytic activity

A gene encoding an alkaline (pI of 8.67) chitinase was cloned and sequenced from Chromobacterium sp. strain C-61. The gene was composed of 1,611 nucleotides and encoded a signal sequence of 26 N-terminal amino acids and a mature protein of 510 amino acids. Two chitinases of 54 and 52 kDa from both recombinant Escherichia coli and C-61 were detected on SDS-PAGE. Maximum chitinase activity was obtained in the culture supernatant of recombinant E. coli when cultivated in TB medium for 6 days at 37°C and was about fourfold higher than that from C-61. Chi54 from the culture supernatants could be purified by a single step based on isoelectric point. The purified Chi54 had about twofold higher binding affinity to chitin than to cellulose. The chi54 encoded a protein that included a type 3 chitin-binding domain belonging to group A and a family 18 catalytic domain belonging to subfamily A. In the catalytic domain, mutation of perfectly conserved residues and highly conserved residues resulted in loss of nearly all activity, while mutation of nonconserved residues resulted in enzymes that retained activity. In this process, a mutant (T218S) was obtained that had about 133% of the activity of the wild type, based on comparison of K _cat values.     

重组白眉蝮蛇去整合素定点突变对其生物活性的影响

RGD为存在于许多糖蛋白配体中的氨基酸序列,对整合素具有识别作用.此序列也发现于许多蛇毒去整合素分子中.采用基因克隆技术从大连产白眉蝮蛇的毒腺中克隆出的去整合素adinbitor是含73个氨基酸残基的去整合素,分子中含有12个半胱氨酸和RGD模体.实验证明,adinbitor作为去整合素的新成员,具有典型的抗ADP诱导的人血小板聚集作用和抗肿瘤血管新生作用.为了将adinbitor的这2种功能分开,采用PCR基因定点突变的方法,将其cDNA序列中RGD模体改变成KGD.重组adinbitor(KGD)在E.coli BL21得到表达,并通过His&#8226;Bind亲和层析予以纯化.实验发现,adinbitor对ADP诱导的人血小板聚集具有明显抑制作用,其IC50=85 nmol/L,明显优于adinbitor(RGD) （IC50=150 nmol/L）.然而,与adinbitor(KGD)相比,adinbitor(KGD)则丧失了对血管生成的抑制作用.结果说明,adinbitor(KGD)可作为专一的抗人血小板聚集药具有潜在的开发前景.     

茶树紫黄素脱环氧化酶基因的体外定点突变及其突变体的表达和活性鉴定

经Swiss Prot蛋白质数据库中查询发现茶树紫黄素脱环氧化酶 (VDE)蛋白结构中含有lipocalin特征区 ,利用重叠延伸法把该特征区中最保守的Gly(GGG)和Trp(TGG)分别定点突变为Leu(TTG)和Tyr(TAG) .构建了表达载体pET 32a G→L和pET 32a W→Y ,在E .coliBL2 1trxB(DE3)进行了诱导表达 ,并对表达蛋白进行His Tag亲和纯化 .结果表明 ,表达蛋白的分子量和预计的相等 ,为 5 8 9kD ,表达量占菌体总蛋白的 4 5 % .体外酶促反应分析得出 ,G→L或W→Y突变都能导致茶树VDE生物活性大幅度降低 ,证明了lipocalin特征区是VDE的主要活性中心之一 .     

低钾胁迫对水稻(Oryza sativa L.)化感潜力变化的影响

研究以国际公认的化感水稻P1312777和非化感水稻Lemont为供体,稗草（Echinochloa cru-galli L.）为受体,采用稻／稗共培体系,研究低钾胁迫对水稻化感潜力变化的影响及其机制。受体稗草的形态指标分析结果表明,低钾胁迫促使化感水稻P1312777对共培稗草的根长、株高和干重的抑制率均升高,增幅远大于非化感水稻Lemont。受体稗草生理生化指标分析结果表明,低钾胁迫下化感与非化感水稻对受体稗草保护酶系（SOD、POD、CAT）及根系活力的抑制作用增强,但化感水稻P1312777比非化感水稻Lemont的抑制程度大,且达极显著差异。实时荧光定量PCR分析结果表明,低钾胁迫下,化感水稻P1312777根部与叶部中酚类代谢的关键酶——苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟化酶、羟化酶、O-甲基转移酶的基因均上调表达,而非化感水稻根部相应酶均下调表达,叶部除苯丙氨酸解氨酶上调,其余酶也下调表达。而萜类代谢途径关键酶——HMG—CoA还原酶、角鲨烯合酶、单萜烯环化酶、倍半萜烯环化酶、二萜烯环化酶的基因,在两种水稻根部中呈现出相同或相似的表达方式（上调或下调）,即HMG—CoA还原酶上调表达,角鲨烯合酶、单萜烯环化酶、倍半萜烯环化酶、二萜烯环化酶下调表达;而在水稻叶部,非化感水稻Lmont相应酶基因表达方式仍然不变,化感水稻P1312777除了角鲨烯合酶下调表达,其余4个酶均上调表达。水稻根系分泌物中酚类物质的HPLC分析结果表明,低钾胁迫下,化感水稻P1312777根系分泌物中,所检出的酚酸类物质总量是正常营养条件下的2．30倍,而非化感水稻Lemont则是正常营养条件下的0．91倍。综合分析认为低钾胁迫下,化感水稻P1312777抑草能力增强主要是由于酚类代谢途径关键酶基因表达上调,导致酚类代谢途径旺盛,分泌出更多的酚类物质,进而破坏受体稗草保护酶系统,抑制了稗草的正常生长。