地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)突变株的生化互补和力复霉素生物合成途径的研究——Ⅱ.力复霉素的生化互补图

用琼脂块转化的交叉互补方法以及液体共合成的初筛和复筛,将69株力复霉素产生菌,地中海诺卡氏菌的非活性突变株(rjf~-)分为五个类群,即类群Ⅰ至类群Ⅴ。根据供体菌与受体菌生化互补共合成力复霉素的特性,初步制出了力复霉素的生化互补图,为提取和研究力复霉素生物合成的中间产物,阐明力复霉素的生物合成途径打下了基础。     

红霉素链霉菌突变株的生化互补和红霉素生物合成途径的研究

红霉素链霉菌经不同诱变因素处理后,采用琼脂块法大量筛选得到26株无活性菌株,再用琼脂条共合成方法测定了这些无活性菌株351对互补菌株对,其中85对有共合成能力的生化互补菌株。根据供体菌与受体菌(或转化菌)生化互补共合成红霉素的特性,26株无活性菌株可分为4个类群:这4个类群液体培养共合成试验结果,有的互补对红霉素产量在1,500微克/毫升以上,这为提取和研究红霉素生物合成的中间产物提供了方便。根据固体和液体生化互补顺序,初步绘制了26株无活性突变株的红霉素生物合成途径。     

力复霉素生物合成中N标记化合物参人的研究

使用稳定同位素15N标记化合物示踪方法,研究力复霉素分子中氮原于代谢途径。结果证明：硝酸钾(K15NO3)加入到rifl突变株,在有机培养基发酵中能促进力复霉素的中间体A32的生物合成,而且15N标记也参入到A32分子中。应用以15N标记谷氨酰胺为前体,证明酰胺氮原子是rifl突变株产物A32分子中氮原子的供体。15N标记A32,不论在高产菌株,还是无活力突变株经共合成,都能参入到力复霉素分子中。通过上述实验,阐明力复霉素氮原子的参入途径为K15NO3→→15NH3→谷氨酰胺-CO15NH2→→HA32-15NH2→→→力复霉素-15NH。     

力复霉素生物合成中间体A-32的生物学特性与结构的研究

本文报道了地中海诺卡氏菌Nocardia mediterranei经诱变育种获得的两株无活力菌株(rifl、nf2),能经共合成产生力复霉素,即其中供体菌株r·fl,在发酵液中累积一个中间体A一32,能被另一个无活力菌株nf 2转化为力复霉素[1,2]。此中间体(A一32)经分离纯化,理化性质和生物活性研究以及lR、NMR、Ms的光谱测定,确证A一32结构为3一羟基5氨基苯甲酸(简称A一32),这与Kibby等[3]推测中间体C,N的化学结构是相同的物质,从而证明了化合物C,N是力复霉素的一个天然中间体．     

产生变活霉素的变株的分离与初步鉴别

对天然无抗菌活性的链霉菌1254菌株进行诱变．获导了二株有抗菌活性的变株。变株113产生的抗生素为一组新蒽环类化合物．有抗病毒活性,定名为变活霉素。变株2—6产生碱性永溶性物质。初步实验结果表明,原株1254及变株2-6均是胞壁类型1,为链霉菌属。变株113为胞壁类型Ⅳ,不含有枝菌酸。原株1254与变株113的阻断变株共合成的产物与变活霉素相局,以放线紫红素聚酮合成酶基因act1为探针与原株1254的总DNA进行Southern杂交为阳性。根据这二个实验的结果推断,在1254菌株中可能存在一条变活霉素的合成途径,但有的基因处于未表达状态,诱发突变使其被活化。     

芳香途径终产物和中间体对力复霉素SV生物合成的调节作用

本文报道了芳香化合物对力复霉素生物合成和芳香途径开始的DAHP合成酶活力的调节作用。首先,洗涤菌体实验结果指出,色氨酸对力复霉素sV合成有明显抑制,苯丙氨酸和酪氨酸本身作用不明显。其次,酶活力测定结果表明,色氨酸抑制力复霉素生物合成是由于它对DAHP合成酶的反馈抑制;同时,在无细胞抽出液中酪氨酸和苯丙氨酸对色氨酸抑制也显示了协同作用。此外,力复霉素芳香前体(C7N)的结构类似物对氨基苯甲酸和对羟基苯甲酸对抗生素合成也有影响,主要影响c,N的生物合成。     

产生妥布拉霉素的ER-16突变株的选育

以妥布拉霉素产生菌暗黑链霉菌AS 4.1098(410-Ⅱ)为出发菌株,经高温和亚硝基胍处理,获得6株无色突变株,对其中的W1028-M5用亚硝基胍及甲基磺酸乙酯继续处理,得到突变株E228,再经抗自身代谢终产物妥布拉霉素抗性株的选育,得到ER-16和ER-21等高产菌株。所产抗生素仅含两个组份,即氨甲酰妥布拉霉素和阿普拉霉素。不再含氨甲酰卡那霉素。测定的几项主要理化性质与出发菌株以及文献报道的数据完全一致。     

产生妥布拉霉素的ER—16突变株的选育

以妥布拉霉素产生菌暗黑链霉菌AS 4.1098(410-Ⅱ)为出发菌株,经高温和亚硝基胍处理,获得6株无色突变株,对其中的W1028-M5用亚硝基胍及甲基磺酸乙酯继续处理,得到突变株E228,再经抗自身代谢终产物妥布拉霉素抗性株的选育,得到ER-16和ER-21等高产菌株。所产抗生素仅含两个组份,即氨甲酰妥布拉霉素和阿普拉霉素。不再含氨甲酰卡那霉素。测定的几项主要理化性质与出发菌株以及文献报道的数据完全一致。     

基于基因组挖掘的农抗120活性成分制霉菌素和丰加霉素的发现和鉴定

【目的】分析刺孢吸水链霉菌北京变种(农抗120产生菌)基因组和次级代谢产物组分,研究并鉴定农抗120产生菌中未被发现的活性组分。【方法】利用antiSMASH在线分析农抗120产生菌Streptomyces hygrospinosusvar.beijingensis基因组信息,锁定可能的制霉菌素和丰加霉素生物合成基因簇。利用HPLC和LC-MS等分析方法对农抗120产生菌发酵产物进行分析,同时利用制霉菌素和丰加霉素标准品作为对照,以鉴定该菌株代谢组分中的次级代谢产物。此外,通过构建目标基因簇大片段缺失突变株,并对所得突变株发酵产物进行检测,以确定生物合成基因簇与目的代谢产物的对应关系。【结果】本研究综合利用基因组序列分析、基因缺失突变株构建以及代谢产物检测方法,鉴定了农抗120产生菌中制霉菌素和丰加霉素两种活性成分,并确定了负责这些化合物合成的基因簇。【结论】本研究所构建的多重基因簇失活突变株为挖掘刺孢吸水链霉菌北京变种更多的天然次级代谢产物奠定了基础。     

地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)合成力复霉素代谢调节的研究——Ⅰ.硝酸盐对地中海诺卡氏菌合成力复霉素SV的促进作用

本文报导了硝酸盐促进力复霉素生物合成现象的初步观察结果。加入硝酸钾0.8％,地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)NG 12—4合成力复霉素SV的产量可增加1.7倍。在发酵96小时之前加入硝酸盐均能促进力复霉素SV的合成,但产量的增加随加入时间的延迟而降低。硝酸钾在促进产量的同时,使菌体生长减少,看来硝酸盐对力复霉素SV的合成与菌体生长之间起着调节作用。 洗涤菌体试验指出,硝酸盐的加入诱导了力复霉素合成所需要的酶系,蛋白陈不能代替硝酸盐,进一步说明硝酸钾的作用并不是作为氮源利用。在蛋白质合成抑制剂氯霉素存在下,硝酸盐不再能促进力复霉素的合成,说明氯霉素抑制了硝酸盐所诱导的酶系的合成。 铵盐明显地抵消了硝酸盐对力复霉素合成的促进作用,可能是由于铵盐阻遏了硝酸还原酶的合成。 KNO~3~-菌体与-KNO~3~-菌体的形态有明显差别。两种菌体的脂肪含量也不相同。 KNO~3~-一菌体的脂肪含量为5.7％,而-KNO~3~-菌体则高达13.6％,看来硝酸盐在脂肪合成与力复霉素合成两条途径之间起着调节作用。     

泡盛曲霉抗FOA突变株的筛选与转化

根据泡盛曲霉SG1菌株分生孢子的紫外线致死曲线,选择死亡率为85%～90%的诱变时间诱变分生孢子,然后将其涂布于含FOA(5-flourooroticacid)和尿嘧啶核苷的基本培养基上,选择抗FOA的突变株。经过纯化和回复突变检测后,获得了5株需要尿嘧啶或尿嘧啶核苷才能在基本培养基上生长的稳定突变株。进一步分析鉴定结果表明,这些突变株的URA3基因发生了突变。Northern杂交及RTPCR方法证明这些突变株中URA3基因突变均发生在转录水平上。选择突变株SA5作为受体菌,用含来自黑曲霉的野生型URA3基因的质粒转化该受体菌,结果获得了稳定的转化子。Southern杂交证明野生型URA3基因取代了突变株的ura3基因。     

地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)合成力复霉素代谢调节的研究——Ⅱ、硝酸盐对地中海诺卡氏菌代谢途径的调节

地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)的硝酸还原酶是底物—诱导酶,和细菌一样以NADH为专一性电子供体,并可能在细胞膜上,但与细菌不同,对超声波不敏感。加入硝酸盐促使菌体的力复霉素合成能力提高的同时,诱导硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的合成,但需较长的诱导期。同时戊糖循环的G-6-P脱氢酶、6-P-G脱氢酶、莽草酸脱氢酶以及三羧酸循环的异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶亦相应提高。G-6-P脱氢酶和莽草酸脱氢酶活力的提高,可由莽草酸途径提供合成力复霉素的芳香环来源,三羧酸循环酶活力的提高看来是在脂肪合成与多聚酮(polyketide)合成之间起着调节作用,使菌体合成更多的力复霉素的环桥部份。至于硝酸盐如何引起这一系列酶活力的变化而使力复霉素的合成增加,尚有待进一步深入研究。     

一株新的力复霉素产生菌——力复霉素小单孢菌

本文报道了从桂林湖泥中分离得到的一株小单孢菌(实验室编号S-190)的形态、培养特征和生理生化特性的研究结果,发现与已知的相近种都不相同,是一个新种。鉴于它产建力复霉素s,定名为力复霉素小单孢菌(Micromonospora rifamycetican sp.)。     

无桔霉素红曲色素突变株FM5183对单谷氨酸钠(MSG)、组氨酸的代谢特性

经过复合诱变处理得到的产无桔霉素的红曲色素变异株,编号为FM5183,在摇瓶条件下分批深层培养,研究了菌株在碳源为葡萄糖条件下对单谷氨酸钠（MSG）,组氨酸的代谢特性,该菌株分别在含MSG和组氨酸情况下,对产生的中间产物苹果酸和乙醇的代谢特性进行了比较。结果表明：突变菌株FM5183产生的酒精量为2.5-2.7g/L,苹果酸浓度最大值为5.8g/L;另外,在含MSG和组氨酸的培养基上对产生的色素量进行测定,其色价分别为25.5和11.8,对试验所用的氮源等条件下,整个发酵过程未有桔霉素检出,突变菌株FM5183是一株较理想的无桔霉素红曲色素工业化生产菌株。     

硝酸盐对力复霉素SV和脂肪合成的调节作用

地中海诺卡氏菌菌体的脂肪分析指出十KNO3,菌体的中性脂比一KNO3菌体的含量低,但两种菌体的中性脂所含脂肪酸组分上无显著的差异。定量分析表明,在硝酸盐存在下力复霉紊sV产量的增加几乎相当于脂肪含量的减少。显然,在硝酸盐存在的情况下,用于合成脂肪的中间代谢物被用于力复霉素SV合成,从而使SV产量增高。     

转座子标签法突变呋喃丹降解菌CFDS-1

通过接合使供体大肠杆菌DH5α中的质粒pSC123上的转座子插入到受体菌CFDS-1基因组DNA中,以引起该菌株的基因插入突变。利用转座子上的卡那霉素抗性基因和呋喃丹降解过程中红色物质的产生与否初步筛选出6株突变株,分别命名为CFDS—M1～CFDS—M6。紫外扫描和气谱检测结果进一步证明这些突变子确实失去了对呋喃丹的降解能力。根据转座子的序列设计引物,以6株突变株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,并对PCR产物进行限制性酶切分析,结果表明这些突变子中呋喃丹降解基因的失活就是由于转座子的插入而导致的。     

梅岭霉素产生菌抗药性突变标志诱变筛选模型的初步研究

本文通过梅岭霉素 (Meilingmycin)产生菌南昌链霉菌NS 4 1 80菌株孢子对 6种抗生素敏感性测定 ,采用诱变剂EMS四种不同诱变剂量对菌株孢子进行诱变处理 ,诱变处理的孢子涂布在含致死浓度链霉素的高氏平板上。然后从抗药性突变标志菌株中进一步筛选梅岭霉素高产菌株。在 150 0多个抗药性突变株中通过初筛获得了比诱变出发菌株的产素能力提高 50 %以上菌株。通过诱变剂量分别与抗药性突变率和突变株产素产量的变势统计分析表明 ,菌株抗药性突变与产素突变密切相关 ,产素突变的EMS诱变剂量高于抗药性突变诱变剂量 ,在 0 .0 3mol/LEMS剂量作用下 ,菌株致死率为 99.4 3% ,抗药性突变率为 0 .0 4 4 0 % ,建立了梅岭霉素产生菌抗药性突变标志诱变推理性筛选模型。为南昌链霉菌高产菌种选育研究作了有益的尝试 ,并有助于其它链霉菌属的抗生素产生菌育种研究。     

转座子标签法突变呋喃丹降解菌CFDS-1*

通过接合使供体大肠杆菌DH5α中的质粒pSC123上的转座子插入到受体菌CFDS1基因组DNA中,以引起该菌株的基因插入突变。利用转座子上的卡那霉素抗性基因和呋喃丹降解过程中红色物质的产生与否初步筛选出6株突变株,分别命名为CFDSM1～CFDSM6。紫外扫描和气谱检测结果进一步证明这些突变子确实失去了对呋喃丹的降解能力。根据转座子的序列设计引物,以6株突变株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,并对PCR产物进行限制性酶切分析,结果表明这些突变子中呋喃丹降解基因的失活就是由于转座子的插入而导致的。     

卡西霉素生物合成基因簇中调控基因calR1的功能

【背景】卡西霉素(calcimycin)是重要的离子载体抗生素,其生物合成基因簇已从教酒链霉菌NRRL3882的基因组DNA中成功克隆,但基因簇内的部分生物合成基因及调控基因的功能有待研究。【目的】研究卡西霉素产生菌教酒链霉菌NRRL3882中编码TylR家族同源转录调控蛋白的calR1基因的功能。【方法】通过PCR-targeting的方法,构建calR1基因敲除突变株及回补菌株,对突变菌株及回补菌株进行发酵,通过HPLC分析其代谢产物。利用荧光定量PCR检测ΔcalR1突变菌株和野生菌株的生物合成基因转录水平。【结果】calR1基因敲除突变株丧失产生卡西霉素的能力,但仍有中间产物噻唑霉素的积累,回补菌株中卡西霉素的产量有一定程度的恢复。RT-qPCR结果表明,卡西霉素合成相关的一些重要基因calC、calG、calU3等基因的表达量明显改变。【结论】TylR家族转录调控基因calR1是卡西霉素生物合成的调控基因。     

MSX对光合细菌GOGAT缺失突变株(Nif~-)固氮酶的诱导

浑球红假单胞菌的谷氨酸合成酶突变株的培养物缺乏固氮活性,在加入谷氨酰胺合成酶抑制剂MSX后,固氮酶得以表达。MSX加入后对突变株的氮源多效缺陷无恢复作用,说明氮源多效缺陷与固氮酶不合成分属遗传和生理两种水平的改变。当野生型菌株的培养物中加入MSF后,固氮酶表达延迟,谷氨酰胺的加入加剧这一延迟效应。