天冬氨酸酶E.coli融合表达研究

以大肠杆菌基因组DNA为模板,设计引物扩增得到天冬氨酸酶基因,将其重组于胞内融合表达型T载体中,重组质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析表明,工程菌经IPTG诱导,表达大量表观分子量约75kD的融合蛋白。经试验,工程菌细胞具有较高的天冬氨酸酶活性,融合形式的酶最适温度37℃,最适pH8.5,融合伴侣DsbA的存在对酶活没有影响。     

茶树巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR法扩增出茶树中巯基蛋白酶抑制剂基因(Tea cystatin,TC)cDNA编码区序列,定向克隆到表达载体pET 32 a( )上,得到重组质粒pET-TC,在表达宿主菌BL21 trxB(DE3)中高效表达,产生分子量约为31.8 kD a的特异融合蛋白。实验表明:随着诱导时间的延长,表达的融合蛋白Trx-TC的产量逐渐增加,特异蛋白的表达量最高可占菌体总蛋白的35.4%;在15℃、25℃、30℃和37℃四个不同诱导温度下,均能诱导产生融合蛋白;IPTG终浓度在0.5 mm ol/L~5 mm ol/L范围内均能诱导产生融合蛋白,表达的产物主要以可溶性蛋白形式存在。另外,体外酶促反应表明表达的融合蛋白Trx-TC对木瓜蛋白酶有明显的抑制活性。     

何首乌中Ⅲ型聚酮合酶基因FmPKS2的原核表达及鉴定

目的：对传统中药何首乌中Ⅲ型聚酮合酶基因FmPKS2进行原核表达并鉴定重组蛋白酶活性,为研究该酶基因在何首乌有效成分代谢合成及其调控中的功能奠定基础。方法：根据何首乌FmPKS2（GenBank登录号：GQ984139）基因序列,通过PCR扩增其全长的编码区,克隆至原核表达载体PET-28a,构建重组质粒PET-FmPKS2,将其转化原核表达菌株E.coli BL21（DE3）,并用IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白可溶性,通过Ni-NTA亲和树脂纯化可溶性蛋白后以丙二酰-COA和香豆酰-COA为底物进行催化反应,TLC鉴定反应产物。结果：经过诱导,重组菌表达分子量为42KD左右的融合蛋白,其中可溶性重组蛋白最优表达条件为IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导时间6h,温度25℃。纯化后的可溶性重组蛋白催化丙二酰-COA和香豆酰-COA得到的产物经TLC鉴定为二苯乙烯类化合物白藜芦醇。结论：成功实现FmPKS2的原核表达且融合蛋白以可溶形式存在,催化反应证明FmPKS2融合蛋白具有二苯乙烯合酶的活性。     

海洋链霉菌Streptomyces olivaceus FXJ7.023来源多功能几丁质酶的克隆、表达及鉴定(英文)

碳水化合物水解酶家族在自然界碳素循环及农业废弃物中几丁质、纤维素等碳水化合物的生物质转化利用中发挥了重要作用。通过PCR技术从海洋链霉菌Streptomyces olivaceus strain FXJ 7.023的fosmid基因组文库中成功克隆得到1个全长885bp的编码295个氨基酸残基的包含1个19个氨基酸残基的N-末端信号肽的壳聚糖酶完全编码区。系统进化分析表明该基因编码蛋白与已报道的Streptomyces sp.SirexAA-E来源壳聚糖酶csnA同源性为71%,与Streptomyces coelicolor A3(2)来源的csn46A同源性为70%。将该编码区重组入原核表达质粒载体pET32a并转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)plysS,添加IPTG在18℃条件下振荡诱导该蛋白表达,Ni2+-NTA亲和纯化获得分子量为50.3 kDa融合表达蛋白TrxA-SoCsn。该融合重组蛋白在最适反应条件下对底物胶体壳聚糖和羧甲基纤维素的最大酶活分别为3.673U/mg和1.302U/mg,最适反应温度分别为37℃和50℃,最适反应pH分别为pH5.0和pH6.0。TrxA-SoCsn相关的研究结果表明该酶在农业废弃物生物质转化等方面具有一定的应用潜力。     

精氨酸脱亚胺酶在大肠杆菌中的分泌型表达

将变形假单胞菌的精氨酸脱亚胺酶(ADI)编码基因arc A克隆至具有阿拉伯糖启动子的分泌型表达载体pBAD/gⅢB中,经鉴定得到重组质粒pBAD-ADI。将重组质粒转化大肠杆菌TOP10F'后进行诱导表达,分别考察了不同诱导物L-arabinose浓度、诱导温度、诱导时间对重组蛋白表达的影响,最适诱导条件为L-arabinose浓度0.002%(w/v),25℃下诱导5 h,全细胞的酶活为68 mU/mL(指单位发酵液体积,下同)。采用Osmotic Shock法使ADI从胞周质释放出来,经检测分泌到胞周质的重组蛋白活性为53 mU/mL,细胞内的酶活为34 mU/mL。SDS-PAGE分析显示,重组蛋白大小约为46 kD。     

Pseudomonas putida S1海藻糖合成酶表达质粒的构建及诱导条件优化

采用PCR方法从Pseudomonas putida S1中克隆出编码海藻糖合成酶的基因treS,并与质粒pQE30T相连,构建了表达质粒pQE—TS2。将此重组质粒转化宿主菌E．coliM15进行诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶SDS—PAGE电泳结果表明,treS基因在大肠杆菌中获得了高效表达。通过对诱导温度、诱导剂浓度、加诱导剂时间和诱导时间的优化研究,在菌液生长至OD600值为0．6时,加入诱导剂IPTG至终浓度0．01mmol／L,20℃诱导20h,蛋白的表达量达到每克干细胞89mg的蛋白,粗酶液酶活达到19U／mL。     

Secretory expression of arginine deiminase in E.coli

将变形假单胞菌的精氨酸脱亚胺酶(ADI)编码基因arcA克隆至具有阿拉伯糖启动子的分泌型表达载体pBAD/gⅢ B中,经鉴定得到重组质粒pBAD-ADI.将重组质粒转化大肠杆菌TOP10F’后进行诱导表达,分别考察了不同诱导物L-arabinose浓度、诱导温度、诱导时间对重组蛋白表达的影响,最适诱导条件为L-arabinose浓度0.002％ (w/v),25℃下诱导5h,全细胞的酶活为68 mU/mL(指单位发酵液体积,下同).采用Osmotic Shock法使ADI从胞周质释放出来,经检测分泌到胞周质的重组蛋白活性为53 mU/mL,细胞内的酶活为34 mU/mL.SDS-PAGE分析显示,重组蛋白大小约为46 kD.     

中国林蛙细胞毒性核糖核酸酶的原核表达

目的:利用大肠杆菌以非包涵体的形式表达中国两栖动物林蛙的细胞毒性核糖核酸酶,探索原核表达系统表达细胞毒性核糖核酸酶的条件.方法:利用中国林蛙核糖核酸酶基因及表达质粒pFlag-CTS构建重组表达质粒,转导BL21后用IPTG诱导表达,观察不同诱导温度下细菌的生长情况.利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹方法进行重组蛋白的检测.结果:通过观察不同诱导温度下细菌的生长情况,发现利用较低温度可以降低宿主细胞对表达产物细胞毒性的敏感性,成功地得到了这种目的基因的表达产物.结论:低温(20℃)可以有效表达目的蛋白.     

纳豆激酶基因在大肠杆菌中的表达及活性分析

目的:构建纳豆激酶基因的表达载体,鉴定其在大肠杆菌中的表达及表达产物的生物活性鉴定.方法:以纳豆芽胞杆菌基因组为模板,PCR技术克隆出纳豆激酶基因的成熟肽序列,分别克隆进具有信号肽的pMAL-p2x及无信号肽pMAL-c2x质粒中,经酶切和测序鉴定其正确性,分别将重组质粒转化至大肠杆菌中表达.结果:成功构建的两组重组质粒在IPTG诱导下,均能分别在37℃及16℃条件下表达出可溶性的融合蛋白,SDS-PAGE胶检测证实重组质粒在大肠杆菌中可表达出相对分子量约76kDa的纳豆激酶蛋白.纤维蛋白平板实验证明两种融合蛋白均有活性,且有信号肽的融合蛋白的酶活较无信号肽的融合蛋白高.结果:成功构建了两组重组纳豆激酶基因的表达质粒,且该两组重组基因在大肠杆菌中可溶性表达并具有生物活性,因此为下一步研究表达产物纳豆激酶的功能、应用和生产奠定了基础.     

链霉菌zxy19木聚糖酶酶学性质及酶基因克隆

采用平板筛选法,从红树林放线菌中筛选到一株有较强木聚糖酶活的菌株zxy19,其16SrDNA序列与Streptomyces sampsonii的同源性仅为96%.该菌株木聚糖酶活为852.41 IU/mL,酶反应最适pH值为7,最适反应温度为60℃.用针对木聚糖酶基因保守结构域的一对简并引物扩增到该酶基因部分序列,进而通过反向PCR扩增到了完整的酶基因,对该基因序列分析结果表明此木聚糖酶基因属于糖基水解酶家族11的成员,酶蛋白氨基酸序列与已报道序列同源性最高为79%(Streptomyces lividans xylanase B).构建了该酶重组表达质粒pET-28a-xyl 696,经过IPTG诱导实现了该酶蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的异源表达,且通过镍柱纯化后的表达产物具有生物学活性.     

强化底物利用酶系表达,提升地衣芽孢杆菌生产碱性蛋白酶性能

地衣芽孢杆菌2709由于易于培养、GRAS状态和完善的蛋白质分泌能力,是已经投入工业生产碱性蛋白酶的菌株.为改善该菌株的发酵生产性能,提高菌体对培养基成分的利用和碱性蛋白酶产量,对菌株的胞外分泌酶系进行完善.利用同源重组机制,在基因组复制起始位点附近引入了来源于短小芽孢杆菌的木聚糖酶基因xynA和在复制起始位点中心对称...     

Cloning and over-expression of an alkaline protease from Bacillus licheniformis

The alkaline protease gene, apr, from Bacillus licheniformis 2709 was cloned into a Bacillus shuttle expression vector, pHL, to yield the recombinant plasmid pHL-apr. The pHL-apr was expressed in Bacillus subtilis WB600, yielding a high expression strain BW-016. The amount of alkaline protease produced in the recombinant increased by 65% relative to the original strain. SDS-PAGE analysis indicated a Mr of 30.5 kDa. The amino acid sequence deduced from the DNA sequence analysis revealed a 98% identity to that of Bacillus licheniformis 6816.     

Bacillus licheniformis6816碱性蛋白酶基因在E.coli中的克隆和表达

用PCR方法从地衣芽孢杆菌6816中扩增了碱性蛋白酶基因（apr),扩增的1.14kb的DNA片段插入到大肠杆菌载体pET-20b中,构建成重组分泌型表达载体pAPR1。pAPR1中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM109（DE3）中得到表达,SDS-PAGE分析显示融合表达产物的分子量为30kD,同核酸序列测定所推导的值相符,表达产物占细胞总蛋白的7.5%,重组菌的酶活比出发菌株提高了3.3倍,研究发现,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时存在前肽自动脱落的现象。     

地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶编码序列的PCR扩增、克隆及序列测定

在地衣芽孢杆菌NCIB 6816菌株碱性蛋白酶基因已知序列的基础上,通过设计合适的引物,利用PCR(Polymerase Chain Reaction)技术从地衣芽孢杆菌2709菌株的柒色体DNA中扩增了2709碱性蛋白酶的编码序列。对两个克隆的PCR片段的全序列分析结果显示,2709碱性蛋白酶的编码序列同相应的NCIB 6816序列相比有3％左右的碱基组成差异。由此推定的2709碱性蛋白酶的氨基酸序列肯定了2709碱性蛋白酶属典型的subtilisin Carlsberg类,同时还表明来源于不同地衣芽孢杆菌菌株的subtilisin Carlsberg存在着若干氨基酸组成上的差异。     

Eglin C与2709碱性蛋白酶相互作用分析及亲和纯化方法

Eglin C是来自水蛭中的一种小型热稳定蛋白质,属于马铃薯胰凝乳蛋白酶抑制剂家族,可以抑制弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、组织蛋白酶、α-lytic蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶等.然而,利用eglin C纯化蛋白酶,尚未见研究报道.本文将化学合成的编码eglin C及其突变体的基因序列,克隆到原核表达载体pQE30,在大肠杆菌...     

地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶基因的克隆、序列测定及其表达

以克隆的地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶编码序列的PCR扩增片段为探针。通过原位杂交从2709基因文库中筛选出两个含有完整的2709碱性蛋白酶基因的阳性克隆：Psci和Psc7。对Psc7中的插入片段构建若干亚克隆后测定了其全部DNA序列,结果显示该插入片段含2709碱性蛋白酶及其信号肽与导肽(Pro—peptide)在内的全部编码序列(1140碱基对)及长度分别为299和832碱基对的上、下游序列,该序列同M．Jacobs等克隆的地衣芽孢杆菌NcIB 6816的subtlisin Carlsberg基因序列显示了极高的同源性。通过枯草杆菌-大肠杆菌穿梭质粒Pbe2将克隆的2709碱性蛋白酶基因转入到蛋白酶缺陷型的枯草芽孢杆菌DB104中,结果表明2709碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中得到了明显的表达。     

An organic solvent-, detergent-, and thermo-stable alkaline protease from the mesophilic, organic solvent-tolerant Bacillus licheniformis 3C5

Bacillus licheniformis 3C5, isolated as mesophilic bacterium, exhibited tolerance towards a wide range of non-polar and polar organic solvents at 45 degrees C. It produced an extracellular organic solvent-stable protease with an apparent molecular mass of approximately 32 kDa. The inhibitory effect of PMSF and EDTA suggested it is likely to be an alkaline serine protease. The protease was active over abroad range of temperatures (45-70 degrees C) and pH (8-10) range with an optimum activity at pH 10 and 65 degrees C. It was comparatively stable in the presence ofa relatively high concentration (35% (v/v)) of organic solvents and various types of detergents even at a relatively high temperature (45 degrees C). The protease production by B. licheniformis 3C5 was growth-dependent. The optimization of carbon and nitrogen sources for cell growth and protease production revealed that yeast extract was an important medium component to support both cell growth and the protease production. The overall properties of the protease produced by B. licheniformis 3C5 suggested that this thermo-stable, solvent-stable, detergent-stable alkaline protease is a promising potential biocatalyst for industrial and environmental applications.     

Extracellular enzyme synthesis in a sporulation-deficient strain of Bacillus licheniformis.

A deletion of the spoIIAC gene of Bacillus licheniformis was prepared in vitro by using the splicing-by-overlap-extension technique. This gene was introduced into B. licheniformis on a temperature-sensitive plasmid, and following integration and excision from the chromosome, a precisely located deletion on the chromosomal gene was prepared. The mutated bacterium was totally asporogenous and formed abortively disporic cells characterized by asymmetric septa at the poles of the cells. Qualitative plate tests revealed that the bacterium synthesized normal levels of DNase, polygalacturonate lyase, protease, RNase, and xylanase, but the hydrolysis zones due to beta-1,3-glucanase and carboxymethyl cellulase activity were smaller in the mutant than in the parent strain. The synthesis of alkaline protease was the same in batch cultures of the mutant and the parent during prolonged incubation for 72 h, but the alpha-amylase yields were reduced by about 30% by the mutation.     

地衣芽孢杆菌D-1产碱性蛋白酶培养条件的优化

为了对产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌D-1的培养条件进行优化,利用10 L发酵罐,采用正交设计19(34)试验,对培养温度、pH值、搅拌转速、通气量4条件进行优化,得到地衣芽孢杆菌D-1发酵产碱性蛋白酶的最优培养条件为:培养温度37.0℃,pH值7.5,通气量4L/min,搅拌转速300r/min.利用最优条件组合进行验证...